前S1抗原在乙型肝炎诊断中的应用研究(2)
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1 材料与方法
1.1 标本来源 2008年9月至2009年11月来我院就诊的门诊及住院患者,同时做乙肝五项血清学标志物、前S1抗原、ALT及HBVDNA检测,共268例,其中男203例,女65例;年龄6~68岁,平均37岁。268例均排除其他病毒重叠感染和酒精、药物等其他原因引起的肝损害,均为HBV单纯感染。根据西安“全国病毒性肝炎学术会议修订的诊断标准[2],其中急性乙型肝炎(AH)72例;慢性乙型肝炎患者(CH)196例;其中轻度81例,中都60例,重度55例。
1.2 血标本采集 268例患者均在禁食12 h后,于次日清晨空腹采血。
抽取CH患者肘部静脉血15 ml于真空干燥无抗凝剂试管内,离心取上清夜,冰冻保存以备同一批次检测血清ALT、五项HBV血清标志物、Pre-S1和HBVDNA定量。AH患者在治疗1~2周、2~3周、5~10周时,分3次依上法各采10 ml静脉血作同样处理。
1.3 检测仪器 MUL-tiskanMK3酶标仪、Well-wash4k2洗板机(均为芬兰生产);7600PCR荧光扩增仪(广州);美国贝克曼公司的全自动生化分析仪。
1.4 试剂和方法 HBV五项血清标志物(HBSAg、HBSAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb)试剂盒均由上海科华生物有限公司提供,乙肝前S1(HBVPRe-S1)抗原检测试剂由上海复星长征医学科学公司提供;以上均采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测;肝功能用美国贝克曼原装试剂检测,赖氏法,正常值<40u/l;HBVDNA试剂由广州中山大学达安基因股份有限公司提供,采用荧光定量PCR法。均严格按说明书操作。
1.5 统计学处理 根据各样本Pre-S1与HBSAg的S/CO值,计算出各样本Pre-S1/HBsAg的相对比值,结果采x±s表示,成组t检验,阳性率采用χ2检验,检验水准均为α=0.05
2 结果
2.1 AH组在发病过程中,Pre-S1的动态观察见表1。
2.2 CH患者Pre-S1/HBsAg相对比值与HBVDNA结果分析见表2。
2.3 把196例CH患者分为HBeAg(-)、HBeAg(+)两组,Pre-S1/HBsAg相对比值在HBeAg(+)组为(0.486±0.2576),表明Pre-S1(+)率与HBSAg检出高度相关,高于HBeAg(-)组的(0.1942±0.2985),差异有统计学意义P<0.01;在HBeAg(-)者中,HBeAg(-)组Pre-S1/HBsAg相对比值为(0.2576±0.1045),也显著高于HBeAg(+)组的(0.1507±0.0752),(P<0.05)。表明HBeAg(-)时,仍具有较强的病毒复制,能力也可能与血清转换或变异导致HbeAg能检出有关。提示前S1抗原可作为HBV的指标。
2.4 根据Pre-S1/HBsAg的相对比值,将乙肝分为高、中、低三种水平的复制状态,HBV病毒高水平状态为:相对比值在0.5836~0.4035之间;中水平状态为:相对比值在0.3675~0.2576之间;低水平状态:相对比值在0.2259~0.0755之间。在CH患者不同肝脏炎症阶段,三种水平的复制状态均存在。AH组部分患者可能转化为中等水平复制的CH患者。
3 讨论
HBV基因组有4个开放读码柜,分别为S、C、P、和X区,其中编码病毒外壳蛋白的S区,分为前S1、前S2以及S区,分别编码包膜上的前S1、前S2和HBSAg[3],前S1抗原位于病毒颗粒的表面,具有高度的免疫原性,介导宿主的免疫应答。其是肝细胞特异的无延糖蛋白体,有高度活跃的细胞内吞饮功能,HBV可能从前S1去氨基酸21-47片段作为结合部位结合肝细胞[4],该片断相当保守,变异的病毒只要这一片段完好就具有传染性,所以前S1抗原是反映HBV复制,且易于检测的血清标志物[5,6]。
前S1蛋白在病毒感染、装配、复制和刺激抗体产生免疫反应等方面具有十分重要的作用。是抗体感染HBV最早出现,最早消失的血清标志物。在AH感染早期,ALT升高前即可测出,前S1抗原消失越早提示HBV清除预后越好。表1结果表明,在AH患者中,随着病程的演变,血清ALT、Pre-S1(+)率,Pre-S1/HBsAg相对比值的实验结果差异均具有统计学意义。Pre-S1/HBsAg相对比值随肝细胞损伤加重而升高。而在CH患者中Pre-S1/HBsAg相对比值的高低和肝脏炎症无关。因此Pre-S1可用于早期诊断HBV感染和病毒复制活跃的标志[1],Pre-S1/HBsAg相对比值的高低可作为AH治疗效果和判断预后的评价指标。
表2结果表明,196CH患者轻、中、重组间Pre-S1(+)率与HBeAg(+)率二者差异无统计学意义(P>0.05),且二者与肝脏炎症程度无关。提示Pre-S1可反映HBV的复制。而Pre-S1/HBsAg相对比值在HBeAg(+)组显著高于HBeAg(-)组,表明Pre-S1与HbeAg检出高度有关,说明Hbeg仍是反映乙肝患者传染性和病毒复制的有效指标之一。但在HBeAg(-)者中,HBeAg(-)组的Pre-S1/HBsAg相对比值也显著高于HBeAg(+)组,提示HBeAg(-)时病毒复制仍在继续,可能与病毒变异致HbeAg未能检出有关。以下情况常发生HBV变异:①急性感染慢性化过程中自然发生;②免疫应答;③疫苗接种;④接受抗病毒药物治疗等。PichoudC等[7]研究发现,经抗病毒治疗的部分CH患者中,HbeAg发生了血清转换,而用敏感的定量PCR法仍可检测到活跃的病毒复制。可见只检测五项乙肝标志物不能充分了解HBV复制情况,补充前S1抗原和HBVDNA的测定尤为重要,这样可弥补因HBV基因变异和其他原因造成的HbeAg检测假阴性对病情的错误判断。Pre-S1检测是弥补HbeAg检测的不足,评价CH患者病毒治疗中HBV复制情况的重要方法之一[8]。
Pre-S1/HbsAg相对比值水平的变化,可作为HBV的消除、抗病毒治疗及疾病预后的评价指标。在CH患者中,Pre-S1(+)率及Pre-S1/HBsAg相对比值高低与肝脏的炎症程度无关,一般认为是机体处于高效表达和机体免疫效应平衡状态。而Pre-S1高水平复制状态,与机体的产生免疫应答有关;中等水平的复制则可能形成免疫平衡;低水平复制是一种未能达到产生机体免疫的最小的刺激。另一方可能是建立了一种免疫作用超过复制作用的新的水平。李琴等[9]报道,在CH患者使用干扰素治疗有效的病例中,在HBVDNA转阴时,Pre-S1滴度下降或转阴,提示乙肝发病初期HBV感染复制水平大致相同。本实验中,HBV高、中、低复制水平在肝脏炎症不同的CH患者中均有表达,Pre-S1/HBsAg相对比值差异无统计学意义,与个体的免疫水平不同或抗病毒效应有关 ......
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