原发上皮性卵巢癌组织中多药耐药及其相关蛋白基因表达的研究
迄今，在mRNA水平上同时检测多药耐药(MDR)基因和多药耐药相关蛋白(MRP)基因在卵巢癌组织中表达的研究，国内尚未见报道。我们应用半定量、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测了37例原发上皮性卵巢癌(卵巢癌)组织中MDR1和MRP基因表达情况，并对其与癌细胞体外药物敏感(药敏)实验结果、患者临床病理特征及预后的关系进行初步探讨。
一、资料和方法
(一)研究对象
1.卵巢癌患者：1995年3月至1997年7月，在青岛医学院附属医院妇产科住院接受手术，经病理检查证实的卵巢癌患者37例(其中浆液性癌26例，非浆液性癌11例)。患者临床病理特征按FIGO标准。术前未经MDR相关药物治疗，术后均给予顺铂为主的化学治疗(化疗)。37例中，随访了32例，随访率为86%(32/37)。至1998年3月，最长随访33个月，最短8个月。
, 百拇医药
2.正常卵巢组织：供者为同期接受手术的子宫肌瘤患者，在其手术时切除的卵巢，经病理学检查，证实为正常卵巢组织，共10例。
3.正常外周血：供者为自愿献血的正常女性20例。
(二)方法
1.标本制备：(1)标本采集：标本离体后即刻无菌取材，尽快送检。(2)组织单细胞制备：用机械法分离单细胞。(3)外周血单核细胞制备：用Ficoll液常规分离出单核细胞。
2.四甲基偶氮蓝比色法体外药敏实验：按文献报道的方法进行化疗［1］。化疗药物为：长春新碱、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、平阳霉素、更生霉素、鬼臼乙叉甙、氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、噻替哌。
3.RT-PCR检测：(1)RNA的制备：按文献［2］报道的方法进行。(2)PCR引物：MDR1、MRP和β2微球蛋白(β2-MG)基因引物，分别参照文献［2，3］设计，由美国赛百盛生物工程公司合成。扩增片段长度分别为157bp、326bp、114bp。(3)cDNA的合成，应用逆转录试剂盒(美国Promega公司产品)要求的条件进行RNA逆转录。(4)PCR反应：参考Beck等［3］的方法，反应体系为30 μ1，含MgCl21.5 mmol/L，10×PCR反应缓冲液3 μ1，dNTP 0.2 μmol/L，TaqDNA聚合酶1U,引物0.5 μmol/L，逆转录产物3 μ1,加水至30 μ1。热循环参数为：94℃变性15秒，55℃复性30秒，72℃延伸60秒;扩增33个循环,最后72℃延伸5分钟。(5)PCR产物定量：取12 μ1扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并摄相。经U1troscan XL型激光密度扫描仪(瑞典LKB公司产品)扫描底片，用MRP峰面积与β2-MG峰面积的比值表示MRP基因的表达水平，如比值大于或等于全部肿瘤该比值均数者为基因高表达，否则为低表达。如出现157 bp扩增条带者，为MDR1基因阳性表达，不出现则为阴性。
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4.统计学分析：结果分析采用t检验，确切概率法检验和Kandall等级相关分析；用COX回归模型评价MDR1和MRP基因表达与生存期的关系。
二、结果
1.MDR1和MRP基因在卵巢癌和正常卵巢组织中表达情况：37例卵巢癌组织中，11例MDR1基因阳性表达(30%)，正常卵巢组织和外周血MDR1基因则阴性表达。而全部被检标本均有MRP基因表达。卵巢癌、正常卵巢组织和外周血MRP基因表达水平均数分别为1.239±0.687、0.312±0.029和1.023±0.018。卵巢癌与正常卵巢组织比较，差异有显著性(P0.05)。
2.MDR1和MRP基因表达与临床病理特征的关系：37例卵巢癌患者中，各临床期别间MDR1基因阳性表达比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率比较，差异无显著性(P>0.05)。 26例浆液性癌和11例非浆液性癌MDR1基因阳性表达率分别为27%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率分别为38%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)。37例卵巢癌患者中，各组织学级别间MDR1基因阳性表达率比较，差异有显著性(P0.05)。MRP基因高表达14例与低表达23例比较，丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、鬼臼乙叉甙和顺铂对卵巢癌细胞的抑制率分别为(41.28±15.66)%，(62.82±19.26)%；(41.14±16.51)%，(56.79±17.44)%;(32.11±13.24)%,(50.66±14.73)%;(25.72±18.17)%,(43.24±16.11)%;(30.06±20.01)%,(56.64±16.37)%;(59.64±13.14)%,(75.16±14.53)%，差异有显著性(P0.05)。
4.MDR1和MRP基因表达与生存期的关系:经COX回归模型分析发现，MDR1和MRP基因表达均与无进展生存期［手术后行常规妇科检查，盆腔B超检查和(或)CT检查，血清CA125检查，判断病情无进展或无变化的时间］显著相关(P均刘东光 戴淑真 罗兵 王言奎中华妇产科杂志, 百拇医药
一、资料和方法
(一)研究对象
1.卵巢癌患者：1995年3月至1997年7月，在青岛医学院附属医院妇产科住院接受手术，经病理检查证实的卵巢癌患者37例(其中浆液性癌26例，非浆液性癌11例)。患者临床病理特征按FIGO标准。术前未经MDR相关药物治疗，术后均给予顺铂为主的化学治疗(化疗)。37例中，随访了32例，随访率为86%(32/37)。至1998年3月，最长随访33个月，最短8个月。
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2.正常卵巢组织：供者为同期接受手术的子宫肌瘤患者，在其手术时切除的卵巢，经病理学检查，证实为正常卵巢组织，共10例。
3.正常外周血：供者为自愿献血的正常女性20例。
(二)方法
1.标本制备：(1)标本采集：标本离体后即刻无菌取材，尽快送检。(2)组织单细胞制备：用机械法分离单细胞。(3)外周血单核细胞制备：用Ficoll液常规分离出单核细胞。
2.四甲基偶氮蓝比色法体外药敏实验：按文献报道的方法进行化疗［1］。化疗药物为：长春新碱、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、平阳霉素、更生霉素、鬼臼乙叉甙、氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、噻替哌。
3.RT-PCR检测：(1)RNA的制备：按文献［2］报道的方法进行。(2)PCR引物：MDR1、MRP和β2微球蛋白(β2-MG)基因引物，分别参照文献［2，3］设计，由美国赛百盛生物工程公司合成。扩增片段长度分别为157bp、326bp、114bp。(3)cDNA的合成，应用逆转录试剂盒(美国Promega公司产品)要求的条件进行RNA逆转录。(4)PCR反应：参考Beck等［3］的方法，反应体系为30 μ1，含MgCl21.5 mmol/L，10×PCR反应缓冲液3 μ1，dNTP 0.2 μmol/L，TaqDNA聚合酶1U,引物0.5 μmol/L，逆转录产物3 μ1,加水至30 μ1。热循环参数为：94℃变性15秒，55℃复性30秒，72℃延伸60秒;扩增33个循环,最后72℃延伸5分钟。(5)PCR产物定量：取12 μ1扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并摄相。经U1troscan XL型激光密度扫描仪(瑞典LKB公司产品)扫描底片，用MRP峰面积与β2-MG峰面积的比值表示MRP基因的表达水平，如比值大于或等于全部肿瘤该比值均数者为基因高表达，否则为低表达。如出现157 bp扩增条带者，为MDR1基因阳性表达，不出现则为阴性。
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4.统计学分析：结果分析采用t检验，确切概率法检验和Kandall等级相关分析；用COX回归模型评价MDR1和MRP基因表达与生存期的关系。
二、结果
1.MDR1和MRP基因在卵巢癌和正常卵巢组织中表达情况：37例卵巢癌组织中，11例MDR1基因阳性表达(30%)，正常卵巢组织和外周血MDR1基因则阴性表达。而全部被检标本均有MRP基因表达。卵巢癌、正常卵巢组织和外周血MRP基因表达水平均数分别为1.239±0.687、0.312±0.029和1.023±0.018。卵巢癌与正常卵巢组织比较，差异有显著性(P0.05)。
2.MDR1和MRP基因表达与临床病理特征的关系：37例卵巢癌患者中，各临床期别间MDR1基因阳性表达比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率比较，差异无显著性(P>0.05)。 26例浆液性癌和11例非浆液性癌MDR1基因阳性表达率分别为27%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率分别为38%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)。37例卵巢癌患者中，各组织学级别间MDR1基因阳性表达率比较，差异有显著性(P0.05)。MRP基因高表达14例与低表达23例比较，丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、鬼臼乙叉甙和顺铂对卵巢癌细胞的抑制率分别为(41.28±15.66)%，(62.82±19.26)%；(41.14±16.51)%，(56.79±17.44)%;(32.11±13.24)%,(50.66±14.73)%;(25.72±18.17)%,(43.24±16.11)%;(30.06±20.01)%,(56.64±16.37)%;(59.64±13.14)%,(75.16±14.53)%，差异有显著性(P0.05)。
4.MDR1和MRP基因表达与生存期的关系:经COX回归模型分析发现，MDR1和MRP基因表达均与无进展生存期［手术后行常规妇科检查，盆腔B超检查和(或)CT检查，血清CA125检查，判断病情无进展或无变化的时间］显著相关(P均刘东光 戴淑真 罗兵 王言奎中华妇产科杂志, 百拇医药
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