新生物制品审批办法(二)
新生物制品审批办法
4.3
粗制抗体检测
无论是小鼠腹水法还是细胞培养法制备的单克隆抗体，都需要进行如下检定。
4.3.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
4.3.2
支原体检查 按1.4.4项进行。
4.3.3
鼠源病毒检查 按1.4.3项进行。
, 百拇医药 4.3.4 效价测定
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。合格的用于抗体纯化。
4.4 抗体纯化
可采用盐析法、分子筛层析、离子交换或辛酸硫酸铵沉淀等适宜的方法。
4.4.1
尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。
4.4.2
应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、病毒及用于生产腹水抗体的刺激物(如降植烷、液体石蜡)。
4.4.3 连续生产(至少3批)的各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。
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4.5 纯化后处理
4.5.1
灭活
必要时56℃水浴灭活30分钟，离心收集上清。
4.5.2
合并
不同亚批的合格制品合并后应在2~8℃放置一个月以上，去除部分不稳定蛋白。
4.5.3
除菌分装
将经灭活的单抗用O.227滤膜过滤，过滤后进行分装。
5.
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检定
5.1
半成品
5.1.1
活性检测
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。抗体活性应≥参比品。
5.1.2
纯度测定
5.1.2.1
电泳法
还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定抗体纯度。扫描后计算出免疫球蛋白含量，含量应达到95%以上，二聚体≤10%。
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5.1.2.
2 HPLC法
用离子交换柱层析法，纯度应≥95%。
5.1.3
多聚体测定 用FPLC或HPLC法，用适宜的分子筛层析，多聚体应≤10%。
5.1.4
蛋白质含量测定 用Lowry法或其他适宜的方法测定。
5.1.5
DNA含量测定
用DNA分子杂交法。提取待检制品中的DNA，用骨髓瘤细胞制备的DNA探针与待检样品进行杂交。以不同含量的骨髓瘤细胞DNA作为工作标准，每一剂量残余DNA含量不应超过100pg。
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5.1.6
交叉反应性测定
用免疫组织化学及细胞化学方法检查。应提供3批单抗与人体组织器官的交叉反应性材料。结果不应与人体组织器官发生交叉反应。如肿瘤相关抗原单抗，应进行各种肿瘤组织的交叉反应测定。
5.2
成品检定
5.2.1
物理检查
液体制剂应为接近无色微带乳光的澄清液体，不应含有异物、混浊或摇不散的沉淀。
5.2.2
化学检查
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5.2.2.1
pH值 电位法测定，pH值应为7.0土0.5。
5.2.2.2
蛋白质含量 用Lowry法测定，含量应在标示值的90~110%之内。
5.2.3
活性测定 按5.1.1项进行。
5.2.4
无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
5.2.5
安全试验
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5.2.5.1
豚鼠试验
用体重300~400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.5.2
小白鼠试验
用体重18~20g小白鼠10只，每只腹腔注射检品O.5m1，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.6
热原质试验
按照《生物制品热原质试验规程》进行。家兔注射剂量＝(人用剂量÷50)×20×家免体重(kg)。不应有致热作用。也可用鲎试剂法，1mg/m1蛋白浓度不应检测出有凝集活性。
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5.2.7
异常毒性试验
每批成品应进行异常毒性试验。腹腔注射5只体重17~22g小鼠和2只体重250~350g的豚鼠，每只小鼠注射1个人用剂量，但不超过1m1；每只豚鼠注射剂量不超过5m1。动物至少存活7天以上，应无任何异常中毒反应。
5.2.8水分测定
产品如为冻干制品，应进行残余水分测定，其含量应≤3%。
6.
经修饰的单克隆抗体
为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中的作用，常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其他物质偶联形成免疫结合物，或在同一段多肽链中包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白来获得。研究者除对前面提到的有关未偶联单克隆抗体(未修饰单克隆体)的要求外，还应提供下列内容：
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6.1免疫结合物的构建
应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料，包括：
6.1.1
描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素、药物、酶及细胞因子，包括：所有成分的来源、结构、制法、纯度及特征。
6.1.2
制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和整合剂。这些资料应该包括试剂来源、制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物制备中所用化学试剂毒性相关资料。
6.1.3
在确定成品的标准时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分的数量，并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的关系。
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6.1.4
用重组DNA技术制备的制品(如来源于转染细胞系或微生物培养基，嵌合的、易形的，互补决定区[CDN]接合的及单链Fv抗体，以及重组免疫结合物)应提供构建和制备过程的全部资料。重组免疫结合物的稳定性应认真研究。因聚合物形成构形改变或变性而减弱了特异免疫反应性(如通过重组Fvs形成"双抗")可能导致药代动力学的改变和/或与非靶组织结合。
6.2
免疫结合物的纯度
6.2.1
应采取特殊措施保证抗体尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因这些污染物质在构建免疫结合物过程中，能与核素、毒素或药物发生反应。
6.2.2
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应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量。活性中间体应被灭活或去除。
6.3
免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定件
毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。
6.3.1
应采用适当的方法评估偶联前后的免疫反应胜。
6.3.2
免疫结合物非免疫球蛋白成份的活性应在适当的时候用效力试验来进行评估(例如，毒素、细胞因子或酶，用于造影的放射性免疫结合物除外)。
6.3.3
, 百拇医药 免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。
6.3.4
应通过在合并的人血清中37℃无菌条件下孵育，来检测免疫结合物在体外的稳定性。假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性，血浆可以用来替代血清。经过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品稳定性的条件及所用阴、阳对照。
6.4
与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题
放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。
6.4.1
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放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含连续3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品未改变免疫特异性、无菌、无热原质。放射性标记试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标记及使用试剂的同一组人员进行。
6.4.2
制备免疫结合物时应使用放射性药品及同位素并应提供其无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信函。
6.4.3
在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。
6.4.4
应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。
6.4.5
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适当的时候，应检测免疫结合物形成胶体的情况，并对其进行限定。
7.
产品稳定性及效期
产品稳定性应满足临床方案制定的要求。加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用，但不能代替实际的稳定性资料。
7.1
应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的物理化学完整性试验(如断裂或聚合)，效力试验，无菌试验，以及水份、pH和防腐剂的稳定性的测定。
7.2
确保制品生物活性的稳定性试验(例如定量体外效力试验)应包括厂内参比品。如可能，在试验的全过程中只使用一批试验抗原(如：纯化的抗原、细胞或组织)。应用定量效力试验使对生物没注进行有意义的比较成为可能。
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7.3
加速稳定性试验，即将制品贮存在温度高于常规贮存温度后的稳定性试验，可能有助于鉴定及建立稳定性指示试验。表示稳定
件的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析方法进行监测。
7.4
由稳定性试验的条件和结果确定产品的贮存条件及效期。
8.
临床前研究
由于生产条件或配方的改变可引起制品生物活性的明显变化。因此，建议在临床前研究中所使用的单抗应与临床试验中拟使用的单抗的生产工艺一致。
8.l
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MAB的交叉反应性试验
当相同或相关抗原决定簇在人的非预定的细胞或靶组织表达时，可观察到抗体与它们结合。非靶组织结合可能具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在I期临床试验前应经过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株亲本抗体进行逐个评估。
8.1.1
检测交叉反应性的体外试验
目前，用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测，应使用有效的并被确认的新技术(参照5.1.6)。
8.1.2
测定交叉反应性的体内试验
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当有适当模型时，单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合的体内试验。试验结果，特别是对具有溶细胞性的免疫结合物或具有ADCC活性的抗体，通常要求进行更广泛的临床前试验，包括用一种以上动物超剂量及重复剂量进行动物试验。设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位。
8.2
临床前药理学和毒性试验
8.2.1
设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中习能的毒性
评估在人体中潜在不良反应副作用的可能性和严重程度，并可能确定安全初始剂量和逐步提高剂量。有关单克隆抗体脑临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能。
8.2.2
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动物毒理学研究
当设计单克隆抗体的毒理学试验时，应考虑如下：
8.2.2.1
若被试样品为未偶联抗体，且无合适的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验明显阴性，则毒理学试验不是必须的。
8.2.2.2
动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。但是，对于所用的动物模型，不必要求对单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增加剂量或服药频率来弥补。应鉴定动物和人之间存在的抗原数。单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异。这可以更精确的推断人用的安全初始剂量，并评估安全范围。
8.2.2.3
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对单克隆抗体通常不要求进行常规诱变性的评估。
8.2.2.4
打算给育龄妇女反复或长期使用的产品，应该用适当的动物模型进行反复的深入的研究包括致畸试验。
8.2.3
药效学和动物药代动力学
8，2.3.1
当有动物模型时，则应尽可能证明药理学效应与剂量的依赖性，以及有效剂量的范围，可以更好地预测治疗指数。
药代动力学模型有助于阐明临床前活性及毒性，有助于推荐适当的剂量范围，进而可以改进临床试验的设计方案。这种研究有助于最终确定药代动力学及药效学。
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8.2.3.2
下列方面可以指导药代动力学及药效学试验动物种类的选择：
8.2.3.2.1
最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物模型来进行试验。对于仅抗人而未在动物模型中表达的人抗原或外源抗原(细菌、病毒等)的末偶联单克隆抗体，若不是为了论述生产问题，可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验。
8.2.3.2.2
当有抗原结合资料表明灵长类为最相关种属时，则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的。
8.2.3.2.3
应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的可能性进行严格评估。异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义。
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8.2.3.3
药代动力学参数应用一种或多种试验方法确定(如放射性标记的单克隆抗体应用ELlSA和测定放射性的方法来试验)。对于任何类型的免疫结合物，完整的结合物应与游离单克隆抗体和游离配基相区别(如毒素、药物或放射性核素)。
8.2.3.4
鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠内所得的重复剂量结果难以推至拟在人体内使用的重复剂量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"单克隆抗体将出现相应的问题，在这种情况下用啮齿类动物进行重复剂量的研究意义不大。
8.2.4
用免疫结合物进行的临床前体内研究
8.2.4.1
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应在体内试验免疫结合物的稳定性
8.2.4.1.1
应测定免疫结合物中每个组分在动物体内药代动力学和组织分布，并且与未偶联抗体的分布相比较。
8.2.4.1.2
不同组分的靶组织和他们可能引起的潜在毒性应被证实。
8.2.4.2
由于免疫结合物可能被降解或作用位点的活性不是单克隆抗体与靶抗原结合的结果，应对含有放射性核素、毒素或药物的免疫结合物进行动物毒性试验，尽管该种动物不存在靶抗原。根据免疫结合物组分的性质和其偶联的稳定性，对组分分别进行试验是有道理的。应充分描述每个组分的毒性情况、副反应的发生和严重程度。所得结果应与结合物稳定性试验密切相关。如可能，应用具有相关靶抗原或疾病模型动物体内进行免疫结合物试验，如果不存在靶抗原阳性的动物就在啮齿类动物体内进行。游离毒素或核素的毒性试验可在不同种类动物中进行。
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8.2.4.3
对于放射性核素的免疫结合物：
8.2.4.3.1
动物生物分布的资料可被用于对初始人用剂量的评估。
8.2.4.3.2
如可能，表达靶抗原的动物模型更有可能发现抗原"减少"或带有在生物分布和/或毒性方面表现意外抗原的组织。
8.2.4.3.3
异种移植模型可以组织定位和抗原非特异放射性免疫结合物分布问题，但对确定一般组织交叉反应范围没有帮助。
8.2.4.3.4
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应研究适宜的动物数量以用一个可接受的变异系数(通常小于20%)对放射性剂量进行评估。
8.2.4.3.5
对于使用放射性总量的新陈代谢和测定从早到晚清除期时间点的适当数值应有完整计算。
8.
2.4.3.6
放射性免疫结合物应通过在血清或血浆中孵育检测体外稳定性。应建立方法来评估游离表位，偶联单克隆抗体，标记的非单克隆抗体三种中每成分存在的放射性百分比。
说明：对局部外用和制备体外诊断试剂盒单克隆抗体要求参照上述相关部分执行，但其生产条件、小鼠清洁级别、抗体纯度和安全试验可根据实际需要降低或减少要求。
附录1
, 百拇医药
病毒检测
1.方法
(1)可用补体结合、免疫荧光、血凝抑制或ELISA检测鼠群血清，腹水单抗中的病毒，以确定其病毒污染情况。
(2)将样品(待检物或已破碎的来自种子批或培养的细胞)接种人二倍体细胞系培养物中，并观察其病变。
(3)应用鸡胚接种进行检查，可用9≤11天龄的鸡胚，将样品注射于10个鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊腔及卵黄囊中。接种后鸡胚至少5天后才能进行检查。并用脉鼠、鸡或其他禽类的红细胞检查尿囊中是否含有血凝素。
(4)将待检物肌肉接种出生24小时之内的小鼠至少10只，成年小鼠10只或豚鼠5只，并脑腔接种成年小鼠lO只。被试验的动物至少观察4周，动物应无发病，至少80%的动物健康存活。
, 百拇医药
2.病毒
组 病 毒
受影响动物
I 出血热病毒
大鼠，小鼠
淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
小鼠
3型呼肠弧病毒(Reo)
大鼠，小鼠
大鼠轮状病毒
大鼠
仙台病毒
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大鼠，小鼠
Ⅱ
脱脚病病毒
小鼠
KITHAM氏大鼠病毒(KRV)
大鼠
小鼠腺病毒(MAV)
小鼠
小鼠肺炎病毒(PVM)
小鼠
逆转录病毒
大鼠，小鼠
TOOLAN病毒(HI)
, 百拇医药
大鼠
3.
范围
样 品
上述方法 次 数
杂交瘤种子批
(1)(2)(3)(4) 每批检查
生产细胞库
(1)(2)(3)(4) 每批检查
鼠群
(1)
定期抽查
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制备腹水的细胞
(1)(2)(3)(4) 至少1次
体外制备收获前细胞
(1)(2)(3)(4) 至少1次
单抗腹水混合批
(1)(2) 连续3批后抽检
体外制备的单抗
(2) 连续3批后抽检
半成品
(1)(2)(3)(4) 每批检查
成品
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视腹水或鼠群情况定 每批检查
附录2
交叉反应试验
1.
人体组织器官
扁桃体、胸腺、淋巴结
骨髓、血细胞
肺、肝、肾、膀肮、脾、胃、肠
胰腺、腮腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体
脑、外周神经
卵巢、辜丸
皮肤
, 百拇医药
眼
2.
方法
免疫组织化学法及免疫细胞化学法。
附件五：传代细胞系生产生物制品规程
一、细胞系的历史及一般特性
1.
细胞系的历史
生物制品生产用任一细胞系均需得到国家药品监督管理局的认可，并应提供如下资料：
1.1
细胞系来源供者的年龄、性别、种属和健康状况描述。
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1.2
细胞传代培养方法、生长特征、世代数、用于生产的最高限制代数、所用培养基成分以及传代史等。
1.3
初步确认实验以及可能存在的所有外源因子检查结果。
2.
细胞的一般特性
细胞系的生长模式及形态学特征，细胞鉴定的特殊标志，遗传特征(如HLA，DNA指纹图谱)。
2.2
证明细胞能用于预定目的的资料。
2.3
, 百拇医药
对细胞系，等于或超过用于生产的传代水平(群体倍增或培养时间)的生物特征作出说明。
二、细胞库
1.
细胞库的建立
一旦选定某一细胞系作为产品的生物来源，应建立细胞库以确保在产品的持续生产期限内，充分供应质量均一的细胞及细胞的进一步鉴定，并减少细胞交叉污染及外源因子污染。用于生物制品生产的细胞库应得到国家药品监督管理局认可和注册。
1.1
主细胞库(MCB)
指由单一组织或细胞获得的一定量组成的均一细胞，装安瓿，保存于一100℃以下或液氮中。
, 百拇医药 1.2
生产细胞库(WCB)
是由1安瓿或2安瓿以上主细胞库细胞获得的，经次代培养扩增至生产者选定的合法的代次，将细胞合并，分装安瓿，一100℃以下或液氮保存。
2.细胞库的保管
主细胞库和生产用细胞库都应贮存在一100℃以下或液氮中，应详细记录安瓿的放置位置，识别标志，冻存日期及库存量。建议主细胞库和生产用细胞库分别设在生产设施中相距较远的两处或多处，以避免细胞系丢失。
3.
细胞库检定
3.1
外源因子检查
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3.1.1
细菌、真菌检查按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.1.2
支原体检查一般采用用培养法和DNA荧光染色法。也可采用间接免疫荧光法、探针杂交法或PCR法等，但必须有资料证明其特异性和敏感性。任何一种方法都需要设阴性和阳性对照。
3.1.3
病毒因子检查
3.1.3.1
同种细胞直接观察
取混合瓶细胞样品，接种培养瓶，长成单层后更换维持液，观察两周，镜检细胞，应保持正常形态特征。
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3.1.3.2
细胞培养检查
细胞培养的上清液混合样品至少接种下列三种细胞培养单层：
(1)
一种或两种细胞种类及组织类型与生产用细胞来源相同的单层培养物；
(2)
人二倍体细胞单层培养物；
(3)
人或猴肾细胞单层培养物。
用于检测的细胞样品应尽可能不稀释，应将上述至少107细胞和废弃的培养液分别接种到三种类型细胞上。
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接种的样品量应占维持液的20%以上，至少观察二周，在观察期末做吸附试验。
3.1.3.3
动物体和鸡胚试验
动物组别 要 求
数 量 接种途径 接种量* 观察天数 结果(m1/只)
乳鼠 24小时内 2窝≥l0只
脑内 0.0l 21
应健存
腹腔 0.1
成鼠 12~248 10
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脑内 0.03 21
应健存
腹腔 0.5
豚鼠 350~500g 5
腹腔 5.0 42
应健存，解剖
无结核病变
家兔 1.5~2.5Kg 5
皮内 0.l×10 21
无异常
皮下 9.0
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健存
鸡胚 9~11日龄 10
尿囊腔 0.2 3~4
尿液血凝试验* *
阴性
*
每只动物腹腔至少接种107细胞；脑内至少接种106细胞；鸡胚103细胞
*
*用脉鼠和鸡血球
如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。
如果细胞系来源为啮齿类动物，应用10只敏感的成年小白鼠，每只脑内接种106活细胞用以检测是否有淋巴脉络丛脑炎病毒污染。
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3.1.3.4
特殊外源病毒检测
(1)小白鼠、大白鼠及地鼠抗体产生试验检测啮齿类动物细胞系中存在的种特异性病毒，也可用杂交法、PCR法、单抗检测、电镜检测；
(2)人源的细胞系可用体外诊断试验检测病毒性病原，如EB病毒、巨细胞病毒(CMV)、乙型及丙型肝炎病毒(HBV、HCV)、爱滋病病毒(HIV)。常用方法有杂交法、PCR法、单抗检测及电镜检测；
(3)逆转录病毒检测可用电镜检查和逆转录酶(RT)测定。
3.2
细胞鉴别试验
可采用生化方法如同功酶分析、免疫学(如HLA分析)、细胞遗传学(如染色体标记试验)和遗传标记物(如DNA指纹图谱)等任何方法进行鉴别，证明无其他种细胞污染。
, 百拇医药
3.4
致肿瘤性检测
用于生产的传代细胞系应有致瘤性的资料，对于已经证实有致瘤性的啮齿类动物来源的传代细胞如BHK一21、cHo、c-127不要求做致瘤性试验，除非研究资料能够证明某一新的细胞系不具有致瘤性，否则应把此细胞看作有致瘤性。如果要鉴定某个细胞系是否有致瘤性，可以单用体内法或者单用体外法，也可以体内、体外两种方法联合使用。
3.4.l
体内检测
3.4.1.1
动物
(1)裸鼠；
(2)抗胸腺细胞(ATS)血清或球蛋白(ATG)抑制免疫的新生地鼠，小白鼠或大白鼠；
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(3)用健康小白鼠骨髓再建的胸腺切除并照射过的小白鼠。
3.4.1.2
方法
(1)用在生产代数范围内的被试验细胞接种至少10只动物，每只皮下或肌肉各注射107个细胞，以Hela、Hep一2细胞为阳性对照，以二倍体细胞(WI一38或RC一5)作阴性对照，阳性对照细胞接种量应比被试细胞少1个数量级。
(2)采用新生地鼠、小白鼠或大白鼠的试验体系时，应于动物出生的当天及2、7、14天皮下或肌肉注射O.1m1有效的ATS或ATG，使在出生当天接种阳性对照细胞的动物产生进行性肿瘤生长和转移。
(3)观察14天，检查有无肿瘤生长，并做详细记录，有结节或可疑病灶时，做病理检查。无结节生长时，半数继续观察1周，另一半数继续观察10周。每只动物应进行解剖，并详细检查。
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3.4.2
体外检测体外检测试验也可充分鉴定细胞的致肿瘤原性。
3.4.2.1
软琼脂集落形成试验。
3.4.2.2
接种器官培养后产生侵袭性细胞生长。
3.4.2.3
传代细胞系中DNA转化实验实验时应取处于生产用传代水平的传代细胞DNA，目的是确定是否能从传代细胞系中检出活化的致癌基因。
三、细胞培养物的生产和产品检定
1.
, 百拇医药
细胞培养基
1.1
细胞培养基组成和来源的详细资料。对诸如血清和胰蛋白酶这样的来源于动物的原材料，应来自具有适当监测系统的地区和没有发现牛海绵体脑病(BSE)的牛群体。
1.2
血清检测
1.2.1
细菌、真菌检测按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.2.2
支原体检测按二3.1.2项。
1.2.3
, 百拇医药 外源病毒检测
1.2.3.1
血清应检测牛腹泻病毒，样品接种BT细胞后，采用荧光抗体法检测，或细胞培养基上清接种动物后以酶标方法检测抗体。
1.2.3.2
其他动物血清应检测与该动物感染有关的病毒。
1.2.4
噬菌体检测利用噬菌斑法、增殖法检测可能污染的噬菌体。
1.2.5
尽可能减少繁殖细胞所需的血清量，成品中血清的残留量不得超过1：1000000(17g/m1)。
1.2.6
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禁止使用人血清，如使用人血白蛋白，应按《人血白蛋白的制造及检定规程》进行检定。
1.3
胰蛋白酶检测
1.3.1
细胞、真菌检测同二3.1.1项。
1.3.2
支原体检测同二3.1.2项。
1.3.3
病毒检测主要检测牛或猪的细小病毒。
1.4
其他
, 百拇医药
1.4.1
生产细胞中不得加青霉素或其他日一内酰胺类抗生素。
1.4.2
允许加最低量的其他抗生素，但制品中应避免存在任何抗生素。
2.
半成品、成品检测
2.1
细菌、真菌检测同二3.1.1项。
2.2
支原体检测同二3.1.2项。
2.3
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外源病毒检测
2.3.1
方法同二3.1.3项。
2.3.2
用特异探针可检测CMV。
2.3.3
若产品是病毒制品，当制品对检测造成干扰时，应增加一种以上外源病毒常规检查用细胞，观察有无细胞病变，并检测有无血吸附病毒。
2.4
残留DNA测定
用探针杂交法，检查制品中每个剂量的残留量不得超过100pg。
, 百拇医药 附件六：预防用新生物制品临床研究的技术要求
预防用新生物制品的临床研究，视研究阶段和制品的性质，可选择疫区、非疫区的适宜人群作为观察对象，由临床研究组织单位和参加单位共同制定严密的计划，并严格遵照执行。
一、范围
包括《新生物制品审批管理办法》中的第一、二、三、四、五类中的预防用新生物制品。
二、内容
(一)评价新制品对人体的安全性。
(二)评价新制品用于人体的预防效果(包括免疫持久性)。
三、临床研究共分四期进行
(一)I期临床研究
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重点观察人体对新制品的反应程度(安全性)。须由有经验的研究人员和有经验的临床或防疫医师，根据临床前研究结果作出周密的设计，根据制品性质选择健康易感人群观察，选择对象(或其保护人)按自愿原则参加，一般总人数不得超过二十人。如该制品的免疫对象为儿童或婴幼儿时，须按先成人，后儿童，最后婴幼儿顺序分步进行，每个年龄段人数不超过二十人。
研究过程中，必须自始至终对受试者进行局部和全身反应观察备有应急药物及器械。凡出现不良反应，立即救治。试验结束，应及时总结。
(二)Ⅱ~Ⅲ期临床研究
在I期临床研究的基础上，除进一步观察制品的反应外，同时进行体液和/或细胞免疫效果观察和免疫剂量、途径及程序的研究，观察总人数一般为500至l000人，必要时有些制品需增加或减少观察人数，须经专家委员会讨论确定。
临床研究应设对照组，对照组人数和情况应与试验组基本相近，用双盲法和随机抽样进行分组并接种。为使试验结果明确可靠，试验设计还应考虑到①观察地区和人群的选择；②临床诊断标准；②体液和/或细胞免疫检测方法。试验观察应有详细的计划和统一的表格，建立每个受试者的详细记录。
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Ⅲ期临床结束，对所得到的数据进行数理统计、分析整理，写出正式书面报告。对制品的安全性与免疫学效果作出初步评价，提出免疫剂量、途径和程序。并提出免疫持久性研究方案；如Ⅲ期临床研究中尚需进一步研究免疫剂量、途径和程序，应提出方案。
(三)Ⅳ期临床研究
新制品得到国家药品监督管理局批准试生产后，即应进行第Ⅳ期临床研究，必要时可延续至正式生产后。目的是在制品大量使用过程中进一步考核制品的安全性(特别是发生率较低的异常反应)、预防效果和稳定性。可设立几个大量使用该制品的观察区。
Ⅳ期临床研究一般选择发病率高的流行区的人群进行。为进一步评价制品的安全性与预防效果(包括保护率)，可根据估计的发病率和保护率设计观察组和对照组所需人数；免疫方案则可根据Ⅱ~Ⅲ期临床研究结果而定。并进行免疫持久性研究，必要时进一步进行免疫剂量、途径和程序的研究。
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Ⅳ期临床研究结束，所得资料应用数理统计整理，写出书面报告，对制品作出评价。
l.
特殊申请的临床研究所遵循的原则基本与中试产品Ⅰ期临床研究相同，除观察安全性外，还应初步观察血清学效果。
附件七：预防用新生物制品临床研究程序
临床研究是预防用新生物制品研制过程中的重要阶段，是验证新制品安全性、有效性的关键措施。为做好这项工作特制定以下程序：
一、新生物制品临床研究工作必须按国家药品监督管理局颁发的《新生物制品审批办法》有关规定向国家药品监督管理局报审，待国家药品监督管理局批准后方可进行。
二、新生物制品临床研究必须按国家药品监督管理局批件中的要求和GCP的精神进行。
, 百拇医药
三、临床研究工作要由临床研究组织单位和参加单位按《预防用生物制品临床研究的技术要求》共同制订科学严密的研究方案，并严格遵照执行，必要时请有经验的临床医生配合。研制单位应参与研究方案的制订和实施过程的监督，以保证方案按时准确地实施。
四、参加临床研究的单位与研制单位要签订合同书。
五、向进行临床研究实施地的卫生行政部门有关领导汇报，向被观察群体所在单位的领导宣传，出示新制品已获准进行临床研究的批件，宣传新制品的有关知识、新制品临床研究的必要性、重要意义以及当地的有利条件等。消除不必要的顾虑，征得他们的同意和对工作的支持。
六、每期临床研究均应遵循自愿的原则选择观察对象，特别特殊申请和Ⅰ期临床研究阶段，要向观察对象或接种儿童的家长及所在学校的老师宣传新制品及接种的有关知识等，取得他们的同意和支持，并签字。
七、在临床研究过程中，如发现预防接种异常反应要及时处理，要及时向现场单位及当地卫生行政部门汇报。必要时，由省级卫生行政部门组织有关专家鉴定；区别性质，按共同制定的合同处理。出现严重情况及时向国家药品监督管理局及卫生部汇报。
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八、完成新制品临床研究接种反应观察，要向当地卫生行政部门汇报，而后撤离现场。
九、完成Ⅰ、Ⅱ~Ⅲ、Ⅳ期临床研究后，要分别写出总结资料送有关部门。
十、各期临床研究的血清学测定，须由临床研究组织单位完成。
附件八：人的体细胞治疗申报临床试验指导原则
序 言
自1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，体细胞治疗的研究与应用进展很快，涌现了许多新的技术方法；应用范围进一步扩大。为了促进我国体细胞治疗的正常开展并利于管理，特起草本文件。
体细胞治疗是指应用人的自体，同种异体或异种(非人体)的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选11级药物或其它能改变细胞生物学行为的处理。经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断或预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核白细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞(IVS)等等；体内移植体外加工过的骨髓细胞或造血干细胞；体内接种体外处理过的肿瘤细胞(瘤苗)；体内植入经体外操作过的细胞群如肝细胞、肌细胞、胰岛细胞、软骨细胞等等。
, 百拇医药
由于体细胞治疗的最终制品不是某一种单一物质而是一类具有生物学效应的细胞，其制备技术和应用方案具有多样性。复杂性和特殊性，因此不能象一般生物制品那样制订出适合于每一种方案的具体标准，本文件只提出一个共同的原则，具体的申报资料和应用方案应根据本文件加以准备、申请和实施。对每个方案的整个操作过程和最终制品必须制定并严格执行(实施)标准操作程序，以确保体细胞治疗的安全、有效。申报资料
一、体细胞治疗制剂的名称、选题目的与依据、国内外研究现状或生产使用情况
(一)申请表
(二)体细胞治疗制剂的名称及命名依据
(三)选题的目的和立题依据
(四)国内外有关该制剂的研究现状、生产及临床应用情况(包括专利查询情况)
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二、体细胞的采集、分离和检定
(一)体细胞类型和供体的情况
1.体细胞类型
须指出细胞来源是属于自体、同种异体还是异种。必须提供细胞的组织来源及细胞类别的确证资料，其中包括形态、生化或表面标志等。
2.供体
若体细胞来源于同种异体，需说明供体的年龄、性别，供体必须符合献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV、HCV、HIV-1、HIV一2及其它感染均为阴性。必要时须说明供体的血清学。诊断学及临床资料。对于那些需通过激活体内免疫功能发挥作用或需体细胞在体内长期存活的体细胞治疗项目，除ABO血型外，还必须对供体作HLA-Ⅰ类和Ⅱ类的分型检查并证明与受体(病人)相匹配，同时提供检测方法和依据。
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若体细胞来源于动物，须提供动物的来源。遗传背景。健康证明(如重要病原体包括人畜共患疾病的病原体，饲养条件)。应用此类体细胞的必要性和安全性。
(二)体细胞的采集
应对采集体细胞的技术方法的安全性、可行性、稳定性进行充分论证。应提供体细胞采集技术的标准操作程序。应说明采集体细胞的地址/环境，所用的设备和设施、保存和运输的环节和条件。预防微生物及毒素等有害因子污染的方法。预防共用设备和设施可能带来的交叉污染等措施。
(三)体细胞的分离
应详细规定分离体细胞用的方法、材料及设备，应提供在此过程中所用的各种材料的资料，如果是购买的原材料，应有供应商/制造商提供的产品说明及分析合格证明。
当应用单克隆抗体进行有关操作时，应参照国家药品监督管理局《人用鼠源性单克隆抗体制造及检定规程》(1999)和WHO《人用单克隆抗体生产及检定考虑要点》(1997)。
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(四)体细胞的检定
在体细胞采集及分离过程中的适当阶段，应对体细胞进行质控检定，包括采集与分离体细胞的收率、存活率、纯度、均一性等。应详细说明检定体细胞所用的方法、材料及设备，并应制定合格标准。
三、体细胞的体外操作
(一)培养基
1.所有成份应有足够纯度(例如，接触细胞的水应符合注射用水标准)，残留的杂质对培养的细胞或受者不应有明显影响。每个培养细胞的部门应保证培养所用的各种成份的质量都经过鉴定，并制定标准规格。若用商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成份。
2.血清的使用
除能证明体细胞培养或激活需要血清外，应避免使用任何血清若必须使用血清，应考虑下列要点：
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(1)人血清
a.外源因子
可采用下列方法，减少人血清传播外源因子的危险：若必须使用同种异体血清，应该采用已认可的试剂盒检测，筛选HBV、HCV、HIV一1、HIV一2阴性的供血者，若使用合并血清，应采自最少数合格的供者，并且将每批血清样品保留一年。
b.血清来源
供血清单位应是国家卫生行政部门认可或批准的采血单位。
c.血清的效力
应对每批血清进行支持体细胞活性或激活能力试验。
(2)动物血清
若使用人血清以外的动物血清，每批血清都应对潜在的外源因子(包括人的病原体)进行检查、筛选。例如，牛血清应进行病毒和支原体污染的检查筛选。
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3.人血液成份的应用
若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白及转铁蛋白，应说明其来源、批号。质量检定合格报告(例如白蛋白是经过批准的)。
4.条件培养基的应用
在体细胞培养中使用细胞培养来源的条件培养基时，有可能增加了制剂的危险性及降低产品的一致性。因此，尽可能确定条件培养基的必要成份，以及尝试用确定的试剂取代条件培养基。在应用条件培养基时应考虑以下几点：
a.条件培养基应符合本部分2、3规定的要求。
b.应详细提供条件培养基的来源、加工及使用说明。
c.当用供者(人)细胞制备条件培养基时，应对供者按献血员标准进行传染因子的检查。
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d.当用自体细胞制备条件培养基时，应减少传播病毒性疾病的危险，病毒在活体外扩增的能力亦应考虑。
5.抗生素的应用
培养基中尽量避免使用p内酰胺类抗生素。若采用青霉素类抗生素，应做青霉素皮试，该细胞制剂应标明加用的抗生素，并不得用于已知对该药过敏的患者。另外，应做不加抗生素的培养对照，以证明能够保持无菌。
6.其它成份
应充分说明体细胞培养和激活时所采用的有丝分裂原、细胞因子、其他因子或化学物质，以及培养物。如上述成份的生产厂家已获国家批准，可以授权引用该文件。使用单克隆抗体时，应参考《人用鼠源性单克隆抗体制造及检定规程》(1999)和WHO《人用单克隆抗体生产及检定考虑要点》(1997)。涉及基因治疗的基因和载体的说明，请参见《人基因治疗申报临床试验指导原则》(1998)。
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7.培养基检定
对每批制成的培养基(例如己加入血清及生长添加物等)应进行无菌试验，以及对拟给病人用的体外培养细胞的激活及/或支持生长试验。
(二)生产过程
部门应对制备工艺流程有详细的标准化操作程序和适时修订的程序。收获时应保留细胞及培养基样品，供检定用。若细胞培养技术有改进，则应评估对细胞得率、生物学效应、均一性及纯度的影响。
应叙述保证细胞批同一性和防止交叉污染的质量控制系统，以及适用于长期培养时定期进行的和在体外培养后输注前对所有培养物进行的质量控制系统。
(三)质量控制
应对所有成分，包括分离、培养及最后处理细胞所用的器具进行质量控制。各种成分都应进行同一性及污染物检查。有生物活性的成分还应进行功能检定。批记录应予保存，该记录应反映制备每批体细胞的所有步骤，记载每一成分的批号及所有检定结果。
, 百拇医药
四、体细胞终制剂的检定与质量控制
各批体细胞的检定包括为验证操作过程对最初数批体细胞所进行的检定(及在操作过程作任何改变后进行的检定)，以及确定安全性等对每批体细胞所进行的检定，应依据实施方案制定合格标准。
(一)每批体细胞的检定
1.得率及存活率：于回输前应进行体细胞得率及存活率检定
2.每批细胞来源的确认：应注明供者的来源并加以标记或批号
3.无菌试验：每批培养的体细胞在患者输注前均应进行无菌试验。建议在培养开始后3-4天起每间隔一定时间取培养液样品，包括患者回输前24小时取样进行试验。微生物污染试验见《中国生物制品规程》中的《生物制品无菌试验规程》应规定，在患者输注刚要开始前检查微生物培养情况，并培养至培养期结束。在患者褂们埃∨嘌杭埃虺恋砦镉醚距こ热旧蚋锢际先旧芳右淮挝廴炯觳狻?/font>
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进行长期培养的体细胞，应进行支原体检查，见《中国生物制品规程》中的《生物制品无菌试验规程》。对大多数自体体细胞产品而言，有效期都很短，因此有些试验(如支原体检测)可能对制品的应用来说耗时太长，但每批制品的留样检测是必需的，其结果可以为制品的质量控制提供完整资料。虽然单个病人应用的体细胞不会等到检测完成后再回输，但是如果留样发现阳性结果或发现几次阳性结果后，应及时对生产过程进行检查。如果在体细胞制备的早期发现有污染情况，应终止该批体细胞制品的继续制备。如果某些检测结果在制品应用时还无结果，应说明可获得结果的时间。
4.体细胞的纯度与均一性
在体细胞回输前，应证明其纯度和均一性已达到可应用水平。
对于经过数代培养的体细胞应进行无污染检查，以保证未被其它类型细胞污染或取代。
对于体细胞体外操作中所用的非人用成份应测定其成品中的含量，例如可检测牛血清蛋白的含量并达到《中国生物制品规程》标准。
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5.生物学效应
如有可能，应尽量检测每批体细胞的生物学效应，例如体细胞具有的某种生物学功能。分泌某种产物的能力，表达某种标志的水平等。
(二)连续三批体细胞制剂的检定(申报临床前完成)
检定项目：
1.体细胞制品的得率和存活率；
2.体细胞制品的纯度和均一性或特征性表面标志
3.体细胞制品的生物学效应；
4.
体细胞制品外源因子的检测
l
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细菌
l
真菌
l
支原体
l
病毒
l
内毒素
5.体细胞制品其他添加成份(如牛血清蛋白)的检测(如抗体、血清、抗生素、固相微粒等)
(三)体细胞制剂的制造及检定规程，及连续三批体细胞制剂制造及检定的原始记录，以及中国药品主物制品检定所的复核检定报告。
, 百拇医药
(四)体细胞制剂的稳定性
根据稳定性的实验结果确定有效期，说明体细胞制剂的保存条件、保存液的成份与配方。
如果体细胞在处理之前，处理当中，或处理之后需由一地运到另一地，应说明运输条件对保存体细胞存活率和功能的影响，应确保运输过程中体细胞制品能达至上述检定标准。应提供运输容器能适用运输生物材料的合格证明。若体细胞制品经冻存后继续用于病人，应在冻融或再扩增后进行上述检定，达到检定标准。
五、体细胞治疗NlIS床前试验
(一)安全性评价
1.生长因子的依赖性细胞，对生长行为必须予以监测，若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖，不能再予以使用。
2.对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
, 百拇医药
3.对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全胜的依据
4.毒性试验。
尽可能模拟临床回输方式，高于临床用量，将相同组织类型的动物体细胞制品回输入动物体内，观察其毒性反应、过敏反应、局部刺激反应。对特殊来源的体细胞，按具体情况制定毒性反应的评价方法。
5.致瘤性试验
对于某些长期培养的体细胞。特别是肿瘤瘤苗，应进行致瘤性试验。
(1)体外试验：软琼脂克隆形成试验。
(2)体内试验：采用裸鼠试验。见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和质控的考虑要点》(1993)。应证明该肿瘤瘤苗经体外处理后已失去生长和繁殖能力。
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6.对于体细胞终制品所用的附加物，应视为体细胞制品的一部分，应作动物毒性试验。
(二)有效性评价
1.体细胞的表型
应提供该类体细胞的形态学、表面标志等，该体细胞应具有预期的功能如分泌某种产物(或因子)，可通过体外试验加以检测。
2.体外试验
检测体细胞制品的生物学效应如细胞毒效应、免疫诱导/增强或抑制效应、造血细胞增殖能力等。应提供有效性证明及详细资料。
3.体内试验
如果有可能以动物模型来进行；临床前试验，应测定体细胞制品在体内生物学功能及其治疗效果。
, 百拇医药
若某种体细胞治疗方法，因种属特异性等原因无法以动物模型体内试验来证实其有效性，应作特别说明，并提供和引证有效性的其它依据。
六、体细胞治疗临床试验方案
(一)临床试验方案除参照国家《新药临床研究的指导原则》外，必须包括所选用的病种、病人的年龄范围、性别、疾病的发展阶段(临床分期)、试用的病例数、事前制定病例选择与淘汰的标准。
(二)给药的方式、剂量、时间及疗程。如通过特殊的手术条件导入治疗制品，须提供详细的操作过程。
(三)评估疗效的客观标准，包括临床指标和实验室检测项目。
(四)评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准、以及监控毒副作用必需的临床与实验室检测的项目。
七、研制及试用单位及负责人资格认证
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提供研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员括负责医师、护士和实验室操作人员)的工作简历及从事与实施体细胞治疗方案有关的经验。提供研究单位从事符合GMP生产制品的条件和证明以及临床单位实施该方案的医疗条件。
八、体细胞治疗伦理学考虑
详细要求参见国家药品监督管理局颁发的GCP有关规定。
附件九：人基因治疗申报临床试验指导原则
1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以后，国内外基因治疗的临床前及临床研究进展很快。为了我国基因治疗的正常开展管理，特起草本文件，作为申报人基因治疗临床试验的试行办法。凡国内单位以及国外单位或中外合资单位所研制的人基因治疗制剂在我国境内进行临床研究，均须按本规定进行申报和审批。
目
, 百拇医药
录
Ⅰ引言
Ⅱ申报资料内容……………………………………………………
一、基因治疗制剂简介……………………………………………
(一)申请表………………………………………………
(二)国内外研究现状、立论依据和目的及预期效果
(三)制剂的制备工艺简介………………………………
二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控……………………
(一)治疗用的目的基因及其质粒的组建………………
, 百拇医药 (二)基因导入系统的组建………………………………
1.病毒型基因导入系统…………………………
2.非病毒型基因导入系统………………………
(三)治疗用制剂的制备工艺及质控……………………
1.病毒型导入系统作为最终制剂………………
2遣《拘偷既胂低匙魑钪罩萍痢?br>
3.以基因工程化细胞为最终制剂………………
三、基因治疗的有效性试验………………………………………
(一)体外试验………………………………………………
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(二)体内试验………………………………………………
四、基因治疗的安全性试验………………………………………
(一)总体安全性评估………………………………………
(二)分子遗传学的评估……………………………………
(三)毒性反应的评估………………………………………
(四)免疫学的评估…………………………………………
(五)致瘤性试验……………………………………………
五、基因治疗临床试验方案……………………………………………
六、伦理学考虑…………………………………………………………
, 百拇医药
七、参考文献……………………………………………………………
Ⅰ 引 言
基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于非生殖细胞。基因治疗的申报范围，是将外源基因或遗传物质导入人体细胞以达到防治疾病的目的，不包括应用化学药物改变基因表达。后者应纳入化学药物治疗的申报范围。
基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为离体基因导入后进入体内(exvivo)及体内导入(invivo)两种形式。前者是在体外将基因导入细胞，然后将细胞导入人体；后者则是将基因通过适当的导入系统直接用于人体。所用导入系统包括病毒与非病毒型。因此，申报资料不可能用一个模式来概括，必须按方案及其技术路线而异。本文只可能提出一个共同的原则。具体的方案应根据这些原则，确定具体申报的内容。根据国内外基因治疗的进展，基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险性，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。为此，希申请者加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终制品的制备，务必制订标准操作规程，并予严格实施。
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Ⅱ 申报资料内容
一、基因治疗制剂简介
(一)申请表(见附表)
(二)国内外研究现状、立论依据和目的及预期效果：
1.应提供国内及国外已开展的同样或同类疗法的资料，包括所选择的病种、有效性、安全性及必要性。须着重指出申请方案与国外或国内已批准的方案的不同处、特点及其优越之处。凡属新的方案，应说明其优越性及安全性的依据。
2.须说明可能出现的副作用或危害，并提出如何避免和减少其危害性或副作用的措施。
3.利弊的权衡。根据该治疗方案可能达到的疗效及可能出现的风险，提出总体的利弊权衡的估价。这种估价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。
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(三)制剂的制备工艺简介：
简要说明该制剂(或产品)的制备工艺流程及其对安全性的保证。
二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控
(一)治疗用的目的基因及其质粒的组建：
不论何种导入形式，首先应说明基因治疗所用的目的基因及其来源(尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料)、分离的材料方法、克隆步骤、DNA序列分析结果以及重组体质粒组建、详细步骤及鉴定结果。
(二)基因导入系统的组建：
这是指将目的基因导入细胞的系统，包括病毒型与非病毒型系统。病毒型导入系统包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。非病毒型导入系统除裸DNA外，一般包括两个部分：一是哺乳动物细胞表达载体；二是其它载体组成部分，如脂质体、多肽或金属粒子等。为此，需说明目的基因导入系统的性质与内容。
, 百拇医药
1.病毒型基因导入系统：
(1)病毒载体及目的基因重组载体
a.载体的来源、结构及专利查询资料
包括载体DNA的限制性内切酶图谱。若有特殊的元件，如启动子、增强子及P01yA位点等，应提供详细资料。若有改变结构(如丢失片段或插入片段)，须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体，须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。
b.目的基因的重组载体：
须包括目的基因的来源、分离方法及步骤以及DNA测序结果，并须说明目的基因的重组载体的组建方法、包括插入的步骤、限制性内切酶图谱。
c.目的基因的稳定性：包括目的基因的重组体结构与表达水平的稳定性资料。
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(2)包装细胞及产病毒的种子细胞库的建立：
a.包装细胞：来源、传代历史以及质控的材料。包括细胞形态学、染色体组型、支原体、细菌、病毒等外源因子的检测结果。若需用其它辅助病毒，须说明其来源、分离的方法步骤。
b.产病毒的种子细胞库的组建：
由病毒载体转染包装细胞所组建的能复制并产生病毒的细胞系称为产病毒细胞系，即种子细胞库。该种子细胞库的组建过程必须予以详细说明，包括材料、方法、步骤、细胞系的鉴定。申报材料包括：
●细胞形态学
●染色体组型
●传代次数
●病毒滴度的检测，包括检测技术及可靠性的依据
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●病毒介导目的基因的表达活性
●外源因子检测结果
●复制型病毒的检测，包括方法、技术可靠性及结果
(3)工作细胞库的建立及质控：
须说明工作细胞扩增的方法、传代次数、倍增时间、可允许的传代次数(保持同样的病毒滴度及转导基因的活性)及工作细胞库的规模、保存条件并提供以下资料：
●细胞的均一性：包括细胞形态学、染色体组型、表型、导入基
因的存在状态及其表达。
●病毒滴度
●转导基因的活性
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●外源因子检测结果
●复制型病毒的检测
所有以上的项目在自检的基础上，均须由中国药品生物制品检定所检测或由药品监督管理局指定的单位检定。
2.非病毒型基因导入系统
非病毒型基因导入系统，均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外，还须附加其它的组分进行加工，如脂质体、多肽系统、金颗粒等。申报的资料须包括：
(1)目的基因的表达载体：
提供表达载体的来源、专利查询资料。说明载体组建的方法、步骤、限制性内切酶图谱、质粒的元件构成(包括启动子、增强子、p01yA位点等)。耐药基因若属耐氨卞青霉素基因，必须说明使用该基因的原因及以后来取确保安全性的措施。
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(2)目的基因表达载体工程菌的种子细胞库、工作细胞库的建立，包括上述重组载体转化所用菌种的来源、基因型及表型。种子细胞库的传代次数、质粒拷贝数及基因表达量等。工作细胞库的组建包括扩增条件、传代过程中质粒的稳定性(拷贝数及表达量)、允许的传代次数、细菌的同一性、外源因子(如杂菌、真菌、噬菌体等)的检测等。
(3)DNA制备与纯化的工艺。
(4)DNA纯度(超螺旋型的含量)，细菌基因组DNA、RNA、蛋白残留量及热源检测结果。
(5)若用物理方法导入，须提供其详细方法、步骤，基因导入效率及其表达活性以及导入细胞后基因的稳定性，无重排或突变的证据。
(三)治疗用制剂的制备工艺及质控：
基因治疗制剂包括直接把病毒或非病毒型基因导入系统作为制剂和通过病毒或非病毒型导入系统，把目的基因导入细胞(同体或异体)，而以细胞为最终制剂。对制备工艺及质控必须提供标准操作流程，并按其步骤严格实施。
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1.病毒型导入系统作为最终制剂：
这包括应用逆转录病毒、腺病毒或其它病毒作为目的基因的导入系统，直接用于人体的方案，须提供以下资料：
(1)产病毒细胞扩增的步骤，病毒的分离、富集及纯化为制品的全部流程。
(2)最终制剂的质控应包括：
a.病毒滴度及最终制剂所含病毒量
b.病毒介导基因的活性
c.复制型病毒的检测
d.内毒素检测
e.无菌试验
f.过敏试验
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g.异常毒性试验
(3)属逆转录病毒的导入系统，应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5%。细胞须用共培养法，产病毒细胞取样量须达每批中1%。检测方法，须用S十儿一法、标记挽救法或RT/PCR中的两种方法。必须用阳性对照(COS4070A上清液)及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。
(4)若最终制品为腺病毒，须补充以下资料：
a.腺病毒颗粒数及感染单位的测定：目前公认的腺病毒的定量，是腺病毒颗粒测定，以腺病毒基因组DNA定量为依据，以1个OD260单位作为1，1×lOl2颗粒；同时要测定感染滴度。
b.复制型腺病毒的检测
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参考美国FDAl 996的建议，在一个病人用的腺病毒的总量中，复制病毒不超过1个PFU。在整个制备过程中，从种子细胞库、工作细胞库的建立以及以后制备用于临床的病毒制剂，均需检测复制性腺病毒。检测必须有阳性对照，感染分子比率(M01)在10-100之间(过高MOI可抑制复制性病毒的生长)
2.非病毒型导入系统作为最终制剂：
这包括表达质粒DNA的直接导入或制备成脂质体、多肽/DNA复合物或金属粒子通过基因枪导入人体等。凡属此类者须提供以下资料：
(1)制备工艺流程应包括几个部分：
a.目的基因表达质粒DNA的制备工艺：包括大量扩增、DNA分离、纯化成半成品。
b.脂质或其它(如多肽或其它介导物质)的制备工艺。
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c.加工为最终制剂(如脂质体、多肤/DNA复合物或其它)的制备工艺
(2)DNA半成品的质控：须包括DNA的纯度、超螺旋体的比例；细菌RNA、基因组DNA及蛋白残留量。DNA制备不得应用氯化艳类化合物。
(3)脂质、多肽类的质控。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。
(4)最终制剂的质控：
①须提供最终制剂的均一性的资料，不同批号存在的最大均一性的程度，并通过有效性与安全性试验证明在该均一性的范围内有效与安全的证据。
②提供以下检测资料：
●无菌试验
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●热原质试验
●过敏试验
●异常毒性试验
●介导目的基因的活性检测
●有害物质残余量的测定
3.以基因工程化的细胞为最终制剂：
这是指应用病毒型或非病毒型基因导入系统，将目的基因导入细胞(自体或非自体细胞)，然后扩增成制品而用于病人。这包括ex-vivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗申报临床试验指导原则》进行申报，同时须提供以下资料：
(1)细胞扩增的全部制备工艺，包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、洗涤最终制品中所用的保存液配方。
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(2)半成品(分装前)的质控：
a.细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。
b.活细胞比例
c.目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因"插入性突变"及其观察方法及结果。
d.上清液中的细菌、热原、其它外源因子等。
e.上清液中小牛血清蛋白残留量。
f.若为释放病毒的细胞，须补充提供：
①病毒滴度。
②病毒转导基因的活性。
②复制型病毒的检测
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(3)最终制剂(分装后)的质控：
a.冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。
b.冻融后细胞上清液(抽样、三批)中的下列检测结果：
①无菌试验。
②热源实验。
C.冻融后细胞的异常毒性试验。
d.若属产病毒细胞，需补充：
①病毒滴度。
②病毒转导基因活性。
e.支原体检查。
鉴于某些细胞产品，有效期较短，而有些项目的检查须较长的时间(如支原体)，这些试验项目可对每批最终产品作留样检查，而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果，应及时对生产过程作检查，对已发放的产品立即采取措施停止使用。
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(4)附加物的质控：附加物指细胞培养、制备过程中所用血清、生长因子、抗菌素等。对小牛血清自蛋白残留量必须检测。对其它因子须说明去除的过程及效果。若加入细胞因子，应单独作出说明。所有保存液成份应提供其安全性的依据。
(四)连续三批基因治疗制剂的原始制备及检定记录
(五)中国药品生物制品检定所的检定报告
(六)基因治疗制剂的稳定性试验资料：需提供保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察的具体数据
三、基因治疗的有效性试验：
在临床试验前，须提供基因治疗申请方案的体外及体内试验有效住的资料。
(一)体外试验：
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须证明该外源基因导入细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。
(二)体内试验：
提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径(如动脉插管)有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。
若有些方案在动物中难以观察其疗效(如种族差异)，应充分提供间接或旁证性的有效性试验的资料或依据。
四、基因治疗的安全性试验：
对质控合格的基因治疗制剂，须提供以下安全性试验的资料：
(一)总体安全性评估：
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除了在质控中已规定的各项要求外，对于exvivo用基因工程化的自体或异体细胞导入人体，应提供以下资料：
1.生长因子的依赖性细胞，对其生长行为必须予以监检。若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖性，不能再予以使用。
2.对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
3.对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全性的依据。
4.致瘤性试验：无论是自体或异体细胞，经基因操作后，均须作致瘤试验。对于瘤苗类制品，必须提供该瘤细胞经过何种处理能有效地阻止继续增殖的证据。致瘤性试验包括软琼脂细胞生长及裸鼠内致瘤试验。
5.细胞种类均一性的监控。对瘤苗类制品，应提供如何去除非肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性的依据。若从肿瘤组织中分离非肿瘤细胞(如淋巴细胞)，则必须提供消除肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性(包括致瘤试验在内)的依据。
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6.复制型病毒的检测，若应用病毒型导入系统必须严格检查复制型病毒(见二(三)l(3))。
7.特种添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，某些exvivo或invivo导入基因或细胞时，加用的明胶、缝线或金属粒子等其它加物，对此类物质必须有动物实验证明其体内的安全性。
(二)分子遗传学的评估：对invivo的治疗方案，必须提供动物体内目的基因导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的存在状态及表达情况。对于exvivo方案。须提供导入基因的细胞进入体内后，基因的表达情况。
(三)毒性反应的评估：
这是安全性试验的重要组成部分。invivo的方案必须提供毒性反应的详细资料。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性(最大耐受量)及长期毒住试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量(按体重或表面积计算)外，尚需有一个较大的剂量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外。应包括与基因治疗相关的检测指标。
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对于exvivo方案，对瘤苗类或淋巴细胞、巨噬细胞类等自体细胞的导入，一般可免做动物急性和长期毒性试验。但若加入特殊的添加物(如明胶、缝线、特殊的导管等)，以及对于某些重要人体脏器内导入(如心、脑、肝等)必须作动物体内毒性作用的试验，并提供详细资料。若exvivo方案添加细胞因子，亦必须提供其安全性的资料。对采用皮肤、皮下、肌肉给药途径的方案，无论是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的资料。
(四)免疫学的评估：
无论病毒型与非病毒型载体系统，均需注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应(如对裸DNA)等。为此申报材料必须尽可能提供这方面的有关资料，并对可能发生的免疫反应提出相应的监控及处理措施。
对用于改变机体免疫状态的目的基因及其导入系统(如瘤苗、导入细胞因子基因或输入基因工程化的免疫细胞)，更需提供它所引起的机体免疫改变以及可能的副作用的资料(参照人体细胞治疗申报临床试验指导原则)。
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(五)致瘤性试验：(见(一)4.)
五、基因治疗临床试验方案：
基因治疗不同于一般生物技术制品的临床应用，首先是它的复杂性。需有经验的临床单位和专家将制品输入或埋入人体的特定组织，甚至通过手术进行操作；二是它的风险性，尚存在许多未知的因素，须对临床研究的全过程进行严密监控。为此必须有临床与研制单位联合申请。临床研究方案除参照国家《新药临床研究的指导原则》外，必须包括以下几点：
(一)单位主管部门(相当于省市卫生厅局)审查意见，包括对"方案"的必要性、可行性、安全性及对参加研究的临床和基础研究单位、人员的资格审查意见。
(二)提供基础研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员(包括负责医师、护士和实验室操作人员)的工作简历及从事与"实施方案"有关的经验。提供研究单位符合GMP生产条件的证明以及临床单位具有实施临床"方案"的医疗条件。
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(三)应制定病例入选、排除与淘汰的标准，包括病种、病人的年龄范围和性别、疾病的发展阶段(临床分期)等、以及试验的病例数。
(四)给药的方式、剂量、时间及疗程。如需通过特殊的手术导入治疗制剂，须提供详细的操作过程。
(五)评估疗效的客观标准，包括临床指标和实验室检测项目。
(六)评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准。以及监测毒副作用所必需的临床与实验室检测的项目。
(七)提供基因导入后是否导入非靶组织的分子生物学检测的项目、方法及指标。
(八)若导入病毒或可能改变机体免疫状态的制剂，须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。
, 百拇医药 (九)对可能产生的副作用或不良反应的记录及总结的表格。
(十)建立实施治疗方案中的事故报告制度。
(十一)随访的计划及实施办法，包括须检测的项目。
(十二)在临床研究过程中，必须严格防止环境污染的措施，如应用病毒，必须防止及证明不发生水平感染的可能性，以及防止对儿童及孕妇的影响。
六、伦理学考虑：
申报材料中，必须提出实施方案中有芈桌硌Х矫娴牟牧稀1匦氤浞种厥勇桌硌У脑虿⒕咛灏垂乙┢芳喽焦芾砭諫CP规定的要求严格实施。包括在实施本方案前，须向病人说明该治疗方案属试验阶段，它可能的有效性及可能发生的风险，同时保证病人有权选择该方案治疗或中止该方案治疗，以及保证一旦中止治疗能得到其它治疗的权利。严格保护病人的隐私。在病人家属充分理解并签字后才能开始治疗。基因治疗目前不用于生殖细胞。
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附件十：放射免疫分析药盒申报资料项目及要求
一、新放免药盒的申报资料项目
1.向国家药品监督管理局报送的研制计划备案文件的复印件；
2.名称及命名依据，选题的目的和依据，国内外有关的研究现状或生产使用情况的综述；
3.放免药盒内所用的校准试剂、标记抗原、抗体或抗血清、分离试剂及质控样品的制备规程和原材料的来源及规格要求、实验室的各项检定等有关资料、数据和结果；
4.放免药盒的总体质量评价资料，包括：灵敏度、精密度、工作范围、抗原一抗体最大特异性结合率(Bo/T%)、非特异性结合率(NsB/T%)、剂量一反应曲线的线性相关系数(r)、有效剂量(ED25、ED50、ED75)、特异性、健全性、难确性、精密度(批内、批间变异系数)；
, 百拇医药
5.放免药盒的稳定性试验及其有效期的有关数据和资料；
6.
放免药盒临床有效性资料，包括3家以上省级医院(设有核医学科)提供能评价其临床有效性且具有统计学意义的例数，并与现有公认的诊断或疗效观察方法或手段进行对比的临床总结资料；
7.放免药盒制备工艺及质量标准草案、使用说明书草案，并提供具有完整内、外包装的样品.
8.连续试制的三批样品制检原始记录及国家药品监督管理局授
权的药品检验所的检验报告。
9.生产单位《放射性药品生产企业许可证》的复印件。
二、放射免疫分析药盒通则(试行)
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(一)、前言
放射免疫分析技术广泛应用于人血清、血浆和尿液等生物样品中微量物质的测定，在生物医学研究、临床诊断和疗效观察方面起着重要的作用。为保证放射免疫分析结果的准确性与有效性，凡在中华人民共和国生产、销售的放射免疫分析药盒(以下简称放免药盒).其生产与检验必须符合本"通则"的各项规定。(未完待续)
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4.3
粗制抗体检测
无论是小鼠腹水法还是细胞培养法制备的单克隆抗体，都需要进行如下检定。
4.3.1 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
4.3.2
支原体检查 按1.4.4项进行。
4.3.3
鼠源病毒检查 按1.4.3项进行。
, 百拇医药 4.3.4 效价测定
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。合格的用于抗体纯化。
4.4 抗体纯化
可采用盐析法、分子筛层析、离子交换或辛酸硫酸铵沉淀等适宜的方法。
4.4.1
尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件。
4.4.2
应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、病毒及用于生产腹水抗体的刺激物(如降植烷、液体石蜡)。
4.4.3 连续生产(至少3批)的各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。
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4.5 纯化后处理
4.5.1
灭活
必要时56℃水浴灭活30分钟，离心收集上清。
4.5.2
合并
不同亚批的合格制品合并后应在2~8℃放置一个月以上，去除部分不稳定蛋白。
4.5.3
除菌分装
将经灭活的单抗用O.227滤膜过滤，过滤后进行分装。
5.
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检定
5.1
半成品
5.1.1
活性检测
用ELISA法或其他特异性检测方法测定。抗体活性应≥参比品。
5.1.2
纯度测定
5.1.2.1
电泳法
还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定抗体纯度。扫描后计算出免疫球蛋白含量，含量应达到95%以上，二聚体≤10%。
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5.1.2.
2 HPLC法
用离子交换柱层析法，纯度应≥95%。
5.1.3
多聚体测定 用FPLC或HPLC法，用适宜的分子筛层析，多聚体应≤10%。
5.1.4
蛋白质含量测定 用Lowry法或其他适宜的方法测定。
5.1.5
DNA含量测定
用DNA分子杂交法。提取待检制品中的DNA，用骨髓瘤细胞制备的DNA探针与待检样品进行杂交。以不同含量的骨髓瘤细胞DNA作为工作标准，每一剂量残余DNA含量不应超过100pg。
, 百拇医药
5.1.6
交叉反应性测定
用免疫组织化学及细胞化学方法检查。应提供3批单抗与人体组织器官的交叉反应性材料。结果不应与人体组织器官发生交叉反应。如肿瘤相关抗原单抗，应进行各种肿瘤组织的交叉反应测定。
5.2
成品检定
5.2.1
物理检查
液体制剂应为接近无色微带乳光的澄清液体，不应含有异物、混浊或摇不散的沉淀。
5.2.2
化学检查
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5.2.2.1
pH值 电位法测定，pH值应为7.0土0.5。
5.2.2.2
蛋白质含量 用Lowry法测定，含量应在标示值的90~110%之内。
5.2.3
活性测定 按5.1.1项进行。
5.2.4
无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
5.2.5
安全试验
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5.2.5.1
豚鼠试验
用体重300~400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射检品5ml，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.5.2
小白鼠试验
用体重18~20g小白鼠10只，每只腹腔注射检品O.5m1，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。
5.2.6
热原质试验
按照《生物制品热原质试验规程》进行。家兔注射剂量＝(人用剂量÷50)×20×家免体重(kg)。不应有致热作用。也可用鲎试剂法，1mg/m1蛋白浓度不应检测出有凝集活性。
, 百拇医药
5.2.7
异常毒性试验
每批成品应进行异常毒性试验。腹腔注射5只体重17~22g小鼠和2只体重250~350g的豚鼠，每只小鼠注射1个人用剂量，但不超过1m1；每只豚鼠注射剂量不超过5m1。动物至少存活7天以上，应无任何异常中毒反应。
5.2.8水分测定
产品如为冻干制品，应进行残余水分测定，其含量应≤3%。
6.
经修饰的单克隆抗体
为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中的作用，常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其他物质偶联形成免疫结合物，或在同一段多肽链中包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白来获得。研究者除对前面提到的有关未偶联单克隆抗体(未修饰单克隆体)的要求外，还应提供下列内容：
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6.1免疫结合物的构建
应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料，包括：
6.1.1
描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素、药物、酶及细胞因子，包括：所有成分的来源、结构、制法、纯度及特征。
6.1.2
制备免疫结合物所用化学试剂的描述，如连接剂和整合剂。这些资料应该包括试剂来源、制备方法，以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容。还应提供合成反应途径的图解，以及与免疫结合物制备中所用化学试剂毒性相关资料。
6.1.3
在确定成品的标准时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分的数量，并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的关系。
, 百拇医药
6.1.4
用重组DNA技术制备的制品(如来源于转染细胞系或微生物培养基，嵌合的、易形的，互补决定区[CDN]接合的及单链Fv抗体，以及重组免疫结合物)应提供构建和制备过程的全部资料。重组免疫结合物的稳定性应认真研究。因聚合物形成构形改变或变性而减弱了特异免疫反应性(如通过重组Fvs形成"双抗")可能导致药代动力学的改变和/或与非靶组织结合。
6.2
免疫结合物的纯度
6.2.1
应采取特殊措施保证抗体尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因这些污染物质在构建免疫结合物过程中，能与核素、毒素或药物发生反应。
6.2.2
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应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量。活性中间体应被灭活或去除。
6.3
免疫结合物的免疫反应性，效力及稳定件
毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性。
6.3.1
应采用适当的方法评估偶联前后的免疫反应胜。
6.3.2
免疫结合物非免疫球蛋白成份的活性应在适当的时候用效力试验来进行评估(例如，毒素、细胞因子或酶，用于造影的放射性免疫结合物除外)。
6.3.3
, 百拇医药 免疫结合物构建后，应确定免疫反应性变化的百分率限值，并作为产品规格的组成部分。
6.3.4
应通过在合并的人血清中37℃无菌条件下孵育，来检测免疫结合物在体外的稳定性。假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性，血浆可以用来替代血清。经过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度。应详细说明评估产品稳定性的条件及所用阴、阳对照。
6.4
与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题
放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备。应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法。
6.4.1
, http://www.100md.com
放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含连续3次放射标记试生产的分析结果，应证明所制备的产品未改变免疫特异性、无菌、无热原质。放射性标记试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标记及使用试剂的同一组人员进行。
6.4.2
制备免疫结合物时应使用放射性药品及同位素并应提供其无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信函。
6.4.3
在标记试生产过程中，应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度，以及标记试剂及其分解产物的残留水平。
6.4.4
应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验。
6.4.5
, 百拇医药
适当的时候，应检测免疫结合物形成胶体的情况，并对其进行限定。
7.
产品稳定性及效期
产品稳定性应满足临床方案制定的要求。加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用，但不能代替实际的稳定性资料。
7.1
应制定稳定性检定规划，包括在规定效期全过程中，每间隔一定时间进行制品的物理化学完整性试验(如断裂或聚合)，效力试验，无菌试验，以及水份、pH和防腐剂的稳定性的测定。
7.2
确保制品生物活性的稳定性试验(例如定量体外效力试验)应包括厂内参比品。如可能，在试验的全过程中只使用一批试验抗原(如：纯化的抗原、细胞或组织)。应用定量效力试验使对生物没注进行有意义的比较成为可能。
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7.3
加速稳定性试验，即将制品贮存在温度高于常规贮存温度后的稳定性试验，可能有助于鉴定及建立稳定性指示试验。表示稳定
件的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析方法进行监测。
7.4
由稳定性试验的条件和结果确定产品的贮存条件及效期。
8.
临床前研究
由于生产条件或配方的改变可引起制品生物活性的明显变化。因此，建议在临床前研究中所使用的单抗应与临床试验中拟使用的单抗的生产工艺一致。
8.l
, 百拇医药
MAB的交叉反应性试验
当相同或相关抗原决定簇在人的非预定的细胞或靶组织表达时，可观察到抗体与它们结合。非靶组织结合可能具有严重后果，特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时。因此，一般在I期临床试验前应经过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测。对于双特异性抗体，除检测双特异性产品外，还应对每株亲本抗体进行逐个评估。
8.1.1
检测交叉反应性的体外试验
目前，用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测，应使用有效的并被确认的新技术(参照5.1.6)。
8.1.2
测定交叉反应性的体内试验
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当有适当模型时，单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合的体内试验。试验结果，特别是对具有溶细胞性的免疫结合物或具有ADCC活性的抗体，通常要求进行更广泛的临床前试验，包括用一种以上动物超剂量及重复剂量进行动物试验。设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位。
8.2
临床前药理学和毒性试验
8.2.1
设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中习能的毒性
评估在人体中潜在不良反应副作用的可能性和严重程度，并可能确定安全初始剂量和逐步提高剂量。有关单克隆抗体脑临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能。
8.2.2
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动物毒理学研究
当设计单克隆抗体的毒理学试验时，应考虑如下：
8.2.2.1
若被试样品为未偶联抗体，且无合适的动物模型或无携带相关抗原的动物，且与人组织交叉反应性试验明显阴性，则毒理学试验不是必须的。
8.2.2.2
动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性。但是，对于所用的动物模型，不必要求对单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等。例如，结合力差异可通过增加剂量或服药频率来弥补。应鉴定动物和人之间存在的抗原数。单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异。这可以更精确的推断人用的安全初始剂量，并评估安全范围。
8.2.2.3
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对单克隆抗体通常不要求进行常规诱变性的评估。
8.2.2.4
打算给育龄妇女反复或长期使用的产品，应该用适当的动物模型进行反复的深入的研究包括致畸试验。
8.2.3
药效学和动物药代动力学
8，2.3.1
当有动物模型时，则应尽可能证明药理学效应与剂量的依赖性，以及有效剂量的范围，可以更好地预测治疗指数。
药代动力学模型有助于阐明临床前活性及毒性，有助于推荐适当的剂量范围，进而可以改进临床试验的设计方案。这种研究有助于最终确定药代动力学及药效学。
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8.2.3.2
下列方面可以指导药代动力学及药效学试验动物种类的选择：
8.2.3.2.1
最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物模型来进行试验。对于仅抗人而未在动物模型中表达的人抗原或外源抗原(细菌、病毒等)的末偶联单克隆抗体，若不是为了论述生产问题，可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验。
8.2.3.2.2
当有抗原结合资料表明灵长类为最相关种属时，则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的。
8.2.3.2.3
应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的可能性进行严格评估。异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义。
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8.2.3.3
药代动力学参数应用一种或多种试验方法确定(如放射性标记的单克隆抗体应用ELlSA和测定放射性的方法来试验)。对于任何类型的免疫结合物，完整的结合物应与游离单克隆抗体和游离配基相区别(如毒素、药物或放射性核素)。
8.2.3.4
鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质，但在人体内具免疫原性，这就使得在鼠内所得的重复剂量结果难以推至拟在人体内使用的重复剂量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"单克隆抗体将出现相应的问题，在这种情况下用啮齿类动物进行重复剂量的研究意义不大。
8.2.4
用免疫结合物进行的临床前体内研究
8.2.4.1
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应在体内试验免疫结合物的稳定性
8.2.4.1.1
应测定免疫结合物中每个组分在动物体内药代动力学和组织分布，并且与未偶联抗体的分布相比较。
8.2.4.1.2
不同组分的靶组织和他们可能引起的潜在毒性应被证实。
8.2.4.2
由于免疫结合物可能被降解或作用位点的活性不是单克隆抗体与靶抗原结合的结果，应对含有放射性核素、毒素或药物的免疫结合物进行动物毒性试验，尽管该种动物不存在靶抗原。根据免疫结合物组分的性质和其偶联的稳定性，对组分分别进行试验是有道理的。应充分描述每个组分的毒性情况、副反应的发生和严重程度。所得结果应与结合物稳定性试验密切相关。如可能，应用具有相关靶抗原或疾病模型动物体内进行免疫结合物试验，如果不存在靶抗原阳性的动物就在啮齿类动物体内进行。游离毒素或核素的毒性试验可在不同种类动物中进行。
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8.2.4.3
对于放射性核素的免疫结合物：
8.2.4.3.1
动物生物分布的资料可被用于对初始人用剂量的评估。
8.2.4.3.2
如可能，表达靶抗原的动物模型更有可能发现抗原"减少"或带有在生物分布和/或毒性方面表现意外抗原的组织。
8.2.4.3.3
异种移植模型可以组织定位和抗原非特异放射性免疫结合物分布问题，但对确定一般组织交叉反应范围没有帮助。
8.2.4.3.4
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应研究适宜的动物数量以用一个可接受的变异系数(通常小于20%)对放射性剂量进行评估。
8.2.4.3.5
对于使用放射性总量的新陈代谢和测定从早到晚清除期时间点的适当数值应有完整计算。
8.
2.4.3.6
放射性免疫结合物应通过在血清或血浆中孵育检测体外稳定性。应建立方法来评估游离表位，偶联单克隆抗体，标记的非单克隆抗体三种中每成分存在的放射性百分比。
说明：对局部外用和制备体外诊断试剂盒单克隆抗体要求参照上述相关部分执行，但其生产条件、小鼠清洁级别、抗体纯度和安全试验可根据实际需要降低或减少要求。
附录1
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病毒检测
1.方法
(1)可用补体结合、免疫荧光、血凝抑制或ELISA检测鼠群血清，腹水单抗中的病毒，以确定其病毒污染情况。
(2)将样品(待检物或已破碎的来自种子批或培养的细胞)接种人二倍体细胞系培养物中，并观察其病变。
(3)应用鸡胚接种进行检查，可用9≤11天龄的鸡胚，将样品注射于10个鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊腔及卵黄囊中。接种后鸡胚至少5天后才能进行检查。并用脉鼠、鸡或其他禽类的红细胞检查尿囊中是否含有血凝素。
(4)将待检物肌肉接种出生24小时之内的小鼠至少10只，成年小鼠10只或豚鼠5只，并脑腔接种成年小鼠lO只。被试验的动物至少观察4周，动物应无发病，至少80%的动物健康存活。
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2.病毒
组 病 毒
受影响动物
I 出血热病毒
大鼠，小鼠
淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)
小鼠
3型呼肠弧病毒(Reo)
大鼠，小鼠
大鼠轮状病毒
大鼠
仙台病毒
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大鼠，小鼠
Ⅱ
脱脚病病毒
小鼠
KITHAM氏大鼠病毒(KRV)
大鼠
小鼠腺病毒(MAV)
小鼠
小鼠肺炎病毒(PVM)
小鼠
逆转录病毒
大鼠，小鼠
TOOLAN病毒(HI)
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大鼠
3.
范围
样 品
上述方法 次 数
杂交瘤种子批
(1)(2)(3)(4) 每批检查
生产细胞库
(1)(2)(3)(4) 每批检查
鼠群
(1)
定期抽查
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制备腹水的细胞
(1)(2)(3)(4) 至少1次
体外制备收获前细胞
(1)(2)(3)(4) 至少1次
单抗腹水混合批
(1)(2) 连续3批后抽检
体外制备的单抗
(2) 连续3批后抽检
半成品
(1)(2)(3)(4) 每批检查
成品
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视腹水或鼠群情况定 每批检查
附录2
交叉反应试验
1.
人体组织器官
扁桃体、胸腺、淋巴结
骨髓、血细胞
肺、肝、肾、膀肮、脾、胃、肠
胰腺、腮腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体
脑、外周神经
卵巢、辜丸
皮肤
, 百拇医药
眼
2.
方法
免疫组织化学法及免疫细胞化学法。
附件五：传代细胞系生产生物制品规程
一、细胞系的历史及一般特性
1.
细胞系的历史
生物制品生产用任一细胞系均需得到国家药品监督管理局的认可，并应提供如下资料：
1.1
细胞系来源供者的年龄、性别、种属和健康状况描述。
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1.2
细胞传代培养方法、生长特征、世代数、用于生产的最高限制代数、所用培养基成分以及传代史等。
1.3
初步确认实验以及可能存在的所有外源因子检查结果。
2.
细胞的一般特性
细胞系的生长模式及形态学特征，细胞鉴定的特殊标志，遗传特征(如HLA，DNA指纹图谱)。
2.2
证明细胞能用于预定目的的资料。
2.3
, 百拇医药
对细胞系，等于或超过用于生产的传代水平(群体倍增或培养时间)的生物特征作出说明。
二、细胞库
1.
细胞库的建立
一旦选定某一细胞系作为产品的生物来源，应建立细胞库以确保在产品的持续生产期限内，充分供应质量均一的细胞及细胞的进一步鉴定，并减少细胞交叉污染及外源因子污染。用于生物制品生产的细胞库应得到国家药品监督管理局认可和注册。
1.1
主细胞库(MCB)
指由单一组织或细胞获得的一定量组成的均一细胞，装安瓿，保存于一100℃以下或液氮中。
, 百拇医药 1.2
生产细胞库(WCB)
是由1安瓿或2安瓿以上主细胞库细胞获得的，经次代培养扩增至生产者选定的合法的代次，将细胞合并，分装安瓿，一100℃以下或液氮保存。
2.细胞库的保管
主细胞库和生产用细胞库都应贮存在一100℃以下或液氮中，应详细记录安瓿的放置位置，识别标志，冻存日期及库存量。建议主细胞库和生产用细胞库分别设在生产设施中相距较远的两处或多处，以避免细胞系丢失。
3.
细胞库检定
3.1
外源因子检查
, 百拇医药
3.1.1
细菌、真菌检查按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.1.2
支原体检查一般采用用培养法和DNA荧光染色法。也可采用间接免疫荧光法、探针杂交法或PCR法等，但必须有资料证明其特异性和敏感性。任何一种方法都需要设阴性和阳性对照。
3.1.3
病毒因子检查
3.1.3.1
同种细胞直接观察
取混合瓶细胞样品，接种培养瓶，长成单层后更换维持液，观察两周，镜检细胞，应保持正常形态特征。
, 百拇医药
3.1.3.2
细胞培养检查
细胞培养的上清液混合样品至少接种下列三种细胞培养单层：
(1)
一种或两种细胞种类及组织类型与生产用细胞来源相同的单层培养物；
(2)
人二倍体细胞单层培养物；
(3)
人或猴肾细胞单层培养物。
用于检测的细胞样品应尽可能不稀释，应将上述至少107细胞和废弃的培养液分别接种到三种类型细胞上。
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接种的样品量应占维持液的20%以上，至少观察二周，在观察期末做吸附试验。
3.1.3.3
动物体和鸡胚试验
动物组别 要 求
数 量 接种途径 接种量* 观察天数 结果(m1/只)
乳鼠 24小时内 2窝≥l0只
脑内 0.0l 21
应健存
腹腔 0.1
成鼠 12~248 10
, 百拇医药
脑内 0.03 21
应健存
腹腔 0.5
豚鼠 350~500g 5
腹腔 5.0 42
应健存，解剖
无结核病变
家兔 1.5~2.5Kg 5
皮内 0.l×10 21
无异常
皮下 9.0
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健存
鸡胚 9~11日龄 10
尿囊腔 0.2 3~4
尿液血凝试验* *
阴性
*
每只动物腹腔至少接种107细胞；脑内至少接种106细胞；鸡胚103细胞
*
*用脉鼠和鸡血球
如80%以上动物和鸡胚健存，此试验为通过。
如果细胞系来源为啮齿类动物，应用10只敏感的成年小白鼠，每只脑内接种106活细胞用以检测是否有淋巴脉络丛脑炎病毒污染。
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3.1.3.4
特殊外源病毒检测
(1)小白鼠、大白鼠及地鼠抗体产生试验检测啮齿类动物细胞系中存在的种特异性病毒，也可用杂交法、PCR法、单抗检测、电镜检测；
(2)人源的细胞系可用体外诊断试验检测病毒性病原，如EB病毒、巨细胞病毒(CMV)、乙型及丙型肝炎病毒(HBV、HCV)、爱滋病病毒(HIV)。常用方法有杂交法、PCR法、单抗检测及电镜检测；
(3)逆转录病毒检测可用电镜检查和逆转录酶(RT)测定。
3.2
细胞鉴别试验
可采用生化方法如同功酶分析、免疫学(如HLA分析)、细胞遗传学(如染色体标记试验)和遗传标记物(如DNA指纹图谱)等任何方法进行鉴别，证明无其他种细胞污染。
, 百拇医药
3.4
致肿瘤性检测
用于生产的传代细胞系应有致瘤性的资料，对于已经证实有致瘤性的啮齿类动物来源的传代细胞如BHK一21、cHo、c-127不要求做致瘤性试验，除非研究资料能够证明某一新的细胞系不具有致瘤性，否则应把此细胞看作有致瘤性。如果要鉴定某个细胞系是否有致瘤性，可以单用体内法或者单用体外法，也可以体内、体外两种方法联合使用。
3.4.l
体内检测
3.4.1.1
动物
(1)裸鼠；
(2)抗胸腺细胞(ATS)血清或球蛋白(ATG)抑制免疫的新生地鼠，小白鼠或大白鼠；
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(3)用健康小白鼠骨髓再建的胸腺切除并照射过的小白鼠。
3.4.1.2
方法
(1)用在生产代数范围内的被试验细胞接种至少10只动物，每只皮下或肌肉各注射107个细胞，以Hela、Hep一2细胞为阳性对照，以二倍体细胞(WI一38或RC一5)作阴性对照，阳性对照细胞接种量应比被试细胞少1个数量级。
(2)采用新生地鼠、小白鼠或大白鼠的试验体系时，应于动物出生的当天及2、7、14天皮下或肌肉注射O.1m1有效的ATS或ATG，使在出生当天接种阳性对照细胞的动物产生进行性肿瘤生长和转移。
(3)观察14天，检查有无肿瘤生长，并做详细记录，有结节或可疑病灶时，做病理检查。无结节生长时，半数继续观察1周，另一半数继续观察10周。每只动物应进行解剖，并详细检查。
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3.4.2
体外检测体外检测试验也可充分鉴定细胞的致肿瘤原性。
3.4.2.1
软琼脂集落形成试验。
3.4.2.2
接种器官培养后产生侵袭性细胞生长。
3.4.2.3
传代细胞系中DNA转化实验实验时应取处于生产用传代水平的传代细胞DNA，目的是确定是否能从传代细胞系中检出活化的致癌基因。
三、细胞培养物的生产和产品检定
1.
, 百拇医药
细胞培养基
1.1
细胞培养基组成和来源的详细资料。对诸如血清和胰蛋白酶这样的来源于动物的原材料，应来自具有适当监测系统的地区和没有发现牛海绵体脑病(BSE)的牛群体。
1.2
血清检测
1.2.1
细菌、真菌检测按《生物制品无菌试验规程》进行。
1.2.2
支原体检测按二3.1.2项。
1.2.3
, 百拇医药 外源病毒检测
1.2.3.1
血清应检测牛腹泻病毒，样品接种BT细胞后，采用荧光抗体法检测，或细胞培养基上清接种动物后以酶标方法检测抗体。
1.2.3.2
其他动物血清应检测与该动物感染有关的病毒。
1.2.4
噬菌体检测利用噬菌斑法、增殖法检测可能污染的噬菌体。
1.2.5
尽可能减少繁殖细胞所需的血清量，成品中血清的残留量不得超过1：1000000(17g/m1)。
1.2.6
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禁止使用人血清，如使用人血白蛋白，应按《人血白蛋白的制造及检定规程》进行检定。
1.3
胰蛋白酶检测
1.3.1
细胞、真菌检测同二3.1.1项。
1.3.2
支原体检测同二3.1.2项。
1.3.3
病毒检测主要检测牛或猪的细小病毒。
1.4
其他
, 百拇医药
1.4.1
生产细胞中不得加青霉素或其他日一内酰胺类抗生素。
1.4.2
允许加最低量的其他抗生素，但制品中应避免存在任何抗生素。
2.
半成品、成品检测
2.1
细菌、真菌检测同二3.1.1项。
2.2
支原体检测同二3.1.2项。
2.3
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外源病毒检测
2.3.1
方法同二3.1.3项。
2.3.2
用特异探针可检测CMV。
2.3.3
若产品是病毒制品，当制品对检测造成干扰时，应增加一种以上外源病毒常规检查用细胞，观察有无细胞病变，并检测有无血吸附病毒。
2.4
残留DNA测定
用探针杂交法，检查制品中每个剂量的残留量不得超过100pg。
, 百拇医药 附件六：预防用新生物制品临床研究的技术要求
预防用新生物制品的临床研究，视研究阶段和制品的性质，可选择疫区、非疫区的适宜人群作为观察对象，由临床研究组织单位和参加单位共同制定严密的计划，并严格遵照执行。
一、范围
包括《新生物制品审批管理办法》中的第一、二、三、四、五类中的预防用新生物制品。
二、内容
(一)评价新制品对人体的安全性。
(二)评价新制品用于人体的预防效果(包括免疫持久性)。
三、临床研究共分四期进行
(一)I期临床研究
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重点观察人体对新制品的反应程度(安全性)。须由有经验的研究人员和有经验的临床或防疫医师，根据临床前研究结果作出周密的设计，根据制品性质选择健康易感人群观察，选择对象(或其保护人)按自愿原则参加，一般总人数不得超过二十人。如该制品的免疫对象为儿童或婴幼儿时，须按先成人，后儿童，最后婴幼儿顺序分步进行，每个年龄段人数不超过二十人。
研究过程中，必须自始至终对受试者进行局部和全身反应观察备有应急药物及器械。凡出现不良反应，立即救治。试验结束，应及时总结。
(二)Ⅱ~Ⅲ期临床研究
在I期临床研究的基础上，除进一步观察制品的反应外，同时进行体液和/或细胞免疫效果观察和免疫剂量、途径及程序的研究，观察总人数一般为500至l000人，必要时有些制品需增加或减少观察人数，须经专家委员会讨论确定。
临床研究应设对照组，对照组人数和情况应与试验组基本相近，用双盲法和随机抽样进行分组并接种。为使试验结果明确可靠，试验设计还应考虑到①观察地区和人群的选择；②临床诊断标准；②体液和/或细胞免疫检测方法。试验观察应有详细的计划和统一的表格，建立每个受试者的详细记录。
, 百拇医药
Ⅲ期临床结束，对所得到的数据进行数理统计、分析整理，写出正式书面报告。对制品的安全性与免疫学效果作出初步评价，提出免疫剂量、途径和程序。并提出免疫持久性研究方案；如Ⅲ期临床研究中尚需进一步研究免疫剂量、途径和程序，应提出方案。
(三)Ⅳ期临床研究
新制品得到国家药品监督管理局批准试生产后，即应进行第Ⅳ期临床研究，必要时可延续至正式生产后。目的是在制品大量使用过程中进一步考核制品的安全性(特别是发生率较低的异常反应)、预防效果和稳定性。可设立几个大量使用该制品的观察区。
Ⅳ期临床研究一般选择发病率高的流行区的人群进行。为进一步评价制品的安全性与预防效果(包括保护率)，可根据估计的发病率和保护率设计观察组和对照组所需人数；免疫方案则可根据Ⅱ~Ⅲ期临床研究结果而定。并进行免疫持久性研究，必要时进一步进行免疫剂量、途径和程序的研究。
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Ⅳ期临床研究结束，所得资料应用数理统计整理，写出书面报告，对制品作出评价。
l.
特殊申请的临床研究所遵循的原则基本与中试产品Ⅰ期临床研究相同，除观察安全性外，还应初步观察血清学效果。
附件七：预防用新生物制品临床研究程序
临床研究是预防用新生物制品研制过程中的重要阶段，是验证新制品安全性、有效性的关键措施。为做好这项工作特制定以下程序：
一、新生物制品临床研究工作必须按国家药品监督管理局颁发的《新生物制品审批办法》有关规定向国家药品监督管理局报审，待国家药品监督管理局批准后方可进行。
二、新生物制品临床研究必须按国家药品监督管理局批件中的要求和GCP的精神进行。
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三、临床研究工作要由临床研究组织单位和参加单位按《预防用生物制品临床研究的技术要求》共同制订科学严密的研究方案，并严格遵照执行，必要时请有经验的临床医生配合。研制单位应参与研究方案的制订和实施过程的监督，以保证方案按时准确地实施。
四、参加临床研究的单位与研制单位要签订合同书。
五、向进行临床研究实施地的卫生行政部门有关领导汇报，向被观察群体所在单位的领导宣传，出示新制品已获准进行临床研究的批件，宣传新制品的有关知识、新制品临床研究的必要性、重要意义以及当地的有利条件等。消除不必要的顾虑，征得他们的同意和对工作的支持。
六、每期临床研究均应遵循自愿的原则选择观察对象，特别特殊申请和Ⅰ期临床研究阶段，要向观察对象或接种儿童的家长及所在学校的老师宣传新制品及接种的有关知识等，取得他们的同意和支持，并签字。
七、在临床研究过程中，如发现预防接种异常反应要及时处理，要及时向现场单位及当地卫生行政部门汇报。必要时，由省级卫生行政部门组织有关专家鉴定；区别性质，按共同制定的合同处理。出现严重情况及时向国家药品监督管理局及卫生部汇报。
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八、完成新制品临床研究接种反应观察，要向当地卫生行政部门汇报，而后撤离现场。
九、完成Ⅰ、Ⅱ~Ⅲ、Ⅳ期临床研究后，要分别写出总结资料送有关部门。
十、各期临床研究的血清学测定，须由临床研究组织单位完成。
附件八：人的体细胞治疗申报临床试验指导原则
序 言
自1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，体细胞治疗的研究与应用进展很快，涌现了许多新的技术方法；应用范围进一步扩大。为了促进我国体细胞治疗的正常开展并利于管理，特起草本文件。
体细胞治疗是指应用人的自体，同种异体或异种(非人体)的体细胞，经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选11级药物或其它能改变细胞生物学行为的处理。经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断或预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核白细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞(IVS)等等；体内移植体外加工过的骨髓细胞或造血干细胞；体内接种体外处理过的肿瘤细胞(瘤苗)；体内植入经体外操作过的细胞群如肝细胞、肌细胞、胰岛细胞、软骨细胞等等。
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由于体细胞治疗的最终制品不是某一种单一物质而是一类具有生物学效应的细胞，其制备技术和应用方案具有多样性。复杂性和特殊性，因此不能象一般生物制品那样制订出适合于每一种方案的具体标准，本文件只提出一个共同的原则，具体的申报资料和应用方案应根据本文件加以准备、申请和实施。对每个方案的整个操作过程和最终制品必须制定并严格执行(实施)标准操作程序，以确保体细胞治疗的安全、有效。申报资料
一、体细胞治疗制剂的名称、选题目的与依据、国内外研究现状或生产使用情况
(一)申请表
(二)体细胞治疗制剂的名称及命名依据
(三)选题的目的和立题依据
(四)国内外有关该制剂的研究现状、生产及临床应用情况(包括专利查询情况)
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二、体细胞的采集、分离和检定
(一)体细胞类型和供体的情况
1.体细胞类型
须指出细胞来源是属于自体、同种异体还是异种。必须提供细胞的组织来源及细胞类别的确证资料，其中包括形态、生化或表面标志等。
2.供体
若体细胞来源于同种异体，需说明供体的年龄、性别，供体必须符合献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV、HCV、HIV-1、HIV一2及其它感染均为阴性。必要时须说明供体的血清学。诊断学及临床资料。对于那些需通过激活体内免疫功能发挥作用或需体细胞在体内长期存活的体细胞治疗项目，除ABO血型外，还必须对供体作HLA-Ⅰ类和Ⅱ类的分型检查并证明与受体(病人)相匹配，同时提供检测方法和依据。
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若体细胞来源于动物，须提供动物的来源。遗传背景。健康证明(如重要病原体包括人畜共患疾病的病原体，饲养条件)。应用此类体细胞的必要性和安全性。
(二)体细胞的采集
应对采集体细胞的技术方法的安全性、可行性、稳定性进行充分论证。应提供体细胞采集技术的标准操作程序。应说明采集体细胞的地址/环境，所用的设备和设施、保存和运输的环节和条件。预防微生物及毒素等有害因子污染的方法。预防共用设备和设施可能带来的交叉污染等措施。
(三)体细胞的分离
应详细规定分离体细胞用的方法、材料及设备，应提供在此过程中所用的各种材料的资料，如果是购买的原材料，应有供应商/制造商提供的产品说明及分析合格证明。
当应用单克隆抗体进行有关操作时，应参照国家药品监督管理局《人用鼠源性单克隆抗体制造及检定规程》(1999)和WHO《人用单克隆抗体生产及检定考虑要点》(1997)。
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(四)体细胞的检定
在体细胞采集及分离过程中的适当阶段，应对体细胞进行质控检定，包括采集与分离体细胞的收率、存活率、纯度、均一性等。应详细说明检定体细胞所用的方法、材料及设备，并应制定合格标准。
三、体细胞的体外操作
(一)培养基
1.所有成份应有足够纯度(例如，接触细胞的水应符合注射用水标准)，残留的杂质对培养的细胞或受者不应有明显影响。每个培养细胞的部门应保证培养所用的各种成份的质量都经过鉴定，并制定标准规格。若用商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成份。
2.血清的使用
除能证明体细胞培养或激活需要血清外，应避免使用任何血清若必须使用血清，应考虑下列要点：
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(1)人血清
a.外源因子
可采用下列方法，减少人血清传播外源因子的危险：若必须使用同种异体血清，应该采用已认可的试剂盒检测，筛选HBV、HCV、HIV一1、HIV一2阴性的供血者，若使用合并血清，应采自最少数合格的供者，并且将每批血清样品保留一年。
b.血清来源
供血清单位应是国家卫生行政部门认可或批准的采血单位。
c.血清的效力
应对每批血清进行支持体细胞活性或激活能力试验。
(2)动物血清
若使用人血清以外的动物血清，每批血清都应对潜在的外源因子(包括人的病原体)进行检查、筛选。例如，牛血清应进行病毒和支原体污染的检查筛选。
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3.人血液成份的应用
若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白及转铁蛋白，应说明其来源、批号。质量检定合格报告(例如白蛋白是经过批准的)。
4.条件培养基的应用
在体细胞培养中使用细胞培养来源的条件培养基时，有可能增加了制剂的危险性及降低产品的一致性。因此，尽可能确定条件培养基的必要成份，以及尝试用确定的试剂取代条件培养基。在应用条件培养基时应考虑以下几点：
a.条件培养基应符合本部分2、3规定的要求。
b.应详细提供条件培养基的来源、加工及使用说明。
c.当用供者(人)细胞制备条件培养基时，应对供者按献血员标准进行传染因子的检查。
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d.当用自体细胞制备条件培养基时，应减少传播病毒性疾病的危险，病毒在活体外扩增的能力亦应考虑。
5.抗生素的应用
培养基中尽量避免使用p内酰胺类抗生素。若采用青霉素类抗生素，应做青霉素皮试，该细胞制剂应标明加用的抗生素，并不得用于已知对该药过敏的患者。另外，应做不加抗生素的培养对照，以证明能够保持无菌。
6.其它成份
应充分说明体细胞培养和激活时所采用的有丝分裂原、细胞因子、其他因子或化学物质，以及培养物。如上述成份的生产厂家已获国家批准，可以授权引用该文件。使用单克隆抗体时，应参考《人用鼠源性单克隆抗体制造及检定规程》(1999)和WHO《人用单克隆抗体生产及检定考虑要点》(1997)。涉及基因治疗的基因和载体的说明，请参见《人基因治疗申报临床试验指导原则》(1998)。
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7.培养基检定
对每批制成的培养基(例如己加入血清及生长添加物等)应进行无菌试验，以及对拟给病人用的体外培养细胞的激活及/或支持生长试验。
(二)生产过程
部门应对制备工艺流程有详细的标准化操作程序和适时修订的程序。收获时应保留细胞及培养基样品，供检定用。若细胞培养技术有改进，则应评估对细胞得率、生物学效应、均一性及纯度的影响。
应叙述保证细胞批同一性和防止交叉污染的质量控制系统，以及适用于长期培养时定期进行的和在体外培养后输注前对所有培养物进行的质量控制系统。
(三)质量控制
应对所有成分，包括分离、培养及最后处理细胞所用的器具进行质量控制。各种成分都应进行同一性及污染物检查。有生物活性的成分还应进行功能检定。批记录应予保存，该记录应反映制备每批体细胞的所有步骤，记载每一成分的批号及所有检定结果。
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四、体细胞终制剂的检定与质量控制
各批体细胞的检定包括为验证操作过程对最初数批体细胞所进行的检定(及在操作过程作任何改变后进行的检定)，以及确定安全性等对每批体细胞所进行的检定，应依据实施方案制定合格标准。
(一)每批体细胞的检定
1.得率及存活率：于回输前应进行体细胞得率及存活率检定
2.每批细胞来源的确认：应注明供者的来源并加以标记或批号
3.无菌试验：每批培养的体细胞在患者输注前均应进行无菌试验。建议在培养开始后3-4天起每间隔一定时间取培养液样品，包括患者回输前24小时取样进行试验。微生物污染试验见《中国生物制品规程》中的《生物制品无菌试验规程》应规定，在患者输注刚要开始前检查微生物培养情况，并培养至培养期结束。在患者褂们埃∨嘌杭埃虺恋砦镉醚距こ热旧蚋锢际先旧芳右淮挝廴炯觳狻?/font>
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进行长期培养的体细胞，应进行支原体检查，见《中国生物制品规程》中的《生物制品无菌试验规程》。对大多数自体体细胞产品而言，有效期都很短，因此有些试验(如支原体检测)可能对制品的应用来说耗时太长，但每批制品的留样检测是必需的，其结果可以为制品的质量控制提供完整资料。虽然单个病人应用的体细胞不会等到检测完成后再回输，但是如果留样发现阳性结果或发现几次阳性结果后，应及时对生产过程进行检查。如果在体细胞制备的早期发现有污染情况，应终止该批体细胞制品的继续制备。如果某些检测结果在制品应用时还无结果，应说明可获得结果的时间。
4.体细胞的纯度与均一性
在体细胞回输前，应证明其纯度和均一性已达到可应用水平。
对于经过数代培养的体细胞应进行无污染检查，以保证未被其它类型细胞污染或取代。
对于体细胞体外操作中所用的非人用成份应测定其成品中的含量，例如可检测牛血清蛋白的含量并达到《中国生物制品规程》标准。
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5.生物学效应
如有可能，应尽量检测每批体细胞的生物学效应，例如体细胞具有的某种生物学功能。分泌某种产物的能力，表达某种标志的水平等。
(二)连续三批体细胞制剂的检定(申报临床前完成)
检定项目：
1.体细胞制品的得率和存活率；
2.体细胞制品的纯度和均一性或特征性表面标志
3.体细胞制品的生物学效应；
4.
体细胞制品外源因子的检测
l
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细菌
l
真菌
l
支原体
l
病毒
l
内毒素
5.体细胞制品其他添加成份(如牛血清蛋白)的检测(如抗体、血清、抗生素、固相微粒等)
(三)体细胞制剂的制造及检定规程，及连续三批体细胞制剂制造及检定的原始记录，以及中国药品主物制品检定所的复核检定报告。
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(四)体细胞制剂的稳定性
根据稳定性的实验结果确定有效期，说明体细胞制剂的保存条件、保存液的成份与配方。
如果体细胞在处理之前，处理当中，或处理之后需由一地运到另一地，应说明运输条件对保存体细胞存活率和功能的影响，应确保运输过程中体细胞制品能达至上述检定标准。应提供运输容器能适用运输生物材料的合格证明。若体细胞制品经冻存后继续用于病人，应在冻融或再扩增后进行上述检定，达到检定标准。
五、体细胞治疗NlIS床前试验
(一)安全性评价
1.生长因子的依赖性细胞，对生长行为必须予以监测，若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖，不能再予以使用。
2.对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
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3.对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全胜的依据
4.毒性试验。
尽可能模拟临床回输方式，高于临床用量，将相同组织类型的动物体细胞制品回输入动物体内，观察其毒性反应、过敏反应、局部刺激反应。对特殊来源的体细胞，按具体情况制定毒性反应的评价方法。
5.致瘤性试验
对于某些长期培养的体细胞。特别是肿瘤瘤苗，应进行致瘤性试验。
(1)体外试验：软琼脂克隆形成试验。
(2)体内试验：采用裸鼠试验。见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和质控的考虑要点》(1993)。应证明该肿瘤瘤苗经体外处理后已失去生长和繁殖能力。
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6.对于体细胞终制品所用的附加物，应视为体细胞制品的一部分，应作动物毒性试验。
(二)有效性评价
1.体细胞的表型
应提供该类体细胞的形态学、表面标志等，该体细胞应具有预期的功能如分泌某种产物(或因子)，可通过体外试验加以检测。
2.体外试验
检测体细胞制品的生物学效应如细胞毒效应、免疫诱导/增强或抑制效应、造血细胞增殖能力等。应提供有效性证明及详细资料。
3.体内试验
如果有可能以动物模型来进行；临床前试验，应测定体细胞制品在体内生物学功能及其治疗效果。
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若某种体细胞治疗方法，因种属特异性等原因无法以动物模型体内试验来证实其有效性，应作特别说明，并提供和引证有效性的其它依据。
六、体细胞治疗临床试验方案
(一)临床试验方案除参照国家《新药临床研究的指导原则》外，必须包括所选用的病种、病人的年龄范围、性别、疾病的发展阶段(临床分期)、试用的病例数、事前制定病例选择与淘汰的标准。
(二)给药的方式、剂量、时间及疗程。如通过特殊的手术条件导入治疗制品，须提供详细的操作过程。
(三)评估疗效的客观标准，包括临床指标和实验室检测项目。
(四)评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准、以及监控毒副作用必需的临床与实验室检测的项目。
七、研制及试用单位及负责人资格认证
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提供研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员括负责医师、护士和实验室操作人员)的工作简历及从事与实施体细胞治疗方案有关的经验。提供研究单位从事符合GMP生产制品的条件和证明以及临床单位实施该方案的医疗条件。
八、体细胞治疗伦理学考虑
详细要求参见国家药品监督管理局颁发的GCP有关规定。
附件九：人基因治疗申报临床试验指导原则
1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以后，国内外基因治疗的临床前及临床研究进展很快。为了我国基因治疗的正常开展管理，特起草本文件，作为申报人基因治疗临床试验的试行办法。凡国内单位以及国外单位或中外合资单位所研制的人基因治疗制剂在我国境内进行临床研究，均须按本规定进行申报和审批。
目
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录
Ⅰ引言
Ⅱ申报资料内容……………………………………………………
一、基因治疗制剂简介……………………………………………
(一)申请表………………………………………………
(二)国内外研究现状、立论依据和目的及预期效果
(三)制剂的制备工艺简介………………………………
二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控……………………
(一)治疗用的目的基因及其质粒的组建………………
, 百拇医药 (二)基因导入系统的组建………………………………
1.病毒型基因导入系统…………………………
2.非病毒型基因导入系统………………………
(三)治疗用制剂的制备工艺及质控……………………
1.病毒型导入系统作为最终制剂………………
2遣《拘偷既胂低匙魑钪罩萍痢?br>
3.以基因工程化细胞为最终制剂………………
三、基因治疗的有效性试验………………………………………
(一)体外试验………………………………………………
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(二)体内试验………………………………………………
四、基因治疗的安全性试验………………………………………
(一)总体安全性评估………………………………………
(二)分子遗传学的评估……………………………………
(三)毒性反应的评估………………………………………
(四)免疫学的评估…………………………………………
(五)致瘤性试验……………………………………………
五、基因治疗临床试验方案……………………………………………
六、伦理学考虑…………………………………………………………
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七、参考文献……………………………………………………………
Ⅰ 引 言
基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于非生殖细胞。基因治疗的申报范围，是将外源基因或遗传物质导入人体细胞以达到防治疾病的目的，不包括应用化学药物改变基因表达。后者应纳入化学药物治疗的申报范围。
基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为离体基因导入后进入体内(exvivo)及体内导入(invivo)两种形式。前者是在体外将基因导入细胞，然后将细胞导入人体；后者则是将基因通过适当的导入系统直接用于人体。所用导入系统包括病毒与非病毒型。因此，申报资料不可能用一个模式来概括，必须按方案及其技术路线而异。本文只可能提出一个共同的原则。具体的方案应根据这些原则，确定具体申报的内容。根据国内外基因治疗的进展，基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险性，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。为此，希申请者加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终制品的制备，务必制订标准操作规程，并予严格实施。
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Ⅱ 申报资料内容
一、基因治疗制剂简介
(一)申请表(见附表)
(二)国内外研究现状、立论依据和目的及预期效果：
1.应提供国内及国外已开展的同样或同类疗法的资料，包括所选择的病种、有效性、安全性及必要性。须着重指出申请方案与国外或国内已批准的方案的不同处、特点及其优越之处。凡属新的方案，应说明其优越性及安全性的依据。
2.须说明可能出现的副作用或危害，并提出如何避免和减少其危害性或副作用的措施。
3.利弊的权衡。根据该治疗方案可能达到的疗效及可能出现的风险，提出总体的利弊权衡的估价。这种估价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。
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(三)制剂的制备工艺简介：
简要说明该制剂(或产品)的制备工艺流程及其对安全性的保证。
二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控
(一)治疗用的目的基因及其质粒的组建：
不论何种导入形式，首先应说明基因治疗所用的目的基因及其来源(尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料)、分离的材料方法、克隆步骤、DNA序列分析结果以及重组体质粒组建、详细步骤及鉴定结果。
(二)基因导入系统的组建：
这是指将目的基因导入细胞的系统，包括病毒型与非病毒型系统。病毒型导入系统包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。非病毒型导入系统除裸DNA外，一般包括两个部分：一是哺乳动物细胞表达载体；二是其它载体组成部分，如脂质体、多肽或金属粒子等。为此，需说明目的基因导入系统的性质与内容。
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1.病毒型基因导入系统：
(1)病毒载体及目的基因重组载体
a.载体的来源、结构及专利查询资料
包括载体DNA的限制性内切酶图谱。若有特殊的元件，如启动子、增强子及P01yA位点等，应提供详细资料。若有改变结构(如丢失片段或插入片段)，须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体，须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。
b.目的基因的重组载体：
须包括目的基因的来源、分离方法及步骤以及DNA测序结果，并须说明目的基因的重组载体的组建方法、包括插入的步骤、限制性内切酶图谱。
c.目的基因的稳定性：包括目的基因的重组体结构与表达水平的稳定性资料。
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(2)包装细胞及产病毒的种子细胞库的建立：
a.包装细胞：来源、传代历史以及质控的材料。包括细胞形态学、染色体组型、支原体、细菌、病毒等外源因子的检测结果。若需用其它辅助病毒，须说明其来源、分离的方法步骤。
b.产病毒的种子细胞库的组建：
由病毒载体转染包装细胞所组建的能复制并产生病毒的细胞系称为产病毒细胞系，即种子细胞库。该种子细胞库的组建过程必须予以详细说明，包括材料、方法、步骤、细胞系的鉴定。申报材料包括：
●细胞形态学
●染色体组型
●传代次数
●病毒滴度的检测，包括检测技术及可靠性的依据
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●病毒介导目的基因的表达活性
●外源因子检测结果
●复制型病毒的检测，包括方法、技术可靠性及结果
(3)工作细胞库的建立及质控：
须说明工作细胞扩增的方法、传代次数、倍增时间、可允许的传代次数(保持同样的病毒滴度及转导基因的活性)及工作细胞库的规模、保存条件并提供以下资料：
●细胞的均一性：包括细胞形态学、染色体组型、表型、导入基
因的存在状态及其表达。
●病毒滴度
●转导基因的活性
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●外源因子检测结果
●复制型病毒的检测
所有以上的项目在自检的基础上，均须由中国药品生物制品检定所检测或由药品监督管理局指定的单位检定。
2.非病毒型基因导入系统
非病毒型基因导入系统，均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外，还须附加其它的组分进行加工，如脂质体、多肽系统、金颗粒等。申报的资料须包括：
(1)目的基因的表达载体：
提供表达载体的来源、专利查询资料。说明载体组建的方法、步骤、限制性内切酶图谱、质粒的元件构成(包括启动子、增强子、p01yA位点等)。耐药基因若属耐氨卞青霉素基因，必须说明使用该基因的原因及以后来取确保安全性的措施。
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(2)目的基因表达载体工程菌的种子细胞库、工作细胞库的建立，包括上述重组载体转化所用菌种的来源、基因型及表型。种子细胞库的传代次数、质粒拷贝数及基因表达量等。工作细胞库的组建包括扩增条件、传代过程中质粒的稳定性(拷贝数及表达量)、允许的传代次数、细菌的同一性、外源因子(如杂菌、真菌、噬菌体等)的检测等。
(3)DNA制备与纯化的工艺。
(4)DNA纯度(超螺旋型的含量)，细菌基因组DNA、RNA、蛋白残留量及热源检测结果。
(5)若用物理方法导入，须提供其详细方法、步骤，基因导入效率及其表达活性以及导入细胞后基因的稳定性，无重排或突变的证据。
(三)治疗用制剂的制备工艺及质控：
基因治疗制剂包括直接把病毒或非病毒型基因导入系统作为制剂和通过病毒或非病毒型导入系统，把目的基因导入细胞(同体或异体)，而以细胞为最终制剂。对制备工艺及质控必须提供标准操作流程，并按其步骤严格实施。
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1.病毒型导入系统作为最终制剂：
这包括应用逆转录病毒、腺病毒或其它病毒作为目的基因的导入系统，直接用于人体的方案，须提供以下资料：
(1)产病毒细胞扩增的步骤，病毒的分离、富集及纯化为制品的全部流程。
(2)最终制剂的质控应包括：
a.病毒滴度及最终制剂所含病毒量
b.病毒介导基因的活性
c.复制型病毒的检测
d.内毒素检测
e.无菌试验
f.过敏试验
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g.异常毒性试验
(3)属逆转录病毒的导入系统，应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5%。细胞须用共培养法，产病毒细胞取样量须达每批中1%。检测方法，须用S十儿一法、标记挽救法或RT/PCR中的两种方法。必须用阳性对照(COS4070A上清液)及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。
(4)若最终制品为腺病毒，须补充以下资料：
a.腺病毒颗粒数及感染单位的测定：目前公认的腺病毒的定量，是腺病毒颗粒测定，以腺病毒基因组DNA定量为依据，以1个OD260单位作为1，1×lOl2颗粒；同时要测定感染滴度。
b.复制型腺病毒的检测
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参考美国FDAl 996的建议，在一个病人用的腺病毒的总量中，复制病毒不超过1个PFU。在整个制备过程中，从种子细胞库、工作细胞库的建立以及以后制备用于临床的病毒制剂，均需检测复制性腺病毒。检测必须有阳性对照，感染分子比率(M01)在10-100之间(过高MOI可抑制复制性病毒的生长)
2.非病毒型导入系统作为最终制剂：
这包括表达质粒DNA的直接导入或制备成脂质体、多肽/DNA复合物或金属粒子通过基因枪导入人体等。凡属此类者须提供以下资料：
(1)制备工艺流程应包括几个部分：
a.目的基因表达质粒DNA的制备工艺：包括大量扩增、DNA分离、纯化成半成品。
b.脂质或其它(如多肽或其它介导物质)的制备工艺。
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c.加工为最终制剂(如脂质体、多肤/DNA复合物或其它)的制备工艺
(2)DNA半成品的质控：须包括DNA的纯度、超螺旋体的比例；细菌RNA、基因组DNA及蛋白残留量。DNA制备不得应用氯化艳类化合物。
(3)脂质、多肽类的质控。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。
(4)最终制剂的质控：
①须提供最终制剂的均一性的资料，不同批号存在的最大均一性的程度，并通过有效性与安全性试验证明在该均一性的范围内有效与安全的证据。
②提供以下检测资料：
●无菌试验
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●热原质试验
●过敏试验
●异常毒性试验
●介导目的基因的活性检测
●有害物质残余量的测定
3.以基因工程化的细胞为最终制剂：
这是指应用病毒型或非病毒型基因导入系统，将目的基因导入细胞(自体或非自体细胞)，然后扩增成制品而用于病人。这包括ex-vivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗申报临床试验指导原则》进行申报，同时须提供以下资料：
(1)细胞扩增的全部制备工艺，包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、洗涤最终制品中所用的保存液配方。
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(2)半成品(分装前)的质控：
a.细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。
b.活细胞比例
c.目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因"插入性突变"及其观察方法及结果。
d.上清液中的细菌、热原、其它外源因子等。
e.上清液中小牛血清蛋白残留量。
f.若为释放病毒的细胞，须补充提供：
①病毒滴度。
②病毒转导基因的活性。
②复制型病毒的检测
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(3)最终制剂(分装后)的质控：
a.冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。
b.冻融后细胞上清液(抽样、三批)中的下列检测结果：
①无菌试验。
②热源实验。
C.冻融后细胞的异常毒性试验。
d.若属产病毒细胞，需补充：
①病毒滴度。
②病毒转导基因活性。
e.支原体检查。
鉴于某些细胞产品，有效期较短，而有些项目的检查须较长的时间(如支原体)，这些试验项目可对每批最终产品作留样检查，而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果，应及时对生产过程作检查，对已发放的产品立即采取措施停止使用。
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(4)附加物的质控：附加物指细胞培养、制备过程中所用血清、生长因子、抗菌素等。对小牛血清自蛋白残留量必须检测。对其它因子须说明去除的过程及效果。若加入细胞因子，应单独作出说明。所有保存液成份应提供其安全性的依据。
(四)连续三批基因治疗制剂的原始制备及检定记录
(五)中国药品生物制品检定所的检定报告
(六)基因治疗制剂的稳定性试验资料：需提供保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察的具体数据
三、基因治疗的有效性试验：
在临床试验前，须提供基因治疗申请方案的体外及体内试验有效住的资料。
(一)体外试验：
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须证明该外源基因导入细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。
(二)体内试验：
提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径(如动脉插管)有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。
若有些方案在动物中难以观察其疗效(如种族差异)，应充分提供间接或旁证性的有效性试验的资料或依据。
四、基因治疗的安全性试验：
对质控合格的基因治疗制剂，须提供以下安全性试验的资料：
(一)总体安全性评估：
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除了在质控中已规定的各项要求外，对于exvivo用基因工程化的自体或异体细胞导入人体，应提供以下资料：
1.生长因子的依赖性细胞，对其生长行为必须予以监检。若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖性，不能再予以使用。
2.对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。
3.对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全性的依据。
4.致瘤性试验：无论是自体或异体细胞，经基因操作后，均须作致瘤试验。对于瘤苗类制品，必须提供该瘤细胞经过何种处理能有效地阻止继续增殖的证据。致瘤性试验包括软琼脂细胞生长及裸鼠内致瘤试验。
5.细胞种类均一性的监控。对瘤苗类制品，应提供如何去除非肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性的依据。若从肿瘤组织中分离非肿瘤细胞(如淋巴细胞)，则必须提供消除肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性(包括致瘤试验在内)的依据。
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6.复制型病毒的检测，若应用病毒型导入系统必须严格检查复制型病毒(见二(三)l(3))。
7.特种添加物：除细胞培养及保存所用的试剂外，某些exvivo或invivo导入基因或细胞时，加用的明胶、缝线或金属粒子等其它加物，对此类物质必须有动物实验证明其体内的安全性。
(二)分子遗传学的评估：对invivo的治疗方案，必须提供动物体内目的基因导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的存在状态及表达情况。对于exvivo方案。须提供导入基因的细胞进入体内后，基因的表达情况。
(三)毒性反应的评估：
这是安全性试验的重要组成部分。invivo的方案必须提供毒性反应的详细资料。除目的基因可能导致的毒性外，导入系统的安全性评价至为重要，其安全性评估应包括急性毒性(最大耐受量)及长期毒住试验。毒性试验所用的剂量，除包括相当于临床使用剂量(按体重或表面积计算)外，尚需有一个较大的剂量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察，除常规检测项目外。应包括与基因治疗相关的检测指标。
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对于exvivo方案，对瘤苗类或淋巴细胞、巨噬细胞类等自体细胞的导入，一般可免做动物急性和长期毒性试验。但若加入特殊的添加物(如明胶、缝线、特殊的导管等)，以及对于某些重要人体脏器内导入(如心、脑、肝等)必须作动物体内毒性作用的试验，并提供详细资料。若exvivo方案添加细胞因子，亦必须提供其安全性的资料。对采用皮肤、皮下、肌肉给药途径的方案，无论是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的资料。
(四)免疫学的评估：
无论病毒型与非病毒型载体系统，均需注意进入体内后的免疫反应有关的问题，包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应(如对裸DNA)等。为此申报材料必须尽可能提供这方面的有关资料，并对可能发生的免疫反应提出相应的监控及处理措施。
对用于改变机体免疫状态的目的基因及其导入系统(如瘤苗、导入细胞因子基因或输入基因工程化的免疫细胞)，更需提供它所引起的机体免疫改变以及可能的副作用的资料(参照人体细胞治疗申报临床试验指导原则)。
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(五)致瘤性试验：(见(一)4.)
五、基因治疗临床试验方案：
基因治疗不同于一般生物技术制品的临床应用，首先是它的复杂性。需有经验的临床单位和专家将制品输入或埋入人体的特定组织，甚至通过手术进行操作；二是它的风险性，尚存在许多未知的因素，须对临床研究的全过程进行严密监控。为此必须有临床与研制单位联合申请。临床研究方案除参照国家《新药临床研究的指导原则》外，必须包括以下几点：
(一)单位主管部门(相当于省市卫生厅局)审查意见，包括对"方案"的必要性、可行性、安全性及对参加研究的临床和基础研究单位、人员的资格审查意见。
(二)提供基础研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员(包括负责医师、护士和实验室操作人员)的工作简历及从事与"实施方案"有关的经验。提供研究单位符合GMP生产条件的证明以及临床单位具有实施临床"方案"的医疗条件。
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(三)应制定病例入选、排除与淘汰的标准，包括病种、病人的年龄范围和性别、疾病的发展阶段(临床分期)等、以及试验的病例数。
(四)给药的方式、剂量、时间及疗程。如需通过特殊的手术导入治疗制剂，须提供详细的操作过程。
(五)评估疗效的客观标准，包括临床指标和实验室检测项目。
(六)评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准。以及监测毒副作用所必需的临床与实验室检测的项目。
(七)提供基因导入后是否导入非靶组织的分子生物学检测的项目、方法及指标。
(八)若导入病毒或可能改变机体免疫状态的制剂，须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。
, 百拇医药 (九)对可能产生的副作用或不良反应的记录及总结的表格。
(十)建立实施治疗方案中的事故报告制度。
(十一)随访的计划及实施办法，包括须检测的项目。
(十二)在临床研究过程中，必须严格防止环境污染的措施，如应用病毒，必须防止及证明不发生水平感染的可能性，以及防止对儿童及孕妇的影响。
六、伦理学考虑：
申报材料中，必须提出实施方案中有芈桌硌Х矫娴牟牧稀1匦氤浞种厥勇桌硌У脑虿⒕咛灏垂乙┢芳喽焦芾砭諫CP规定的要求严格实施。包括在实施本方案前，须向病人说明该治疗方案属试验阶段，它可能的有效性及可能发生的风险，同时保证病人有权选择该方案治疗或中止该方案治疗，以及保证一旦中止治疗能得到其它治疗的权利。严格保护病人的隐私。在病人家属充分理解并签字后才能开始治疗。基因治疗目前不用于生殖细胞。
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附件十：放射免疫分析药盒申报资料项目及要求
一、新放免药盒的申报资料项目
1.向国家药品监督管理局报送的研制计划备案文件的复印件；
2.名称及命名依据，选题的目的和依据，国内外有关的研究现状或生产使用情况的综述；
3.放免药盒内所用的校准试剂、标记抗原、抗体或抗血清、分离试剂及质控样品的制备规程和原材料的来源及规格要求、实验室的各项检定等有关资料、数据和结果；
4.放免药盒的总体质量评价资料，包括：灵敏度、精密度、工作范围、抗原一抗体最大特异性结合率(Bo/T%)、非特异性结合率(NsB/T%)、剂量一反应曲线的线性相关系数(r)、有效剂量(ED25、ED50、ED75)、特异性、健全性、难确性、精密度(批内、批间变异系数)；
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5.放免药盒的稳定性试验及其有效期的有关数据和资料；
6.
放免药盒临床有效性资料，包括3家以上省级医院(设有核医学科)提供能评价其临床有效性且具有统计学意义的例数，并与现有公认的诊断或疗效观察方法或手段进行对比的临床总结资料；
7.放免药盒制备工艺及质量标准草案、使用说明书草案，并提供具有完整内、外包装的样品.
8.连续试制的三批样品制检原始记录及国家药品监督管理局授
权的药品检验所的检验报告。
9.生产单位《放射性药品生产企业许可证》的复印件。
二、放射免疫分析药盒通则(试行)
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(一)、前言
放射免疫分析技术广泛应用于人血清、血浆和尿液等生物样品中微量物质的测定，在生物医学研究、临床诊断和疗效观察方面起着重要的作用。为保证放射免疫分析结果的准确性与有效性，凡在中华人民共和国生产、销售的放射免疫分析药盒(以下简称放免药盒).其生产与检验必须符合本"通则"的各项规定。(未完待续)
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