CD4+CD25+Treg细胞的分选\表型鉴定及Foxp3表达鉴定(2)
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研究认为IL-2是CD4+CD25+Treg发育和增殖的关键因子以及维持CD4+CD25+Treg细胞抑制性和反应性的关键因素[11]。Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞特异性的核转录因子,也是CD4+CD25-Treg细胞转变成CD4+CD25+Treg细胞的标志[8,12]。同时IL-2在维持CD4+CD25+Treg的Foxp3基因表达稳定和细胞的新陈代谢方面发挥了关键的作用[8]。
本实验使用免疫磁珠技术,从C57BL/6小鼠脾脏中分离出了CD4+CD25+Treg纯度高达90%;本实验也证实了CD4+CD25+Treg细胞约占外周CD4+T细胞的5%~10%,从107~2×107个小鼠脾脏CD4+T细胞中仅能够分选出106~1.2×106个CD4+CD25+Treg细胞这与以前的研究结果相符合[13]。本实验还发现分选从分离出的细胞中抽提出Foxp3的RNA,使用RT-PCR技术反转录出了Foxp3基因的cDNA凝胶电泳证实了是Foxp3基因cDNA。长度为1536 bp,测序发现其序列与Genebank上的Foxp3(054 039)序列具有同源性,证实了CD4+CD25+Treg中确实存在foxp3基因表达。与HoriS[14]等报道结果一致。本实验还发现分选出的CD4+CD25+Treg细胞在含有20 U/mlIL-2的1640培养液(含10%FBS)中可以维持其活性,但是细胞不发生增殖,增加IL-2达到1500 U/ml时细胞仍不增殖,这种原因仍不清楚,Shevach EM.[15]认为CD4+CD25+Treg细胞作为一种Treg细胞,在体外不具有自我扩增增殖的能力,只有在高剂量的IL-2和CD3+、CD28+持续刺激的情况下才具有有限扩增增殖的能力。本实验认为本研究中CD4+CD25+Treg细胞不发生增殖的原因有待于进一步研究。
本研究使用免疫磁珠方法分离出C57BL/6小鼠CD4+CD25+Treg细胞,并进行了Foxp3基因表达的鉴定,为进行CD4+CD25+Treg细胞和Foxp3基因功能检测提供了方法学上的可能。
图1 CD4+CD25+Treg细胞流式细胞仪检测图
A 阴性对照;B CD4+T细胞图;C CD4+CD25+Treg细胞图;B结果显示CD4+T细胞占细胞数量的98%;C结果显示CD4+CD25+Treg细胞占细胞总量的90%
图2 Total RNA 电泳结果
从左至右1.marker,2.0.5 μg总RNA上样,3.1 μg总RNA上样
图3 RT-PCR结果从左至右1.Marker,2.RT-PCR产物
参考文献
[1] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25+).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol,1995,155(3):1151-1164.
[2] Walker MR.Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25+-T cells.J.Clin.Invest,2003,112:1437-1443.
[3] Cederbom L,Hall H,Ivars F.CD4+CD25+Treg cells down-regulate co-stimulatory molecules on antigen-presenting cells.Eur J Immunol,2000,30(6):1538-1543.
[4] Raffaello Cortesini,Nicole Suciu-Foca.The concept of partial clinical tolerance transplant.Immunology,2004:101-104.
[5] Kaestner KH,Knoche l W,Martinez DE.Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors ......
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