乳酸菌制剂检验法
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| 药品名称 | 乳酸菌制剂检验法 |
| 类别 | 原料药 |
| 全文 | 本试验法包括牛奶凝固力、乳酸鉴别法、活乳酸菌数测定法及鉴别法。 一、牛奶凝固力及乳酸鉴别法1.牛奶培养基的制备取脱脂奶粉,制成1015%的溶液分装于试管中,每管20ml,用115℃蒸汽灭菌20分钟。 2.试验法 (1)牛奶凝固力 取供试品0.1～0.3g，加至牛奶培养基20ml中，摇匀,在37℃培养48小时(必要时可延长至72小时)，同时作两管，作为供试品管，以牛奶培养基为对照管，供试品管的牛奶应呈正常凝固现象(表面无多量乳清分出，凝块均匀稠密结实，无气体产生，无消化现象)。 (2)乳酸鉴别 取上述供试品管和对照管的培养液各1ml，分别注入两支试管 (15×160mm)中，各加10%硫酸溶液3～5滴，振摇，加乙醚约10ml，猛烈振摇，放置数分钟，分别将上层乙醚液倒入两支试管(16×180mm)中，于热水浴中,除去乙醚。 残留物中各加水2ml，摇匀，分别吸取0.2ml置另两支试管中，各加硫酸2ml，摇匀，置水浴中加热2分钟，取出，立刻用冷水冷却，分别滴加10%愈创木酚的乙醇溶液1滴，振摇后,对照管显橙色。 供试品管应显红色。 3.结果的判断 (1)乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈正常凝固现象，供试品优良。 (2)乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈不均匀的凝块，并分出大量乳清,凝块有汽泡及消化现象，表示有杂菌生长，供试品符合规定。 (3)乳酸鉴别试验呈负反应，牛奶呈不正常凝固或者不凝固，供试品不合格规定。 二、活乳酸菌数测定法1.培养基的制备 (1)含糖牛肉汤培养基牛肉浸液(或0.3%牛肉浸膏 1000ml氯化钠 5g胨 10g乳糖 20g取氯化钠、胨、乳糖加入牛肉浸液中，置水浴上加温，搅拌，使完全溶解，放冷至室温，调节pH值使灭菌后为6.0，115℃灭菌20分钟。 (2)含糖牛肉汤琼脂培养基 照含糖牛肉汤培养基处方的基础上,加溴甲酚紫0.06g,再加琼脂使每1000ml中含琼脂15～20g，在水浴上加热使溶解，分装后，115℃灭菌20分钟。 (3)20%碳酸钙混悬液 取极细结晶性的碳酸钙粉末,加水制成20%的混悬液,121℃灭菌20分钟。 2.测定法 (1)供试品稀释液的制备 按无菌操作法，从两个包装供试品中，按各品种项下规定的取样量取样，加入盛有适量灭菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中，振摇均匀，制成1:10的混悬液，用1ml的灭菌吸管稀释制成1:10<2>、1:10<3>、1:10<4>、1:10<5>与1:10<6>等各种稀释度的混悬液，每一稀释度吹洗三次，并更换吸管。 (2)接种与培养 用灭菌吸管吸取每种稀释度的混悬液1ml，吹入灭菌平皿中，每份接种二个平皿。 将20%碳酸钙混悬液置水浴中加温后，摇匀,趁热用灭菌吸管吸取5ml加至已溶化的含糖牛肉汤琼脂培养基100ml中,摇匀，放冷至45～55℃，取10～15ml加至上述已接种供试品稀释液的平皿中，随即转动平皿，使充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平板，在37℃培养72小时后，观察结果。 有透明圈的菌落为乳酸菌。 (3)菌落计算 选取菌落分布均匀、菌落数为30～300个的平皿，计数菌落数。 求得两个平皿的平均菌落数(若两个平皿的菌落数相差一倍以上，需重新试验)，再乘以供试品的稀释倍数，即为每1g乳酸菌制剂所含的活菌数。 三、乳酸菌鉴别法1.运动性检查 (1)培养基 用活乳酸菌数测定法项下含糖牛肉汤培养基。 (2)鉴别法 自活乳酸菌计数的平皿中，选出具有透明圈的各种不同形态的菌落,每种选取两个菌落，分别接种至含糖牛肉汤培养基中，在37℃培养24小时后，应生长发育良好。 取菌液，以悬滴检查法观察，应无运动性。 2.石蕊牛奶凝固试验 (1)石蕊牛奶培养基的制备 取牛奶培养基，每100ml中加入石蕊乙醇溶液2.5ml，混匀，取5～10ml分装于试管中，115℃灭菌20分钟。 (2)试验法 自上项含糖牛肉汤培养液中，取一白金耳菌液，种入5～10ml的石蕊牛奶培养基中，在37℃培养48小时，石蕊应还原为无色，牛奶应呈正常凝固现象，培养基上层表面应呈紫红色环。 3.显微镜检查自上项含糖牛肉汤培养液中取菌液涂片，革兰氏染色后，于油镜下检查，记录其形态和革兰氏染色的颜色。 4.酸度测定及乳酸鉴别试验自上项含糖牛肉汤培养液中取一白金耳菌液，种入牛奶培养基20ml中，另取对照用牛奶培养基20ml，同时在37℃培养48小时后，分别进行酸度测定及乳酸鉴别试验。 酸度测定法 取培养后的牛奶培养基5ml，置100ml的锥形瓶中，加水20ml和酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定至淡红色，并在1分钟内不褪色。 5.接触酶试验自上项含糖牛肉汤培养液中取一白金耳菌液，种于含糖牛肉汤琼脂斜面上，在37℃培养48小时后，将3%过氧化氢溶液滴加于生长的菌落表面上,观察有无汽泡产生，有汽泡则为阳性反应，反之则为阴性反应。 注牛肉浸液 取新鲜牛肉，除去肌腱和脂肪，切细，绞碎后，每1000g加水3000ml,充分搅匀，在2～10℃浸泡20～24小时后，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量,分装,121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。 石蕊乙醇溶液 取石蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加入40%乙醇150ml，煮沸1分钟,倾出上层液，再加入40%乙醇150ml，煮沸1分钟，倾出上层液，与第一次倾出液合并，再加40%乙醇至全量为300ml。 滴加1mol/L盐酸溶液，随加随振摇,至溶液变紫色为止。 pH值应为6.0～6.8。 活乳酸菌计数 如在较小稀释度的培养基中所生长的菌落数量较多,菌落形态相似,呈极小点状或梭状；或在较大稀释度的培养基中菌落形态相似时，可能为乳酸菌生长，照乳酸菌鉴别法项下的悬滴检查法或石蕊牛奶凝固试验法鉴别，如为乳酸球菌，应不计算在内。 |