树突状细胞酸敏感离子通道蛋白基因表达研究(2)
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1.1.4仪器Eppendorf Mastercycler Personal聚合酶链式反应仪；HITACHI U-2000型可见光-紫外分光光度仪；北京六一仪器厂DYY-5型稳压稳流电泳仪；Heraeus Multifuge 3S-R型超速低温离心机；Hera cell 100二氧化碳培养箱；上海培清科技有限公司IS-300凝胶成像仪。
1.1.5DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司操作。
1.2方法
1.2.1DC2.4细胞的培养复苏冻存的DC2.4细胞系，用自配含10%FCS、10%的胎牛血清的1640培养基培养，细胞计数估算每一瓶内细胞数量在(5~7)×106。于第1、3、5、7天换液，第8天收获细胞。细胞观察：细胞大部分为不规则形状，长有突起，细胞间相互接触，甚至通过突起发生远距联系。长有突起是成熟DC细胞的形态学标志，说明将要检测的细胞已有足量成熟DC细胞。
1.2.2总RNA抽提急性分离小鼠海马作为阳性对照，用TRIZOL试剂分别提取出所培养的DC2.4细胞和小鼠海马的总RNA，RNA浓度稀释倍数为10倍，测定结果如表1所示。立即使用Pure Extreme试剂盒逆转录为总cDNA，其反应体系中总RNA均加入3 μl。
表1RNA浓度测定结果
OD260/OD280RNA浓度(μg/ml)
DC2.41.8941.7
小鼠海马组织1.8666.7
1.2.3PCR及电泳将逆转录所得的DC2.4细胞和海马的cDNA分别用ASIC引物进行PCR和电泳。ASIC引物为自行设计，引物及引物之间共140 bp，为人和鼠科、ASIC不同亚型保守序列的一部分。上下游引物均含有Dpn Ⅰ酶切位点，上游引物为TTG、CTG、TCA、CTT、GCC、AGT、TGT，下游引物为AAT、GCT、TTC、TGC、TCC、CAG、TTC。反应体系为：2×buffer 10 μl，cDNA 3 μl，引物(GAPDH) 1 μl，引物(ASICI 2 μl ......
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