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编号:115037
分子生物学与高血压、冠心病(述评·摘要
http://www.100md.com 2001年10月4日
     分子生物学与高血压、冠心病(述评·摘要)

    中国医学科学院

    中国协和医科大学

    卢圣栋

    分子生物学认为,所谓疾病,是指机体内信息的储存与传递的紊乱,以及基因与其周围环境关系的不协调。分子遗传学研究的深入,扩大了遗传性疾病的概念。当前认为,遗传性疾病约有6000种:传统观念上认定的遗传性疾病,是指按孟德尔法则遗传的疾病,一般为单基因缺陷的疾病,约占30%,其他则为多基因疾病,或复杂症状的疾病,约占70%。这类疾病不遵循孟德尔法则,是一种遗传倾向性与易感性,涉及多个基因,或多个基因调控网络;而且不同家族所罹患的同一种疾病所涉及的基因及其网络,可能相同也可能不同。这类疾病过去认为与基因不相关,现在证明不仅相关,而且同多个基因及其调控网络相关,如恶性肿瘤、心脑血管疾病、自身免疫病、内分泌疾病以及中枢神经系统疾病等。这类疾病都是当代临床医学手段难以根治的疾病。究其原因,盖在于这类疾病同基因有着千丝万缕的关系。这一方面的研究虽已取得辉煌的成就,但就彻底查明疾病与基因的关系而言,还仅仅是初见端倪。人类基因组研究的结果对于阐明复杂症状疾病与基因的关系将是一个巨大的贡献。但要彻底查明每一具体疾病与基因的全部关系,仍将是一个长期的艰苦探索的过程。
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    分子生物学发展到20世纪70年代,出现了DNA体外重组技术,基因工程研究与开发由此得以迅猛发展,出现了一批防治疾病的基因工程多肽药物,其中包括用于防治心血管疾病的多肽药物。基因工程的一个发展,便是基因治疗。它至今不过10年的历史。对心血管疾病的基因治疗研究处于起步阶段。促其成熟,尚需时日,但充满希望。

    一、基础理论研究:

    I发展概况

    心血管疾病的基础理论研究进入分子水平始于疾病与基因关系的研究。早期的研究多从临床诊断入手积累病理生理(中间遗传表现型)的流行病学资料。从这些资料的综合分析中推断出疾病与某一或某些基因可能存在的相关性,即推断出候选基因。继之运用分子生物学技术如多态性分析、基因探针、PCR,以及基因克隆与DNA序列分析,揭示缺陷基因,再经遗传连锁分析以确定候选基因与疾病的相关性。

    自展开人类基因组研究以来,对疾病、特别是多基因疾病与基因关系的研究悄然兴起,逐步形成热潮。同时,出现了一些新的技术方法。这一时期的研究强调了疾病的家族背景。以疾病家系的遗传流行病学调查为基础,从病理生理(中间遗传表现型)诊断,到家族遗传背景即遗传度的确认,再运用新的分子生物学技术以全面探究相关基因。这些方法主要有:1微卫星(Microsatelite)技术:该技术的核心是运用PCR技术分离微卫星片段。人体基因组普遍存在(CA)n.和(TC)n.重复序列,即微卫星。由于n不同,导致了多态性。这样应用PCR技术找出不同样品同一位点不同长度的微卫星片段,再经一些特殊的电泳技术或DNA序列分析找出突变位点,以了解疾病发生与基因突变的关系。
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    2.mRNA差异显示(DD:.mRNA.Differential.Display)技术:从mRNA.或总RNA入手,应用RT-PCR法逆转录出cDNA,找出不同样品之间表达有差异的cDNA片段,从而寻找出相关的基因。

    3. 基因敲除(Knock.Out)技术,将某个或某些基因予以敲除使之缺失,再观察病理生理即中间遗传表现型(症状)的改变,以了解基因与疾病的关系。

    运用任何一种上述方法找出突变基因之后,均须经遗传连锁分析,以确定突变与所研究的疾病的相关性。

    应用当代基因组研究方法,对家族群体进行大规模DNA测序之后,经由生物信息学分析(Bioinformatic.Analysis).可预见可能与疾病相关的基因,但仍须经由实验研究以确认这些基因与所研究疾病的相关性。

    II心血管疾病与基因突变:
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    A高脂血症和动脉硬化:

    早已证明血浆脂蛋白代谢障碍与心血管疾病关系密切。当前的研究主要在于阐明基因突变、基因调控同脂蛋白代谢障碍的关系。还有一些与脂蛋白代谢障碍无关的基因同心血管疾病的发生与发展有关。这里主要介绍脂蛋白代谢障碍的基因背景与心血管疾病的关系以及家族性高血压的遗传分析。

    在高脂血症和动脉粥样硬化(AS)的发展和形成过程中包含着众多基因的变化,为研究AS的成因,包括在脂代谢中的所有基因都应作为”候选基因”加以研究。在脂蛋白运转和代谢过程中下列多种蛋白质起着关键作用:

    第一是载脂蛋白类:其中包括载脂蛋白A-Ⅰ,A-Ⅱ,A-Ⅳ,B,C-Ⅰ,C-Ⅱ,C-Ⅲ.E.和apo.(a)。

    第二是脂蛋白酶类:其中包括脂蛋白脂肪酶(lipoprotein.lipase,LPL),肝脂酶(hepatic.lipase,HL),卵磷脂胆固醇酰基转换酶(LCAT)和胆固醇脂转移蛋白(CETP)。
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    第三是脂蛋白受体,包括低密度脂蛋白受体(LDL-R),乳糜微粒残核受体(remnant-R),和清道夫受体(scavenger-R)。

    上述各种蛋白质的基因都已经分离,其中大部分基因的核苷酸序列都进行了分析,并确定了它们在染色体的位置。目前多数实验室特别注意研究某些基因的变异引起的高脂血症和AS形成的关系,在未来数年内有可能找出某一基因的多个变异以及这些变异与疾病形成的相互关系。目前之所以不能给予脂代谢紊乱的原因以充分的解释,可能是由于更多的因素,如新的基因或新的变异还没有被发现。因此,只有在获得更多的遗传变异信息时,例如血管壁细胞在遇有致AS的脂蛋白时发生什么反应?这些反应又受哪些因子控制等等?才能比较全面地了解AS敏感性的遗传基础。根据现有的研究资料,可以把群体中经常发生的脂蛋白紊乱分为四种类型。

    (1)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高:LDL-C水平升高与.apoB,apoE及.LDL-R三种基因的变异有密切关系。apoB基因全长43kb,含有29个Exons和28个introns,编码apoB-100多肽链,该肽链包括27个氨基酸的信号肽和4536个氨基酸的成熟肽,人肝脏主要合成B-100,小肠合成B—8,与LDL-R的结合区域位于该蛋白的竣基末端。.apoB基因最普遍的变异是单碱基取代和小片段缺失,导致形成不完整的肽段。许多低β脂蛋白血症hyetalipoproteinemia)都是由于这种变异引起的。到目前为止,至少有21种.apoB基因变异与此症状有关,这些变异基因分别被称Trancated.apoB89,Trancated.apoB87,等等。
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    apoB基因的变异也可引起高胆固醇血症(hyperchholesterolemia)。apoB基因第26外显子中第10708位的G被A取代,使第3500位的谷酰胺变为精氨酸,这个氨基酸残基的取代大大减弱了LDL受体与apoB-100的亲和力,大约只相当于正常LDL受体结合力的5%,导致临床上出现高胆固醇血症。

    LDL-受体基因变异极大地影响LDL-C水平,该基因的变异是家族性高胆固醇血症的主要原因,已经鉴定的LDL-受体基因变异有40多种,其中约1/2是大片段缺失和重排。

    影响LDL-C水平的另一个遗传因素是apoE基因的变异。apoE有三个等位基因,E2与受体的结合活性只相当于E4和E3的1%~2%。因此群体研究指出,具有E4/3表型的个体LDL-C水平比具有E3/3表型的个体高10-20mg/dl,而具有E3/2表型的个体则低于E3/3表型个体约10-20mg/dl。家系分析结果表明,编码E2蛋白的等位基因与低胆固醇个体的特征有密切的关系,该等位基因可能就是科学家目前正在全力寻找的人体内具有降低胆固醇水平功能的重要基因。
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    (2)高密度脂蛋白胆固醇(HDL—C)降低与甘油三酯水平升高:编码apoA-I的基因位于一个多基因位点之中,其中还包括C-Ⅲ.和apoA-Ⅳ基因。这一位点中任一基因的变异都可能引起apoA-I的缺失;一般来讲,大片段缺失或重排可能出现极低的apoA—I和.HDL-C水平以及早发性.AS。aopA-I.基因的无意义突变也引起低HDL-C水平。最近发现LCAT缺乏是由于该基因突变引起的,其中一种疾病叫鱼眼病(fish-eye.disease,FED)也是由于LCAT多种形式变异的结果。如在LCAT基因第123位苏氨酸变为异亮氨酸的点突变就可引起鱼眼病。

    HDL-C水平的提高与两个酶蛋白有关联,即CETP和hepatic.lipase的缺乏。在CETP基因中第.14内含子的第.1个核苷酸的点突变破坏了基因转录过程中的正常剪切。因此带有这种变异的纯合子个体在其血浆中检查不到CETP,而杂合子个体血浆中大约只有正常个体CETP水平的60%。CETP的缺乏引起体内HDL-C升高也已经被证明,因此像低庵鞍籽⒁谎珻ETP缺乏可能是抗动脉硬化而发生的一种变异。最近,在两个高脂蛋白血症个体中检查到C一Ⅲ.结构变异,其血浆中C-Ⅲ.浓度较低,HDL颗粒大小呈非典型状。
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    (3)乳糜微粒残核和中间密度脂蛋白(IDL)胆固醇水平升高:一般情况下,含甘油三酯丰富的脂蛋白(乳糜微粒和VLDL)被LPL水解产生乳糜微粒残核和IDL,这些颗粒主要由肝细胞上识别apoE的受体清除,因此apoE的结构变异便影响了对乳糜微粒残核和IDL的清除,apoE2/2纯合子个体难于清除餐后血流中乳糜微粒残核。在50个具有E2/2表型的个体中可能有1个表现出空腹高脂血症和Ⅲ型高脂蛋白血症。

    (4)脂蛋白(a)增加是另一种紊乱的表现:Lp(a)是冠心病的独立危险因子。apo(a)靠一个二硫键与被修饰的.LDL.apoB-100相结合。它的结构与纤维蛋白原(Plasminogen。)极其相似。纤维蛋白原含.5个.Kringle区和一个蛋白酶区,而.apo(a)包含15~40个类似于.Kringle.Ⅳ.区域的结构,以及一个类似于Kringle.V的结构和一个变异的蛋白酶结构。从家族和双胞胎研究结果证明,Lp(a)在体内的水平是极具遗传性的。血浆中Lp(a)含量和apo(a)蛋白分子的大小以及Kringle Ⅳ 结构的数量呈副相关关系。它可能通过干扰LDL和纤维蛋白原代谢两个途径引起动脉粥样硬化。
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    为解释引起血浆中血脂水平变化的原因,还有很多的工作需要深入,还有一些控制着细胞内胆固醇代谢和吸收的新基因等待发现,一些新的基因位点可能需要利用反向遗传学技术才能加以揭示。高胆固醇和高甘油三酯血症以及AS是由于多个基因之间,基因与环境之间相互作用的结果。但是,就患者个体而言,一种基因的变异就可能使其患有致命的疾病。

    (5)当前的研究动向

    1)研究家系遗传学,寻找体内存在的控制胆固醇合成和降解的基因,除LDL-R基因以外,体内还可能存在控制胆固醇水平升高的基因,因为发现某些LDL-R基因有缺失的患者,血液中胆固醇水平与其年龄相匹配的个体相比并没有升高,因此,推测可能有某种未发现的基因起着这种作用。

    2)发现了.apoB.mRNA的编辑蛋白基因——人的.apoB.mRNA编辑蛋白基因位于十二号染色体.pl3.l~pl3.2的位置,基因全长28kb。实验证明,把该基因转入肝细胞中,可以使其产生aop.B-48蛋白,而不产生致AS的apoB-100蛋白。该基因的发现对于高胆固醇血症的基因治疗可能有着重要的应用价值。
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    3)关于癌基因与心血管疾病的关系。人们发现,癌基因与抑癌基因不仅仅同恶性肿瘤的发生有关,而且它们是控制细胞内细胞分裂与分化的基因族,是细胞增殖、分化、个体发育和再生所必须的”看家基因”(house.keeper.genes)。在不同的条件下,它们表现了不同的调控功能。因此逐步形成了新的概念,认为这类基因是细胞分裂与分化的调控基因,认为在各种病理改变过程中,凡涉及细胞分裂与分化的过程,均势必涉及癌基因与抑癌基因的表达及其异常调控。肿瘤和一些心血管疾病(如动脉粥样硬化等)都是以细胞增生为主要病理特征的,可以认为这些疾病的发生也必然同癌基因和抑癌基因的异常表达与调控有关。这一方面的研究,可看成是心血管疾病发生的机制研究的一个侧面。但就恶性肿瘤发生机制与心血管疾病发生机制而言,应当认为,二者之间的不同点远远大于相似点。

    B高血压病:

    高血压病是一种与多种因素有关的主要表现为体循环动脉血压高于正常(18.7/12kPa,140/90.mmHg)的常见病和多发病。高血压病中的20%~40%有家族遗传背景,弄清导致高血压的遗传因素可以帮助我们理解高血压的发病机理。
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    最简单的高血压是由单基因突变引起的孟德尔式高血压,如1996年由Sutherland等人首次发现的可用糖肾上腺皮质激素治疗的醛固酮过多症(glucocorticoid-remediable.aldosteronism,GRA)是由于染色体间发生了不等交换,GRA病人的.8号染色体上有一个多余的由11.-.-.羟化酶基因与醛固酮合成酶基因形成的嵌合基因,导致GRA和高血压的发生。另一种按照孟德尔方式遗传的高血压是Liddle综合征,病人的16号染色体上编码上皮Na+通道庋基的基因发生点突变,把一个Arg密码子变成了终止密码子,合成的蛋白因此减少了75个氨基酸。单基因改变对血压造成决定性影响的还有Gitelman综合征(Na+-CI--转运基因)、Bartter综合征(Na+-K+-2Cl--共转运子)等疾病。

    单基因突变引起的高血压早期诊断比较容易,可以及时采取措施抑制高血压的发展,但是这种高血压所占比例很小,绝大多数高血压的发生与发展牵涉到许多系统,如肾素一血管紧张素系统(renin-angiotensin.system,.RAS)、激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kininsystem,KKS)、一氧化氮-内皮一氧化氮合成酶系统(NO-eNOS system)、利钠多肽家族(natriuretic.peptides,.NPs)和内皮素(endothelin,ET)等。
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    (1)肾素-血管紧张素系统:RAS在原发性高血压病人和高血压动物模型(如.SHR)的高血压的发展和维持中起重要作用。如果用药物阻断RAS,可以产生降低血压的效应。RAS主要包括血管紧张素原(angiotensinogen)、肾素、血管紧张素I(AngI)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体(type ⅠangiotensinⅡ receptor,AT1-R)等。血管紧张素原是一种糖蛋白,在体内主要由肝脏合成,在肾素作用下水解生成 AngⅠ,这个反应是.RAS的限速步骤。在肺循环中的血管紧张素转换酶(angintensin-Converting enzyme,ACE)的作用下,AngⅠ转化成AngⅡ。AngⅡ与血管的AT1-R结合,使血管收缩,血压升高。AngⅡ与肾上腺的AT-R结合,刺激醛固酮的分泌增加,醛固酮结合肾小腺皮质激素受体,使得通过肾小管远端集合管的上皮Na+通道的钠重吸收加强,导致体内水与钠潴留。ACE还有降解缓激肽(bradykinin,BK)的作用,通过使BK失活致使血压升高。

    RAS是调节钠钾平衡、血容量和血压的重要环节,已经发现编码RAS的基因中,至少有两个突变与高血压有关,ACE基因的缺失突变和血管紧张素原T235变异体。插入额外的肾素基因的转基因动物,血压很高。与之相对应的方法是基因敲除(gene.knock.out),敲除血管紧张素原基因产生了低血压的转基因小鼠。
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    除了上面所说的外周循环系统的RAS外,心脏和脑内(胶质及神经元组织)也存在所有RAS成分,并能合成AngⅡ。AngⅡ可能直接或间接刺激心肌细胞蛋白合成和细胞生成,从而影响原发性高血压患者的左室顺应性,增强心肌收缩性。AngⅡ直接注射入脑内或脑室,能直接升压,并导致加压素、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic.hormone,ACTH)的释放及口渴反应。

    (2)激肽释放酶-激肽系统:与RAS相反,KKS具有血管扩张作用。肾脏组织激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶,将低分子量的激肽原(kininogen)水解成为有生物活性的激肽,又在氨肽酶(aminopeptidase)作用下转变成BK。BK与其特异性受体如人缓激肽B2受体(human bradykinin B2 receptor,HBKR)结合,产生一系列生物反应:血管舒张、平滑肌收缩和舒张、离子运输和葡萄糖代谢等。

    早在1934年,Elliot和NuzMum就发现原发性高血压病人尿中激肽释放酶水平低于正常值,自发性高血压大鼠(Spontaneously.hypertensive.rat,SHR)的尿和肾的激肽释放酶水平也明显偏低。临床实验发现口服猪胰激肽释放酶能短期降低高血压病人的血压。过量表达人组织激肽释放酶的转基因小鼠一生都维持低血压状态。
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    (3)一氧化氮-内皮一氧化氮合成酶系统:内皮衍生的NO是血管紧张性的调节子。最初叫做内皮衍生扩血管因子(endotheliurn-derived.relaxing.factor,EDRF)。在内皮细胞,人内皮一氧化氮合成酶(endothelial NO.synthase, eNOS)将L-.精氨酸分解成为.L-.瓜氨酸和NO。乙酸胆碱(acetyleholine, ACh)在免的、BK在豚鼠的心脏诱导NO的合成,使血管扩张。缺乏eNOS基因的小鼠表现为高血压症状。正常血压的Wistar-Kyoto大鼠(WKY)的肾皮质中的NOS活性与SHR的相差很大。急性注射L.-精氨酸导致正常人和原发性高血压病人的血压都迅速降低。缓慢注射.L.-精氨酸可以缓解.SHR的心脏肥大现象。

    (4)利钠多肽家族:1981年de.Bold等人率先发现心房提取物具有利钠利尿活性,分离出心钠素或心房利钠多肽(atrial.Natriuretic.peptide,ANP)。后来又从猪脑分离到脑钠素(Brain.of.B-Type.Natriuretic.Peptide,BNP)和C型利钠多肽(C-type.natriuretic.peptide,CNP)。.ANP、BNP、CNP共同构成NPs家族,近年来在心血管生理方面的研究十分活跃。
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    NPs都是以一个大分子的NPs前体原(propro-NP)的形式合成的。前体原进入内质网后它的信号肽被切除形成NPs前体,这是NPs在细胞内合成后、分泌前的主要贮存形式。人的NPs分泌时被蛋白酶分别水解成由28(ANP)、32(BNP)和22(CNP)个氨基酸组成、并由二个.Cys形成1个二硫键的环状活性分子。ANP主要由心房肌细胞合成和分泌,分布非常广泛。BNP的主要合成部位是心室。CNP基因似乎主要在中枢神经系统中表达。

    心房张力增加或血压升高是刺激ANP分泌的主要因素。ANP的作用主要包括:①增加肾血流、肾小球滤过率和尿钠、钾、钙排出;②对RAS的拮抗作用,抑制肾素和醛固酮的释放,扩张血管。BNP也有利尿利钠作用和RAS抑制效应,它的利钠和降压作用大于ANP。CNP作为利钠多肽的作用明显较ANP和BNP的弱,可能是由于血浆浓度较低。

    静脉注射ANP、BNP、CNP都能产生明显的利钠利尿作用和降低血压效应。带有Transthyretin.TTR)启动子的小鼠ANP基因的转基因小鼠,可在肝脏中高水平、持续表达ANP,与非转基因小鼠相比,血压降低20~30mmHg。BNP转基因小鼠的BNP基因也在肝中定位高水平表达,降低血压约20mmHg。ANP基因敲除小鼠基因组中缺少正常的ANP基因,明显表现为高血压。
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    (5)内皮素:自从1980年发现EDRF即NO的扩张血管作用以来,越来越多的证据表明血管内皮是调节血管紧张的重要因子。1985年,Highsmith等人发现了一种内皮衍生的缩血管因子(endothelium-derived.constricting.factor)。两年后,Yanagisawa.等人纯化出这种因子,是一个21肽,命名为.ET。人基因组存在3个不同的ET基因,编码3种不同的肽,ET-l、ET-2和ET-3c正常人血中ET-l含量非常低,约为l.pg/ml,说明ET可能不是循环激素,而是局部激素。一些高血压如血管内皮瘤(.hemangioendothelioma)诱导的高血压是ET依赖性的。一部分原发性高血压患者的血浆ET-1水平与血压呈正相关。ET可能在高血压的发生中发挥作用。

    动物静脉注射ET产生持续的加压效应。同源重组产生的ET-l基因缺失的纯合子小鼠出生时死于呼吸系统衰竭。杂合子小鼠ET-l水平低于野生型小鼠,发展成为高血压,原因尚不清楚,可能是心肺中枢改变所致。
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    原发性高血压是遗传与环境因素交互作用的产物。诱发高血压的遗传因素除以上介绍的几种外,还有许多。例如高血压与脂类代谢异常密切相关。在Dahl盐敏感大鼠(Dahl salt - sensitive.rat,DS)和SHR中使用抗脂类血症药物,可以防止或延缓高血压的发生和发展。原发性高血压患者和啮齿类高血压动物模型(如.SHR)经常伴发胰岛素耐受(insulin.resistance)、高胰岛素血症(Hyperinsulinemia)和异常脂类血症(dyslindemia)。糖尿病患者的肝葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因的启动子上游第258个核苷酸由G突变成A,容易并发胰岛素耐受。Chiang等人用PCR限制性片段长度多态性方法检测到原发性高血压病人G - A的突变率显著高于正常人(P=0.001),等位基因为A的人患高血压的风险比等位基因为G的人高2.52倍。

    SHR和正常血压大鼠的比较研究提示血压的定量特性位点(quantitative trait locus or loci,QTL)可能存在于多条常染色体上,如染色体1,2,4,8,10.13,16.19和20。然而,不能确定到底是染色体的哪段区域导致自发性高血压的发生。St.Lezin等人发现SHR.1号染色体长臂靠近Sa基因和编码上皮钠通道的夂豌亚基(Scnnlb和.Scnnlg)的基因的区域存在一个血压QTL,此区域替换成正常大鼠的相应区域后,SHR的收缩压降低10~15mmHg,舒张压降低.6~10mmHg。这段区域与人的11、16号染色体的短臂和小鼠的7号染色体同源,在这些染色体上可能也存在类似的QTL。

    我们对藏族原发性高血压的起因进行了一些研究?, http://www.100md.com