肉桂对糖尿病大鼠海马突触可塑性的影响(2)
1.2 实验动物处理方法 27只SD雄性大鼠，体重160～200 g，来自南阳医学高等专科学校实验动物中心。按随机数字表法将大鼠分为对照组、糖尿病组和肉桂组，每组9只。糖尿病组和肉桂组采用一次性腹腔注射STZ(65 mg/kg)，注射用STZ配于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，对照组注射同剂量的柠檬酸缓冲液。肉桂粉和生理盐水混合，肉桂组每天按照5 g/kg的剂量通过灌胃添加肉桂粉。28 d后开始断尾采血进行血糖测试，糖尿病组大鼠空腹血糖水平高于11 mmol/L，之后开始电生理实验，糖尿病组有2只大鼠在实验过程中死亡，死亡大鼠数据不列入统计。
1.3 海马CA1区细胞外电位记录 电生理测定的方法及参数同文献[10]，刺激电极置于Schaffer侧支，记录电极在海马CA1区，单刺激诱导海马CA1区群体锋电位(Population spike，PS)。强直刺激诱发LTP。再给予单刺激2 h以上。记录强直刺激前后CA1区电位波形，用PS幅度作为评测指标，PS增幅=(强直刺激后PS幅度/强直刺激前PS幅度)×100%。
, 百拇医药
1.4 westernblot蛋白印迹检测 在电生理测定之后处死动物，取海马组织在裂解液中冰上裂解，离心机离心10 min(12 000 g，4 ℃)，取上清液，通过BCA试剂盒进行蛋白定量测试，使单位样品蛋白总量保持一致，5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳，然后转至硝酸纤维素膜上，于含5%牛血清蛋白(BSA)TBS-T溶液中室温封闭2 h，含NR2B或GAPDH的抗体的TBS-T溶液(1∶1000)4 ℃孵化过夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min，碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗兔抗体中室温孵化1 h，重复洗膜3次，氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride，NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP)显色液显色，扫描的图像用Quantity one 1.0软件进行灰度值分析，NR2B相对蛋白水平用GAPDH做参照。
1.5 统计学处理 统计学分析使用SPSS 19.0软件，Excel软件用于作图。所得数据均用(x±s)表示，进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 海马脑电记录 单刺激Schaffer侧支纤维在25只大鼠海马CA1区均记录到幅度稳定的PS，平均幅度为(39.75±4.18)μV。对照组9只大鼠强直刺激后5 min开始观察到PS幅度增大至强直刺激前平均值的(195.46±3.87)%，最大增幅出现在强直刺激后90 min，为强直刺激前PS平均值的(257.15±3.64)%，这种突触传递效能的增强可维持2 h以上，即诱导出海马CA1区LTP。强直刺激前后PS幅值的差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组7只大鼠强直刺激后PS平均增幅为(122.97±2.11)%，明显低于对照组的平均增幅(235.03±3.84)%(P<0.05)，结果显示糖尿病大鼠海马CA1区的LTP明显抑制。肉桂组9只大鼠强直刺激后PS平均增幅为(188.83±3.02)%，明显高于糖尿病组(P<0.05)，强直刺激前后海马PS变化见图1。
2.2 海马NR2B的表达 研究肉桂改变糖尿病大鼠突触可塑性变化的机制，实验用westernblot的方法检测海马组织中NR2B的表达，如图2所示，糖尿病组海马NR2B的表达量明显下降(P<0.05)，平均相对表达量为对照组的60.54%。相对于糖尿病组，肉桂组NR2B的表达量明显升高(P<0.05)，为对照组的84.77%。
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3 讨论
糖尿病患者的学习记忆功能的下降受到越来越多的关注，以往大量研究表明学习记忆的关键部位在海马，而突触可塑性变化被认为是海马参与学习记忆的基本形式[11]。海马突触可塑性变化主要包括长时程增强和长时程抑制，自从发现LTP现象以来，由于其具有时程长和联合的特性，人们认为这种突触传递效能的增强是海马将短时记忆转化为长时记忆的生物学基础。研究表明，阻断海马LTP会导致空间学习记忆能力下降，而增强LTP具有促进记忆的功效[12]。晚时相LTP的产生需要脑内信号分子的介导，海马LTP现象大多与NMDA受体有关，NMDA受体由NR1、NR2和NR3亚基组成，在不同脑区亚基表达不同，成年动物海马CA1区表达主要为NR2B型亚基，NR2B基因敲除小鼠表现为突触可塑性和学习记忆功能的下降，而超表达NR2B基因则表现为突触可塑性和学习记忆能力的增强[13]。有报道称糖尿病大鼠的认知障碍与NMDA受体有关，应用NMDA受体激动剂可改善糖尿病大鼠的认知障碍[14]。本次实验中，糖尿病大鼠的海马CA1区LTP抑制的同时伴有脑内NR2B表达的减少，表明糖尿病导致的突触可塑性下降与其海马NR2B表达的抑制有关。
, 百拇医药
肉桂主要成分为桂皮醛(cinnamaldehyde)，占52.92%～61.20%，传统医学认为肉桂具有补火助阳、温里散寒、祛风散寒、温阳行气、温经通脉等功效，近来的研究表明肉桂具有抗氧化、抗糖尿病的作用。有研究称，肉桂提取物可使糖耐量保持正常并增强机体对胰岛素的敏感性，体内实验和体外实验均表明肉桂有直接的抗糖尿病的作用[15]。有研究报道肉桂能提高脑组织超氧化物歧化酶活性及神经生长因子、脑源性神经生长因子的表达，降低丙二醛含量，改善慢性脑缺血大鼠的认知能力[16]。本次实验中，肉桂明显改善糖尿病大鼠的LTP的抑制现象，提高海马突触可塑性，有效改善糖尿病大鼠学习记忆功能的下降，同时，应用肉桂治疗后，糖尿病大鼠海马NR2B的表达增多。这一系列结果表明肉桂改善糖尿病大鼠学习记忆和突触可塑性与其上调海马NR2B的表达有关。
参考文献, 百拇医药(杨坦)
1.3 海马CA1区细胞外电位记录 电生理测定的方法及参数同文献[10]，刺激电极置于Schaffer侧支，记录电极在海马CA1区，单刺激诱导海马CA1区群体锋电位(Population spike，PS)。强直刺激诱发LTP。再给予单刺激2 h以上。记录强直刺激前后CA1区电位波形，用PS幅度作为评测指标，PS增幅=(强直刺激后PS幅度/强直刺激前PS幅度)×100%。
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1.4 westernblot蛋白印迹检测 在电生理测定之后处死动物，取海马组织在裂解液中冰上裂解，离心机离心10 min(12 000 g，4 ℃)，取上清液，通过BCA试剂盒进行蛋白定量测试，使单位样品蛋白总量保持一致，5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳，然后转至硝酸纤维素膜上，于含5%牛血清蛋白(BSA)TBS-T溶液中室温封闭2 h，含NR2B或GAPDH的抗体的TBS-T溶液(1∶1000)4 ℃孵化过夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min，碱性磷酸酶(AP)标记的山羊抗兔抗体中室温孵化1 h，重复洗膜3次，氯化硝基四氮唑兰(Nitroblue tetrazolium chloride，NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP)显色液显色，扫描的图像用Quantity one 1.0软件进行灰度值分析，NR2B相对蛋白水平用GAPDH做参照。
1.5 统计学处理 统计学分析使用SPSS 19.0软件，Excel软件用于作图。所得数据均用(x±s)表示，进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 海马脑电记录 单刺激Schaffer侧支纤维在25只大鼠海马CA1区均记录到幅度稳定的PS，平均幅度为(39.75±4.18)μV。对照组9只大鼠强直刺激后5 min开始观察到PS幅度增大至强直刺激前平均值的(195.46±3.87)%，最大增幅出现在强直刺激后90 min，为强直刺激前PS平均值的(257.15±3.64)%，这种突触传递效能的增强可维持2 h以上，即诱导出海马CA1区LTP。强直刺激前后PS幅值的差异有统计学意义(P<0.05)。糖尿病组7只大鼠强直刺激后PS平均增幅为(122.97±2.11)%，明显低于对照组的平均增幅(235.03±3.84)%(P<0.05)，结果显示糖尿病大鼠海马CA1区的LTP明显抑制。肉桂组9只大鼠强直刺激后PS平均增幅为(188.83±3.02)%，明显高于糖尿病组(P<0.05)，强直刺激前后海马PS变化见图1。
2.2 海马NR2B的表达 研究肉桂改变糖尿病大鼠突触可塑性变化的机制，实验用westernblot的方法检测海马组织中NR2B的表达，如图2所示，糖尿病组海马NR2B的表达量明显下降(P<0.05)，平均相对表达量为对照组的60.54%。相对于糖尿病组，肉桂组NR2B的表达量明显升高(P<0.05)，为对照组的84.77%。
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3 讨论
糖尿病患者的学习记忆功能的下降受到越来越多的关注，以往大量研究表明学习记忆的关键部位在海马，而突触可塑性变化被认为是海马参与学习记忆的基本形式[11]。海马突触可塑性变化主要包括长时程增强和长时程抑制，自从发现LTP现象以来，由于其具有时程长和联合的特性，人们认为这种突触传递效能的增强是海马将短时记忆转化为长时记忆的生物学基础。研究表明，阻断海马LTP会导致空间学习记忆能力下降，而增强LTP具有促进记忆的功效[12]。晚时相LTP的产生需要脑内信号分子的介导，海马LTP现象大多与NMDA受体有关，NMDA受体由NR1、NR2和NR3亚基组成，在不同脑区亚基表达不同，成年动物海马CA1区表达主要为NR2B型亚基，NR2B基因敲除小鼠表现为突触可塑性和学习记忆功能的下降，而超表达NR2B基因则表现为突触可塑性和学习记忆能力的增强[13]。有报道称糖尿病大鼠的认知障碍与NMDA受体有关，应用NMDA受体激动剂可改善糖尿病大鼠的认知障碍[14]。本次实验中，糖尿病大鼠的海马CA1区LTP抑制的同时伴有脑内NR2B表达的减少，表明糖尿病导致的突触可塑性下降与其海马NR2B表达的抑制有关。
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肉桂主要成分为桂皮醛(cinnamaldehyde)，占52.92%～61.20%，传统医学认为肉桂具有补火助阳、温里散寒、祛风散寒、温阳行气、温经通脉等功效，近来的研究表明肉桂具有抗氧化、抗糖尿病的作用。有研究称，肉桂提取物可使糖耐量保持正常并增强机体对胰岛素的敏感性，体内实验和体外实验均表明肉桂有直接的抗糖尿病的作用[15]。有研究报道肉桂能提高脑组织超氧化物歧化酶活性及神经生长因子、脑源性神经生长因子的表达，降低丙二醛含量，改善慢性脑缺血大鼠的认知能力[16]。本次实验中，肉桂明显改善糖尿病大鼠的LTP的抑制现象，提高海马突触可塑性，有效改善糖尿病大鼠学习记忆功能的下降，同时，应用肉桂治疗后，糖尿病大鼠海马NR2B的表达增多。这一系列结果表明肉桂改善糖尿病大鼠学习记忆和突触可塑性与其上调海马NR2B的表达有关。
参考文献, 百拇医药(杨坦)