替加环素、多粘菌素和头孢哌酮舒巴坦对多重耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌活性的研究(2)
1.1 一般资料 收集2013年1月-2014年6月广东省第二中医院检验科微生物实验室，临床无菌操作收集的各种标本做一般致病菌培养加药敏试验培养出的细菌，经过菌株分纯培养、革兰染色为阴性的细菌，用VITEK2全自动细菌鉴定仪、ATB革兰氏阴性细菌鉴定及药敏卡做鉴定后的菌株50株。
1.2 抗生素类药敏纸片 替加环素(TGC)、批号：1352109、浓度15 UG；多粘菌素(PB)、批号：1326603、浓度：300 UNI；头孢哌酮舒巴坦(药物比例为1∶1)(SCF)、批号：1226100、浓度：105 UG；药敏纸片均来自英国OXOID公司。
1.3 试剂与仪器 MH水解酪蛋白营养平皿由广州迪景微生物公司生产、法国梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定仪、ATB细菌鉴定及药敏卡均由法国梅里埃公司生产、恒温细菌培养箱、CO2恒温培养箱。
1.4 质量控制菌株 为大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、绿脓杆菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606，由广东省临床检验中心提供质控菌株。
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1.5 药敏试验判断标准 药敏试验用K-B纸片扩散法，按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2007年的标准进行操作。多粘菌素药敏纸片的折点为敏感≥19 mm，耐药≤13 mm(参考CLSI2012非发酵菌质控标准)；参考张冀霞等[5]在中华检验医学杂志发表的研究替加环素药敏纸片的折点为敏感≥14 mm，耐药≤10 mm；头孢哌酮舒巴坦药敏纸片的折点为敏感≥21 mm，耐药≤15 mm，参考文献[7]头孢哌酮舒巴坦药敏纸片中的舒巴坦量对药敏结果的影响。
1.6 方法 将2013年1月-2014年6月收集后保存在-70 ℃冰箱的50株多重耐药鲍曼不动杆菌取出后，放在室温恒温，然后用无菌镊子夹起沾有多重耐药鲍曼不动杆菌的细菌保存珠，分别在血平板上分区划线，分纯转种，然后放入37 ℃恒温箱孵育18 h后，在平板上分离出单个菌落，用无菌接种环挑起纯培养的单个菌落，用3 mL无菌生理盐水调成菌悬液，用无菌生理盐水调零，用麦氏比浊仪比浊，将纯培养后的菌落调成0.5个麦氏浊度的菌悬液，相当于细菌浓度为相当于1.5×109/L，然后用无菌棉签，蘸取少量该菌悬液，在MH营养平板上密涂，最后在该MH平板上相隔一定距离，用无菌镊子夹起药敏纸片，贴上替加环素、多粘菌素、头孢哌酮舒巴坦药敏纸片在相应位置。按上述方法操作，直至做完50株细菌为止，并按照不同药物分成3个组，分别为替加环素组、多粘菌素B组、头孢哌酮舒巴坦组，每组有50株细菌，然后放置37 ℃恒温箱孵育18 h后，次日，取出MH培养平板，用专用游码尺测量各个药敏纸片的抑菌圈直径大小，将各个数值记录在相应表格上，根据上述替加环素药敏纸片的折点为敏感≥14 mm，耐药≤10 mm；头孢哌酮舒巴坦药敏纸片的折点为敏感≥21 mm，耐药≤15 mm，多粘菌素B药敏纸片的折点为敏感≥19 mm，耐药≤13 mm的标准判断出各个菌株的药敏情况[8]。
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2 结果
将上述培养18 h后药敏试验的MH营养平皿，放在生物安全柜内，经过准确测量后(测量用的游标尺的误差在1 mm内)，将测量结果登记在专用细菌药敏试验登记表上，然后再将上述测量结果录入电脑统计，由另外一人进行核对。用每组药物的上述药敏折点进行判断，将50株多重耐药鲍曼杆菌不动杆菌分为三类，分别为敏感、中介和耐药。以敏感≥14 mm，耐药≤10 mm为折点时替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌保持较高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三种药物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐药≤13 mm为折点时，多粘菌素B中介敏感性为67%，耐药性为33%，其敏感性仅次于替加环素，而敏感≥21 mm，耐药≤15 mm为折点时对头孢哌酮舒巴坦的敏感性为7%，中介敏感性为20%，耐药性为73%，其耐药性较高。
3 讨论
多重耐药鲍曼不动杆菌是指对三类或三类以上的抗生素耐药(如B内酰胺类、氨基糖苷类、碳氢酶稀类、喹诺酮类、四环素类等)的鲍曼不动杆菌。随着临床上抗生素广泛被使用，加上该细菌有多种耐药基因，导致多重耐药的鲍曼不动杆菌正在逐年上升，给临床上治疗该菌带来较大挑战[9]。研究资料表明多重耐药鲍曼不动杆菌感染检出率占鲍曼不动杆菌感染检出率中的17%，主要发生在机体抵抗力较弱的人群，如重症监护病房、长期卧床患者、肿瘤患者、糖尿病患者等，该类患者感染前均有长期住院的经历，大多数是下呼吸道感染为主[10]。据秦媛怡等[11]研究报道对384例鲍曼不动杆菌感染的病例进行分析，其主要分布在呼吸内科，再次是重症监护室、神经外科等。本研究指明该菌是从医院获得性感染源，且患者在感染前均使用过大剂量的抗生素，特别是对于用过的碳氢酶稀类、头孢菌素类及喹诺酮类药物的多重耐药鲍曼不动杆菌检出率较高。本院多重耐药鲍曼不动杆菌检测率2013年1月-2014年6月总检出593株，总检出率18.27%，其中多重耐药鲍曼不动杆菌占17%，以分布在痰液标本为主占71.3%，其次为中段尿7.2%、血液4.3%等。其临床科室分布特征为：主要分布在重症监护病房(48%)和呼吸科病房(18%)、针灸二区病房(11%)、心血管科病房(7%)、针灸一区病房(6%)、其他病区(12%)。根据徐一鸣等[12]回顾性分析了2008年-2012年鲍曼不动杆菌临床感染分布及耐药特征分析，鲍曼不动杆菌对12种临床常用抗菌药物的耐药率明显升高，其中对碳青酶烯类抗菌药物耐药率为逐年上升，对派拉西林、阿米卡星、庆大霉素、头孢菌素、等耐药率总体维持在70%～80%。本研究结果表明，以敏感≥14 mm，耐药≤10 mm为折点时替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌保持较高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三种药物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐药≤13 mm为折点时，多粘菌素B中度敏感性为67%，耐药性为33%，其敏感性仅次于替加环素，而敏感≥21 mm，耐药≤15 mm为折点时对头孢哌酮舒巴坦的敏感性为7%，中介敏感为20%，耐药性为73%，其耐药性较高。导致头孢哌酮舒巴坦舒巴坦耐药性上升的因素包括细菌自身的基因因素和外在抗生素的广泛使用，细菌自身的因素包括该菌有多种耐药基因，如ESBLS、金属酶、AMPc酶、氨基糖苷修饰酶等，潘思争等[13]研究发现，鲍曼不动杆菌多种抗生素产生耐药基因导致临床上出现多重耐药鲍曼不动杆菌，甚至泛耐药鲍曼不动杆菌。多重耐药鲍曼不动杆菌导致的感染，治疗已经是目前临床上的一大难题，据Karageorgopoulos等[14]研究碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌已经在世界范围内扩散，引起了紧迫的公共卫生问题。因此，多重耐药鲍曼不动杆菌作为医院感染的主要致病菌，由于菌株基因型的差异，并有研究证明这些基因型的差异与细菌的多重耐药性有关系，因此在选用抗菌药物时应根据体外药敏结果指导用药，提高用药疗效，减少用药剂量，减少毒性反应，防止或延缓耐药基因的产生[15]。, http://www.100md.com(王康椿 李满元 余晓腾 刁艳丽)
1.2 抗生素类药敏纸片 替加环素(TGC)、批号：1352109、浓度15 UG；多粘菌素(PB)、批号：1326603、浓度：300 UNI；头孢哌酮舒巴坦(药物比例为1∶1)(SCF)、批号：1226100、浓度：105 UG；药敏纸片均来自英国OXOID公司。
1.3 试剂与仪器 MH水解酪蛋白营养平皿由广州迪景微生物公司生产、法国梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定仪、ATB细菌鉴定及药敏卡均由法国梅里埃公司生产、恒温细菌培养箱、CO2恒温培养箱。
1.4 质量控制菌株 为大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、绿脓杆菌ATCC27853、鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606，由广东省临床检验中心提供质控菌株。
, http://www.100md.com
1.5 药敏试验判断标准 药敏试验用K-B纸片扩散法，按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2007年的标准进行操作。多粘菌素药敏纸片的折点为敏感≥19 mm，耐药≤13 mm(参考CLSI2012非发酵菌质控标准)；参考张冀霞等[5]在中华检验医学杂志发表的研究替加环素药敏纸片的折点为敏感≥14 mm，耐药≤10 mm；头孢哌酮舒巴坦药敏纸片的折点为敏感≥21 mm，耐药≤15 mm，参考文献[7]头孢哌酮舒巴坦药敏纸片中的舒巴坦量对药敏结果的影响。
1.6 方法 将2013年1月-2014年6月收集后保存在-70 ℃冰箱的50株多重耐药鲍曼不动杆菌取出后，放在室温恒温，然后用无菌镊子夹起沾有多重耐药鲍曼不动杆菌的细菌保存珠，分别在血平板上分区划线，分纯转种，然后放入37 ℃恒温箱孵育18 h后，在平板上分离出单个菌落，用无菌接种环挑起纯培养的单个菌落，用3 mL无菌生理盐水调成菌悬液，用无菌生理盐水调零，用麦氏比浊仪比浊，将纯培养后的菌落调成0.5个麦氏浊度的菌悬液，相当于细菌浓度为相当于1.5×109/L，然后用无菌棉签，蘸取少量该菌悬液，在MH营养平板上密涂，最后在该MH平板上相隔一定距离，用无菌镊子夹起药敏纸片，贴上替加环素、多粘菌素、头孢哌酮舒巴坦药敏纸片在相应位置。按上述方法操作，直至做完50株细菌为止，并按照不同药物分成3个组，分别为替加环素组、多粘菌素B组、头孢哌酮舒巴坦组，每组有50株细菌，然后放置37 ℃恒温箱孵育18 h后，次日，取出MH培养平板，用专用游码尺测量各个药敏纸片的抑菌圈直径大小，将各个数值记录在相应表格上，根据上述替加环素药敏纸片的折点为敏感≥14 mm，耐药≤10 mm；头孢哌酮舒巴坦药敏纸片的折点为敏感≥21 mm，耐药≤15 mm，多粘菌素B药敏纸片的折点为敏感≥19 mm，耐药≤13 mm的标准判断出各个菌株的药敏情况[8]。
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2 结果
将上述培养18 h后药敏试验的MH营养平皿，放在生物安全柜内，经过准确测量后(测量用的游标尺的误差在1 mm内)，将测量结果登记在专用细菌药敏试验登记表上，然后再将上述测量结果录入电脑统计，由另外一人进行核对。用每组药物的上述药敏折点进行判断，将50株多重耐药鲍曼杆菌不动杆菌分为三类，分别为敏感、中介和耐药。以敏感≥14 mm，耐药≤10 mm为折点时替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌保持较高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三种药物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐药≤13 mm为折点时，多粘菌素B中介敏感性为67%，耐药性为33%，其敏感性仅次于替加环素，而敏感≥21 mm，耐药≤15 mm为折点时对头孢哌酮舒巴坦的敏感性为7%，中介敏感性为20%，耐药性为73%，其耐药性较高。
3 讨论
多重耐药鲍曼不动杆菌是指对三类或三类以上的抗生素耐药(如B内酰胺类、氨基糖苷类、碳氢酶稀类、喹诺酮类、四环素类等)的鲍曼不动杆菌。随着临床上抗生素广泛被使用，加上该细菌有多种耐药基因，导致多重耐药的鲍曼不动杆菌正在逐年上升，给临床上治疗该菌带来较大挑战[9]。研究资料表明多重耐药鲍曼不动杆菌感染检出率占鲍曼不动杆菌感染检出率中的17%，主要发生在机体抵抗力较弱的人群，如重症监护病房、长期卧床患者、肿瘤患者、糖尿病患者等，该类患者感染前均有长期住院的经历，大多数是下呼吸道感染为主[10]。据秦媛怡等[11]研究报道对384例鲍曼不动杆菌感染的病例进行分析，其主要分布在呼吸内科，再次是重症监护室、神经外科等。本研究指明该菌是从医院获得性感染源，且患者在感染前均使用过大剂量的抗生素，特别是对于用过的碳氢酶稀类、头孢菌素类及喹诺酮类药物的多重耐药鲍曼不动杆菌检出率较高。本院多重耐药鲍曼不动杆菌检测率2013年1月-2014年6月总检出593株，总检出率18.27%，其中多重耐药鲍曼不动杆菌占17%，以分布在痰液标本为主占71.3%，其次为中段尿7.2%、血液4.3%等。其临床科室分布特征为：主要分布在重症监护病房(48%)和呼吸科病房(18%)、针灸二区病房(11%)、心血管科病房(7%)、针灸一区病房(6%)、其他病区(12%)。根据徐一鸣等[12]回顾性分析了2008年-2012年鲍曼不动杆菌临床感染分布及耐药特征分析，鲍曼不动杆菌对12种临床常用抗菌药物的耐药率明显升高，其中对碳青酶烯类抗菌药物耐药率为逐年上升，对派拉西林、阿米卡星、庆大霉素、头孢菌素、等耐药率总体维持在70%～80%。本研究结果表明，以敏感≥14 mm，耐药≤10 mm为折点时替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌保持较高敏感性100%，中介敏感占33%，敏感占67%，在三种药物中敏感性最高；以敏感≥19 mm，耐药≤13 mm为折点时，多粘菌素B中度敏感性为67%，耐药性为33%，其敏感性仅次于替加环素，而敏感≥21 mm，耐药≤15 mm为折点时对头孢哌酮舒巴坦的敏感性为7%，中介敏感为20%，耐药性为73%，其耐药性较高。导致头孢哌酮舒巴坦舒巴坦耐药性上升的因素包括细菌自身的基因因素和外在抗生素的广泛使用，细菌自身的因素包括该菌有多种耐药基因，如ESBLS、金属酶、AMPc酶、氨基糖苷修饰酶等，潘思争等[13]研究发现，鲍曼不动杆菌多种抗生素产生耐药基因导致临床上出现多重耐药鲍曼不动杆菌，甚至泛耐药鲍曼不动杆菌。多重耐药鲍曼不动杆菌导致的感染，治疗已经是目前临床上的一大难题，据Karageorgopoulos等[14]研究碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌已经在世界范围内扩散，引起了紧迫的公共卫生问题。因此，多重耐药鲍曼不动杆菌作为医院感染的主要致病菌，由于菌株基因型的差异，并有研究证明这些基因型的差异与细菌的多重耐药性有关系，因此在选用抗菌药物时应根据体外药敏结果指导用药，提高用药疗效，减少用药剂量，减少毒性反应，防止或延缓耐药基因的产生[15]。, http://www.100md.com(王康椿 李满元 余晓腾 刁艳丽)