复方丹参滴丸对缺血预适应大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响(2)
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摘 要
目的：复方丹参滴丸模拟和加强缺血预适应(IPC)的机制，是否通过促进蛋白激酶C(PKC)蛋白、mRNA水平表达发挥作用。方法：采用结扎大鼠冠脉缺血5 min、再灌注5 min反复循环3次的缺血预适应方案和缺血30 min，再灌注2h的缺血再灌模型，通过免疫组化、RT-PCR的方法观察PKC蛋白、mRNA表达以及复方丹参滴丸对其影响。 结果：PKC在正常对照组中主要存在胞浆，但经过IPC和使用复方丹参滴丸后，在胞膜和胞核也可见；不论早期IPC组，还是晚期IPC组PKC表达均高于假性预处理组，以早期IPC组明显，P< 0.01；经复方丹参滴丸预处理后，PKC的表达均高于再灌注组、早期IPC组、晚期IPC组，以药物预处理+ 缺血预处理组(DIPC)为优，显著高于早期IPC组，P< 0.01。PKC mRNA在正常心肌组织、再灌注组、假性预处理组间无明显差异，但IPC后不论早期，还是晚期PKC mRNA表达均高于假性预处理组，晚期IPC 组表现更加明显；经复方丹参预处理后，可明显促进早、晚期IPC及再灌注组PKC mRNA的表达，P< 0.05。结论：复方丹参滴丸可激活PKC，使其发生转位，促进其蛋白、mRNA表达水平增高。这可能是复方丹参滴丸模拟和加强IPC的主要机制之一。
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(上接本版7月18日第10版)
七、采用RT-PCR方法观察PKC mRNA表达
于实验结束时各组取心尖组织100 mg，立刻放入液氮中保存。
1、总RNA的分离：使用TRIZOL Reagent(LTI)提取心肌总RNA，核酸分析仪定量，检测纯度和含量，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。取1μg RNA用于RT-PCR。
2、一步法RT-PCR：使用TakaRa BIOTECH公司的一步法试剂盒测定。反应体系为25 μl, 每一反应体系中含总RNA 1μg，上游引物和下游引物终浓度为0.4 μmol，PKC RT-PCR扩增循环28次，逆转录50℃、30 min，变性94℃、30s，退火温度为55℃、30s，延伸72℃、6min。β-actin退火温度为64℃，其作用条件同上。
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3、PKC mRNA表达分析：各组取0.5 μl扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果拍照，采用Image Master VDS进行光密度扫描(IOD)，以各组PKC条带IOD和相应的β-actin条带的IOD比值表示PKC mRNA表达的强弱。
4、统计学处理时数据用x±s表示，用随机设计的方差分析和q检验。采用Stada4.0软件进行。
结 果
1、复方丹参滴丸对IPC大鼠心脏组织PKC蛋白表达的影响
PKC在对照组中主要存在胞浆，但经过IPC和用药后，在胞膜和胞核也可见，这说明IPC和用药两种情况激活了PKC，发生转位，再灌注组和假性预处理组较对照组表达增强， 但差异无显著性；不论早期IPC组，还是晚期IPC组表达均高于假性预处理组，以早期IPC组明显，P< 0.01；经复方丹参滴丸预处理后，PKC的表达均高于相应组，以药物预处理加缺血预处理组为优，显著高于IPC组，P< 0.01。上述结果提示，复方丹参滴丸可激活PKC，促进PKC蛋白表达，见表1。
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表1 各组PKC表达评分值
组
例数
评分值
control
IR
SIPC
IPC
DIPC
DIR
SIPC/SWOP
IPC/SWOP
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DIPC/SWOP
6
7
7
7
7
7
7
6
7
0.88±0.21
1.79±0.86
2.43±1.00
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3.36±1.17**
5.2±1.30 **△△
2.71±1.31
1.25±0.63
1.83±1.48
2.71±1.12
注：与IR、SIPC比较**P< 0.01，与IPC比较△△P< 0.01
2、复方丹参滴丸对IPC大鼠心脏组织PKC mRNA表达的影响
琼脂糖凝胶电泳结果，经光密度分析发现，PKC mRNA在正常心肌组织中也表达，再灌注和假性预处理组与对照组没有明显差异，不论早期IPC组，还是晚期IPC组表达均高于假性预处理组，晚期IPC 组表现更加明显；复方丹参滴丸预处理后，可明显促进早、晚期IPC及再灌注组PKC mRNA的表达，P< 0.05，见图1。
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讨 论
PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞，在心脏中主要是ε、η亚型,静止细胞中PKC主要存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，PKC以钙离子依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上，此过程称之为转位(translocation)。一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。PKC的激活依赖于钙离子和磷酯的存在，但只有在磷酯代谢中间产物二酰基甘油(DAG)存在下，生理浓度的钙离子才起作用，这是由于DAG能增加PKC对底物亲和力的缘故。磷酯酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)在磷酯酶-C作用下水解生成DAG和IP3。IP3促进细胞内钙离子的释放，在激活PKC过程中与DAG起协同作用。
实验证明，非特异性激动剂PMA(phorbol myristate acetate )直接激活PKC，能与IPC产生一样的保护效果；PKC抑制剂能消除IPC的保护效应，而且能消除KATP通道开放剂介导的缺血预适应效应。因此PKC激活与移位被认为是缺血预适应信号级联反应中的“关键环节”。也有研究显示相反的结论，佛波酯(phorbol esters )激活PKC出现加重低氧损伤已是事实；这可解释为，动物种属不同、模型不同和拮抗剂不同，结果可能不同。
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PKC在IPC中作用机制有两种假说：(1)移位假说(translocation hypothesis)；(2)磷酸化移位假说(phosphorylated translocation hypothesis)，即开始由暂时的PKC移位和保护蛋白的磷酸化。IPC开始阶段是PKC由胞浆向胞膜和胞核移位，此阶段也称记忆阶段，记忆阶段是磷酸化蛋白的积累，随PKC移位的消失和磷酸化蛋白的磷解记忆也消失。
IPC的保护主要是由PKC的激活、蛋白质的磷酸化及其保护蛋白的积累。当短暂缺血和药物刺激后PKC迅速转位，使多种保护蛋白发生磷酸化，这是长时间缺血保护的基础。
本实验观察到，IPC和用药后PKC有转位的现象，IPC组PKC mRNA和蛋白表达明显增强，另外，我们还发现不论是再灌注前给予复方丹参滴丸，还是早、晚期IPC前给予复方丹参滴丸，均可明显促进PKC mRNA和蛋白表达水平增高。说明复方丹参滴丸对心脏缺血的保护可能是通过激活PKC途径而起作用。但PKC激活后能使哪些蛋白质发生磷酸化，并参与了心肌细胞的保护作用，以及复方丹参滴丸激活了PKC的何种亚型是今后需要研究的问题。 (全文完), 百拇医药(高秀梅张伯礼商洪才
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