手足口病肠道病毒检测中两种核酸提取方法的比较(1)
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[摘要] 目的 对手工核酸提取法和全自动核酸提取仪法在手足口肠道病毒RNA荧光定量PCR检测中提取效率、重复性、耗时和成本进行比较。 方法 手工法试剂盒和全自动核酸提取仪对样本进行核酸提取，采用实时荧光定量PCR进行评价。 结果 提取仪法阳性46例，试剂盒法阳性43例，二者无明显差异(P > 0.05)。提取仪法重复性高于试剂盒法(CV3.5%<5%)。核酸液终体积：提取仪法70 μL，试剂盒法50 μL。提取仪法耗时较短，成本较高；试剂盒法耗时较长，成本较低。 结论 两种方法结果无显著差异，均能满足临床需要，核酸提取仪法更具优势。
[关键词] 手足口病；病毒核酸提取；CT值
[中图分类号] R450 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)04-0111-02
手足口病是由肠道病毒引起的一种儿童传染病[1]，其病毒核酸提取多为手工法，操作步骤繁琐；全自动核酸提取仪极大简化了操作步骤。本文以手足口病患者为研究对象对这两种方法进行比较，为合理选择方法提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 样本来源
100份手足口肠道病毒检测标本均由杭州市第六人民医院提供，标本类型为粪便。
1.2 试剂及仪器
Viral Nucleic Acid Extraction Kit II 购自Geneaid公司(Geneaid 试剂盒)，全自动核酸提取仪NP968购自西安天隆科技有限公司(天隆NP968核酸提取仪)，天隆核酸提取试剂盒，上海辉睿生物科技手足口肠道病毒RNA检测试剂盒荧光PCR法，美国Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System，德国Eppendorf离心机5418R，美国Vortex Genie2旋涡混合器，海门其林贝尔LX-200迷你离心机，吉诺生物1×PBS缓冲液，德国Eppendorf Research plus 移液器，美国Axygen公司实验室耗材EP管、吸头、PCR反应管等。
1.3 实验方法
1.3.1 样本准备 挑取黄豆大小粪便标本于1.5 mL EP管中，加1 mL PBS缓冲液充分混匀后12 000 rpm离心5 min，取上清液提取核酸。
1.3.2 病毒核酸提取 ①Geneaid 试剂盒根据硅胶膜离心吸附柱纯化原理，按照说明书操作，取200 μL上述处理后样本加细胞裂解液裂解、离心粘柱、洗涤液洗涤、加RNase-free water洗脱等步骤后提取纯化核酸50 μL。②天隆NP968 核酸提取仪利用磁珠吸附原理，从病毒样本中提取手足口病毒RNA。按照说明书操作，试剂配制、加样(在96孔板的第1及第7排中分别加入30 μL Proteinase K、100 μL样品及4 μL Acryl Carrier)，运行自动化程序(预先根据说明书设定裂解、结合、洗涤、洗脱、弃磁珠的时间和反应体积及温度)，自动化程序结束后，将第6及第12排的洗脱液转移至干净EP管中。
1.3.3 荧光PCR法 上海辉睿生物科技手足口肠道病毒RNA检测试剂盒采用One-Step Real Time PCR及TaqMan荧光探针技术[2]，人肠道病毒基因序列的高度保守区域及CoxA16和EV71基因序列的高度保守区域设计引物及荧光探针，通过全自动荧光PCR仪对疑似肠道病毒感染患者标本中的肠道病毒及CoxA16和EV71 RNA进行扩增检测，从而实现对肠道病毒及CoxA16和EV71 RNA的定性检测。根据本试剂盒说明书步骤将两种不同方法提取的各100份待检样本核酸采用荧光PCR法进行检测。①试剂准备：按样本数n(样本数加阴、阳性对照)取CoxA16/EV71/EV-U反应液Ⅰn×7.5 μL、CoxA16/EV71/EV-U 反应液Ⅱn×4 μL、酶混合液 n×5 μL、RNase Free水 n×3.5 μL混于一EP管中，旋涡振荡器上混匀，按每管20 μL分装。②加样：在上述加好试剂的PCR反应管中分别加入阴、阳性对照与待测样本核酸模板各5 μL，盖紧管盖，瞬时低速离心。③PCR扩增检测：将待检PCR管按顺序置于ABI7500 PCR仪上，设定参数：逆转录反应50℃ 30 min，预变性95℃ 5 min，再进入循环(变性95℃ 10 s，退火、延伸及检测荧光55℃ 45 s)，共运行40个循环。④结果判定：根据CT值判定结果：CT值≥38或undet为阴性，CT值<35为阳性，35≤CT值<38为检测灰区。
1.3.4 提取效果比较 为能够直观地比较两种方法，以100份样本中的阳性率、阴性率、检测灰区及CT值，比较两种方法的提取效果。
1.3.5 重复性比较 取阳性标本中20份CT值较低的样本用两种方法再平行重复做2次，计算CT值的平均值，测算两种提取方法的变异系数。
1.3.6 其他性能考察 对两种方法的提取方式、操作耗时和成本进行比较分析。
2 结果
2.1 两种方法提取手足口肠道病毒核酸效果比较 ......
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