硫酸鱼精蛋白生物检定法
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《仪器分析法概述》
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硫酸鱼精蛋白生物检定法
本法系比较肝素标准品(S)与供试品(T)延长新鲜兔血或猪、兔血浆凝结时间的程度,以测定供试品的效价。 肝素标准品溶液的配制 精密称取肝素标准品适量，按标示效价加0.9%氯化钠溶 液溶解使成几种不同浓度的溶液，相邻两种浓度每1ml中所含肝素单位数相差应相等,且不超过5个单位，一般可配成每1ml中含85、90、95、100、105、110、115、120、125等单位的溶液。 供试品溶液的配制 供试品如为粉末，精密称取适量,按干燥品计算，加0.9%氯化钠溶液溶解使成每1ml中含1mg的溶液。供试品如为注射液,则按标示量加0.9%氯化钠溶液稀释至同样浓度。 血浆的制备 按肝素生物检定法中血浆制备法制备(附录Ⅻ D)。 检定法 取管径均匀(0.8×3.8cm)清洁干燥的小试管8支,第1管和第8管为空白对照管，加入0.9%氯化钠溶液0.2ml，第2～7管为供试品管，每管均加入供试品溶液0.1ml,再每管分别加入上述一种浓度的肝素标准品稀释液0.1ml,立即混匀。取刚抽出的兔血适量，分别加入上述8支试管内,每管0.8ml，立即混匀，避免产生气泡,并开始计算时间，将小试管置37±0.5℃恒温水浴中,从采动物血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过2分钟；如用血浆,则分别于上述各管中加入0.7ml的血浆，置37±0.5℃恒温水浴中预热5～10分钟，每管分别加入1%氯化钙溶液0.1ml，立即混匀，避免产生气泡,并开始计算时间。观察并记录各管凝结时间。 结果判断 两支对照管的凝结时间相差不得超过1.35倍。在供试品管的凝结时间不超过两支对照管平均凝结时间150%的各管中，以肝素浓度最高的一管作为终点管。 同样重复5次，5次试验测得终点管的肝素浓度,相差不得大于10个单位。5次结果的平均值，即为硫酸鱼精蛋白供试品(干燥品)1mg中和肝素的单位数。
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抗生素微生物检定法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。
培养基及其制备方法 培养基I
胨 5g 琼脂 15～20g 牛肉浸出粉
3g 水 1000ml 磷酸氢二钾 3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅱ 胨 6g 葡萄糖 1g
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牛肉浸出粉 1.5g 琼脂 15～20g
酵母浸出粉 6g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过,加葡萄糖溶解后,摇匀,调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6,在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅲ 胨 5g 磷酸氢二钾
3.68g 牛肉浸出粉 1.5g
磷酸二氢钾 1.32g 酵母浸出粉 3g
葡萄糖 1g 氯化钠 3.5g 水 1000ml
除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。
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培养基Ⅳ 胨 10g 葡萄糖 10g
氯化钠 10g 琼脂 20～30g
枸橼酸钠 10g 水 1000ml
除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅴ 胨 10g 琼脂 15～20g
麦芽糖 40g 水 1000ml
除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高
0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
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培养基Ⅵ 胨 8g
磷酸二氢钾 1g 牛肉浸出粉 3g 葡萄糖 2.5g
酵母浸出粉 5g 琼脂 15～20g 氯化钠 45g
水 1000ml 磷酸氢二钾 3.3g 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4,在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅶ 胨 5g 枸橼酸钠 10g
牛肉浸出粉 3g 琼脂 15～20g
磷酸氢二钾 7g 水 1000ml
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磷酸二氢钾 3g
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。
培养基Ⅷ 酵母浸出粉 1g 琼脂
15～20g 硫酸铵 1g 磷酸盐缓冲液(pH6.0)
1000ml 葡萄糖 5g 混合上述成分，加热溶化后滤过，在115℃灭菌30分钟。
营养琼脂培养基 胨 10g 琼脂 15～20g
氯化钠 5g 肉浸液 1000ml
除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为
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7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。
灭菌缓冲液 磷酸盐缓冲液(pH6.0)
取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH7.8)
取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液(pH10.5)
取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
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菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis)悬液
取枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日,用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)悬液 取短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)悬液
取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
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藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液
取藤黄微球菌[CMCC(B)28001]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面,用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
大肠杆菌(Escherichia coli)悬液
取大肠杆菌[CMCC(B)44103]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。
啤酒酵母菌(Saccharomyces
cerevisiae)悬液
取啤酒酵母菌(9763)的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。
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标准品溶液的制备
标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。
供试品溶液的制备
精密称(或量)取供试品适量，用各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。
双碟的制备 取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基(照表
1)20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃(芽孢可至60℃)，加入规定的试验菌悬液适量(能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm)，摇匀,在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管(内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm)4个(二剂量法)或6个(三剂量法)，用陶瓦圆盖覆盖备用。
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检定法 二剂量法
取照上述方法制备的双碟不得少于4个,在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液,其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径(或面积)，照生物检定统计法(附录ⅩⅣ)中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。
三剂量法
取照上述方法制备的双碟不得少于6个,在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度(S<[3]>)、中浓度(S<[2]>)及低浓度(S<[1]>)的标准品溶液，其余3个小管分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液;三种浓度的剂距为1∶0.8。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径(或面积)，照生物检定统计法(附录ⅩⅣ)中的(3.3)法进行可靠性测验及效价计算。
本法计算所得效价，如低于估计效价的90%或高于估计效价的110%时,则应调整其估计效价，予以重试。
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除另有规定外，本法的可信限率不得大于5%。
表1
抗生素微生物检定试验设计表━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━┯━━━┯━━━━━┯━━━━━━━━━━━
│ │ 培 养 基 │ 灭菌 │抗生素浓度│
培养条件 抗生素类别 │ 试 验
菌 ├───┬─────┤缓冲液│
范 围
├─────┬───── │
│ 编 │ pH值 │pH值 │ │ 温
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度 │ 时 间 │ │ 号 │ │ │
单位/ml │ ℃ │ 小 时
───────┼───────────────┼───┼─────┼───┼─────┼─────┼─────
链霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
0.6～1.6 │ 35～37 │ 14～16
卡那霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16
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阿米卡星 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16
巴龙霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
0.9～4.5 │ 35～37 │ 14～16
核糖霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
2.0～12.0│ 35～37 │ 14～16
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卷曲霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8
│10.0～40.0│ 35～37 │ 14～16
磺苄西林 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅰ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │
5.0～10.0│ 35～37 │ 14～16
去甲万古霉素 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
63501] │ Ⅷ │ 6.0 │ 6.0 │ 9.0～43.7│
35～37 │ 14～16 头孢噻肟钠 │枯草芽孢杆菌[CMCC(B)
, 百拇医药
63501] │ Ⅶ │ 6.5～6.6 │ 6.0 │
0.5～2.2 │ 35～37 │ 14～16
庆大霉素 │短小芽孢杆菌[CMCC(B)
63202] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
2.0～12.0│ 35～37 │ 14～16
红霉素 │短小芽孢杆菌[CMCC(B)
63202] │ Ⅰ │ 7.8～8.0 │ 7.8 │
5.0～20.0│ 35～37 │ 14～16
新霉素 │金黄色葡萄球菌[CMCC(B)
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26003] │ Ⅱ │ 7.8～8.0 │
7.8②│ 4.0～25.0│ 35～37 │ 14～16
四环素 │藤黄微球菌[CMCC(B)
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18
土霉素 │藤黄微球菌[CMCC(B)
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18
美他环素 │藤黄微球菌[CMCC(B)
, 百拇医药
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│10.0～40.0│ 35～37 │ 16～18
金霉素 │藤黄微球菌[CMCC(B)
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│ 4.0～25.0│ 35～37 │ 16～18
多西环素 │藤黄微球菌[CMCC(B)
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│ 4.0～25.0│ 35～37 │ 16～18
氯霉素 │藤黄微球菌[CMCC(B)
, 百拇医药
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│30.0～80.0│ 35～37 │ 16～18
杆菌肽 │藤黄微球菌[CMCC(B)
28001] │ Ⅱ │ 6.5～6.6 │ 6.0
│ 2.0～12.0│ 35～37 │ 16～18
粘菌素 │大肠杆菌[CMCC(B) 44103]
│ Ⅵ │ 7.2～7.4 │ 6.0 │ 614～2344│
35～37 │ 16～18 两性霉素B ①
│啤酒酵母菌 (9763) │ Ⅳ │
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6.0～6.2 │10.5 │ 0.5～2.0 │ 35～37
│ 24～36
━━━━━━━┷━━━━━━━━━━━━━━━┷━━━┷━━━━━┷━━━┷━━━━━┷━━━━━┷━━━━━
① 两性霉素B双碟的制备，用菌层15ml代替两层。
② 含3%氯化钠。 表2
抗生素标准品品种与理论值┏━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━┓┃
标准品品种 │
标准品分子式或品名 │理论计算值
u/mg
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┃┠───────┼────────────────┼────────┨┃链霉素 │(C21H39N7O12)2·3H2SO4
│ 798 ┃┃卡那霉素
│C18H36N4O11·H2SO4 │ 831.6 ┃┃阿米卡星
│C22H43N5O13 │ 1000 ┃┃核糖霉素
│C17H34N4O10·nH2SO4(n<2) │
┃┃新霉素 │硫酸新霉素 │
┃┃庆大霉素 │硫酸庆大霉素
│ ┃┃磺苄西林
│C16H16N2Na2O7S2 │ ┃┃头胞噻肟钠
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│C16H16N5NaO7S2 │ 951.85 ┃┃四环素
│C22H24N2O8·HCl │ 1000 ┃┃土霉素
│C22H24N2O9·2H2O │ 927 ┃┃美他环素
│C22H22N2O8·HCl │ 923.86 ┃┃金霉素
│C22H23ClN2O8·HCl │ 1000 ┃┃多西环素
│C22H24N2O8HCl·1/2C2H5OH·1/2H2O│
866.45 ┃┃红霉素 │C37H67NO13 │
1000 ┃┃氯霉素 │C11H12Cl2N2O5
│ 1000 ┃┃杆菌肽 │杆肽菌
│ ┃┃粘菌素 │硫酸粘菌素
│ ┃┃去甲万古霉素
│C65H73Cl2N9O24·HCl │ 975.23 ┃┃卷曲霉素
│硫酸卷曲霉素 │ ┃┃两性霉素B
│C47H73NO17 │ 1000
┃┗━━━━━━━┷━━━━━━━━━━━━━━━━┷━━━━━━━━┛, 百拇医药