体外培养的人牙乳头间充质细胞的矿化特征
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陈新格 肖明振 倪龙兴 刘军(第四军医大学口腔医学院，陕西西安)
摘要 目的：观察体外培养的人牙乳头间充质细胞矿化特征，深入研究成牙本质细胞的分化和牙本质形成。方法：第4代人牙乳头间充质细胞连续培养35d后，进行组织学染色，透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察。结果：人牙乳头间充质细胞可出现复层生长和形成矿化结节；von Kossa染色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积；细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出现典型的矿化影像。结论：体外培养的人牙乳头间无质细胞的矿化过程可能与基质小泡有关。
关键词 牙乳头；间充质；基质小泡
牙乳头间充质细胞(dental papilla mesenchymal cells,DPMC)作为牙胚发育过程中唯一具有分化为成牙本质细胞能力的间充质细胞群，是研究牙齿发育特别是牙本质形成的重要模型。本实验观察本外培养的人DPMC矿化特征，为研究人DPMC的分化和矿化及春影响因素探讨新的方法。
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1、材料和方法
1、1材料
DMED培养基(Gibco,USA)；胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)；β-磷酸甘油(Sigma,USA)：L-抗环血酸(Sigma,USA)；胰蛋白酶(Gibco;USA)；24孔细胞培养板(Gibco,USA);YMT-Z型倒置显微镜(Olympus;Janpan);CO2孵箱(Forma Scientific,USA);YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)。
1、2方法
1、2、1细胞培养
牙乳头组织取自合法水囊引产的7月龄男胎，用组织块法进行原代细胞培养，取生长良好的第4代人DPMC，用2.5g/L县酶消化后，以2×103/L细胞浓度接种于铺有无菌盖玻片(6mm×6mm)的24孔板中，在含150ml/L FCS、10mmol/Lβ-磷酸甘油和50mg/L抗环血酸的DMEM培养液中连续培养35d，每组4孔。倒置显微镜观察细胞生长情况，3-4d换液1次。标准环境下培养。
, 百拇医药
1、2、2组织学染色
用常规von Kossa染色法对培养细胞进行染色。将载有细胞的盖玻片自24孔培养板中取出，PBS洗3遍，丙酮固定，含50g/L AgNO2的福尔马林液还原2min，蒸馏水清洗，用红复杂胞核。为排除von Kossa染色的假阳性，抽查von Kossa染色阳性实验组的标本。
1、2、3透射电镜(TEM)和扫描是镜(SEM)观察。
35d后，用0.01mol/L(pH7.2)PBS稍浸洗，30mol/L戊二醛液4℃下固定1h，10g/L四氧化锇液后固定1h，0.1mol/LPBS清洗3次，每次5min，300~1000g/L梯度丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋液浸20min，显微镜下选取结节原位包埋<1>，常规制作超薄切片，经醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色后，透射电镜观察。或用30ml/L戊二醛固定后，乙晴梯度脱水，临界界点干燥，扫描电镜观察。
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2、结果
2.1细胞生长情况
人DPM在边疆培养中仍保持成纤维细胞样形态，圆型或椭圆形细胞核位于细胞中央，核仁清楚。在培养在第9天后，细胞接触融合，呈现旋涡状生长和复层生长；融合后5~7d，倒置显微镜下可见团状区域扩大，密度增高，边界不清，形态各异；随着培养时间延长，细胞继续分裂增殖，结节逐渐增大并互相融合，肉眼呈现白色点状，倒置显微镜下呈白色团状(图1)。
2.2钙盐染色
将连续培养35d的两组细胞进行von Kossa染色。阳性区与肉眼观察的白色点状物和镜下见的白色团块相吻合。阳性中央区为深褐色，周围逐渐变浅。各组细胞结节的von Kossa染色结果与茜素红S染色一致。提示细胞结节中有明显的钙盐沉积(图2)。
2.3TEM观察结果
, 百拇医药
连续培养的人DPMC超微结构基本相似，但结节区细胞与正常人DPMC相比，存在一些特殊的形态结构。细胞的胞浆内可见大量高尔基氏器位于中央区，其成熟面有密度不等的泡状结构；有时可见细胞呈长柱状，有大量的粗面内质网和线粒体沿细胞长轴分布；还可见极化的细胞核；胞间基质中可见胶原纤维呈束状排列，并有致密小体的泡状结构，类似于基质小泡(图3)。部分基质小泡开始有钙盐沉积。
2.4SEM观察结果
细胞矿化结节呈电子高密度致密团块状，形态不规则，中心部密度最高，周围逐渐降低(图4)。
3、 讨论
某些细胞在体外培养时具有矿化能力，不仅表明这些细胞保持了良好的体内功能，同时，也为研究细胞的矿化功能提供了良好的体外实验模型。
本组观察了人DPMC在用含抗坏血酸和β-磷酸甘油的DMEM培养基连续培养时的生长特性和矿化能力，发现人DPMC可出现复层生长和形成矿化结节；von Kossa染色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积；细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出人型的矿化影像。 Bouriver等<2-6>观察体外牙髓细胞的矿化特征认为，细胞复导生长的能力是形成细胞结节的先决条件，而细胞结节所具有的在维结构似乎又是形成钙化的先决条件。这些学者在对细胞结节进行矿化特征的研究中发现：结节钙盐染色为阳性，基质中可见针状小晶体及含这些小体的泡状结构；细胞内有发育良好的高尔基氏器、粗面内质网和极化的细胞核。这种细胞被认为是分化中的前成牙本质细胞，其矿化方式可能与基质小泡有关。郝建军<7>在研究体外培养的人牙乳头细胞矿化特征时发现：人牙乳头细胞在体外有较强的矿化能力，搞坏血酸和β-磷酸甘油对于人牙乳头细胞结节的矿化是必不可少的；但由于细胞钙化形成的晶体不成熟，量少且晶粒小，认为体外培养的人牙乳头细胞的矿化能力有限。本实验出现的细胞矿化结书和超微结构特征与文献报道的相似，提示体外培养的人DPMC具有复层生长和矿化能力，可向成牙本质样细胞分化。
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细胞结节的矿化过程，可能与基质小泡有关。基质膜泡是由无定形物质构成的圆形小体，位于细胞内或细胞外，其内容物为精蛋白，被膜的外层由酸性蛋白多糖构成，ALPase是其最有代表性的标志物。基质膜抱中的高钙高于浓度和外膜ALPase均表明基质膜泡在矿化的早期起着重要的作用，组织或细胞中出现的基质膜泡是钙化活动重要的超微结构影像。质膜抱可能来自变性细胞的分裂物，通常是钙化的起始点<8-9>。本文透射电镜观察发现，胞间基质中可见胶原纤维呈束状排列，并有致密小林的泡状结构，类似于基质小泡，部分基质小泡开始有钙盐沉积。目前认为牙本质的形成是两个连续的过程；有机胶原基质的形成及基质的矿化。成牙本质细胞一边形成牙本质基质，一边形成一些基质小泡。这些小池被分泌到牙本质基质中。细胞外小泡内含有微小的磷灰石结晶，以后晶体长大，小泡膜破裂，泡内的晶体便成簇地分散到前期牙本质的基质中。晶体继续长大并相互进合，最后使前期牙本质的基质矿化。本文结果提示，体外培养的人DPMC矿化过程可能与基质小泡有关，但影响细胞结书形成及矿化的因素有待于进一步研究。
, http://www.100md.com 参考文献
1、Baliou RJ, Simpson WG. A convenient method for in situprocessing of cultured cells for cytochemical localization by electron microscopy .J Pathol, 1985,147: 223
2、Bouvier M, Joffre A, Manlier H. In vitro mineralization of a three-dimensional collagen matrix by human dental pulp cells in the presence of chondroitin sulphate. Archs Oral Biol, 1990,35(4): 301.
3、Nakashinma M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Archs Oral Biol, 1991,36:655.
, 百拇医药
4、Tsukamoto Y, Fukutani S, Shinike T. et al . Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Archs Oral Biol, 1992,37:1045.
5、Hayashi Y, Imai M, Goto Y, et al. Pathological mineralization on a serially massaged cell line from rat pulp. J Oral Pathol Med, 1993,22:175.
6、彭彬，樊明文，体外人牙髓细胞的矿化特征，中华口腔医学杂志，1997：32(5)：2.
7、郝建军，激素和生长因子与牙乳头细胞、牙髓细胞、牙胚分化和矿化关系的体外实验研究<学位论文>西安：第四军医大学，1997。29.
8、Bonucci E. Matrix vesicles: There role in calicification, In: Linde A,ed . Dentin and dentinogenesis. Florida:CRC Press,1984.Vol 1.135.
9、Goldberg M. Septier D, Lecolle S,et al .Dental mineralization. Int J Dev Biol, 1995,39(1): 69., http://www.100md.com
摘要 目的：观察体外培养的人牙乳头间充质细胞矿化特征，深入研究成牙本质细胞的分化和牙本质形成。方法：第4代人牙乳头间充质细胞连续培养35d后，进行组织学染色，透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察。结果：人牙乳头间充质细胞可出现复层生长和形成矿化结节；von Kossa染色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积；细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出现典型的矿化影像。结论：体外培养的人牙乳头间无质细胞的矿化过程可能与基质小泡有关。
关键词 牙乳头；间充质；基质小泡
牙乳头间充质细胞(dental papilla mesenchymal cells,DPMC)作为牙胚发育过程中唯一具有分化为成牙本质细胞能力的间充质细胞群，是研究牙齿发育特别是牙本质形成的重要模型。本实验观察本外培养的人DPMC矿化特征，为研究人DPMC的分化和矿化及春影响因素探讨新的方法。
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1、材料和方法
1、1材料
DMED培养基(Gibco,USA)；胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)；β-磷酸甘油(Sigma,USA)：L-抗环血酸(Sigma,USA)；胰蛋白酶(Gibco;USA)；24孔细胞培养板(Gibco,USA);YMT-Z型倒置显微镜(Olympus;Janpan);CO2孵箱(Forma Scientific,USA);YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)。
1、2方法
1、2、1细胞培养
牙乳头组织取自合法水囊引产的7月龄男胎，用组织块法进行原代细胞培养，取生长良好的第4代人DPMC，用2.5g/L县酶消化后，以2×103/L细胞浓度接种于铺有无菌盖玻片(6mm×6mm)的24孔板中，在含150ml/L FCS、10mmol/Lβ-磷酸甘油和50mg/L抗环血酸的DMEM培养液中连续培养35d，每组4孔。倒置显微镜观察细胞生长情况，3-4d换液1次。标准环境下培养。
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1、2、2组织学染色
用常规von Kossa染色法对培养细胞进行染色。将载有细胞的盖玻片自24孔培养板中取出，PBS洗3遍，丙酮固定，含50g/L AgNO2的福尔马林液还原2min，蒸馏水清洗，用红复杂胞核。为排除von Kossa染色的假阳性，抽查von Kossa染色阳性实验组的标本。
1、2、3透射电镜(TEM)和扫描是镜(SEM)观察。
35d后，用0.01mol/L(pH7.2)PBS稍浸洗，30mol/L戊二醛液4℃下固定1h，10g/L四氧化锇液后固定1h，0.1mol/LPBS清洗3次，每次5min，300~1000g/L梯度丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋液浸20min，显微镜下选取结节原位包埋<1>，常规制作超薄切片，经醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色后，透射电镜观察。或用30ml/L戊二醛固定后，乙晴梯度脱水，临界界点干燥，扫描电镜观察。
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2、结果
2.1细胞生长情况
人DPM在边疆培养中仍保持成纤维细胞样形态，圆型或椭圆形细胞核位于细胞中央，核仁清楚。在培养在第9天后，细胞接触融合，呈现旋涡状生长和复层生长；融合后5~7d，倒置显微镜下可见团状区域扩大，密度增高，边界不清，形态各异；随着培养时间延长，细胞继续分裂增殖，结节逐渐增大并互相融合，肉眼呈现白色点状，倒置显微镜下呈白色团状(图1)。
2.2钙盐染色
将连续培养35d的两组细胞进行von Kossa染色。阳性区与肉眼观察的白色点状物和镜下见的白色团块相吻合。阳性中央区为深褐色，周围逐渐变浅。各组细胞结节的von Kossa染色结果与茜素红S染色一致。提示细胞结节中有明显的钙盐沉积(图2)。
2.3TEM观察结果
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连续培养的人DPMC超微结构基本相似，但结节区细胞与正常人DPMC相比，存在一些特殊的形态结构。细胞的胞浆内可见大量高尔基氏器位于中央区，其成熟面有密度不等的泡状结构；有时可见细胞呈长柱状，有大量的粗面内质网和线粒体沿细胞长轴分布；还可见极化的细胞核；胞间基质中可见胶原纤维呈束状排列，并有致密小体的泡状结构，类似于基质小泡(图3)。部分基质小泡开始有钙盐沉积。
2.4SEM观察结果
细胞矿化结节呈电子高密度致密团块状，形态不规则，中心部密度最高，周围逐渐降低(图4)。
3、 讨论
某些细胞在体外培养时具有矿化能力，不仅表明这些细胞保持了良好的体内功能，同时，也为研究细胞的矿化功能提供了良好的体外实验模型。
本组观察了人DPMC在用含抗坏血酸和β-磷酸甘油的DMEM培养基连续培养时的生长特性和矿化能力，发现人DPMC可出现复层生长和形成矿化结节；von Kossa染色提示细胞结节中有明显的钙盐沉积；细胞可出现与成牙本质细胞相似的超微结构特征并出人型的矿化影像。 Bouriver等<2-6>观察体外牙髓细胞的矿化特征认为，细胞复导生长的能力是形成细胞结节的先决条件，而细胞结节所具有的在维结构似乎又是形成钙化的先决条件。这些学者在对细胞结节进行矿化特征的研究中发现：结节钙盐染色为阳性，基质中可见针状小晶体及含这些小体的泡状结构；细胞内有发育良好的高尔基氏器、粗面内质网和极化的细胞核。这种细胞被认为是分化中的前成牙本质细胞，其矿化方式可能与基质小泡有关。郝建军<7>在研究体外培养的人牙乳头细胞矿化特征时发现：人牙乳头细胞在体外有较强的矿化能力，搞坏血酸和β-磷酸甘油对于人牙乳头细胞结节的矿化是必不可少的；但由于细胞钙化形成的晶体不成熟，量少且晶粒小，认为体外培养的人牙乳头细胞的矿化能力有限。本实验出现的细胞矿化结书和超微结构特征与文献报道的相似，提示体外培养的人DPMC具有复层生长和矿化能力，可向成牙本质样细胞分化。
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细胞结节的矿化过程，可能与基质小泡有关。基质膜泡是由无定形物质构成的圆形小体，位于细胞内或细胞外，其内容物为精蛋白，被膜的外层由酸性蛋白多糖构成，ALPase是其最有代表性的标志物。基质膜抱中的高钙高于浓度和外膜ALPase均表明基质膜泡在矿化的早期起着重要的作用，组织或细胞中出现的基质膜泡是钙化活动重要的超微结构影像。质膜抱可能来自变性细胞的分裂物，通常是钙化的起始点<8-9>。本文透射电镜观察发现，胞间基质中可见胶原纤维呈束状排列，并有致密小林的泡状结构，类似于基质小泡，部分基质小泡开始有钙盐沉积。目前认为牙本质的形成是两个连续的过程；有机胶原基质的形成及基质的矿化。成牙本质细胞一边形成牙本质基质，一边形成一些基质小泡。这些小池被分泌到牙本质基质中。细胞外小泡内含有微小的磷灰石结晶，以后晶体长大，小泡膜破裂，泡内的晶体便成簇地分散到前期牙本质的基质中。晶体继续长大并相互进合，最后使前期牙本质的基质矿化。本文结果提示，体外培养的人DPMC矿化过程可能与基质小泡有关，但影响细胞结书形成及矿化的因素有待于进一步研究。
, http://www.100md.com 参考文献
1、Baliou RJ, Simpson WG. A convenient method for in situprocessing of cultured cells for cytochemical localization by electron microscopy .J Pathol, 1985,147: 223
2、Bouvier M, Joffre A, Manlier H. In vitro mineralization of a three-dimensional collagen matrix by human dental pulp cells in the presence of chondroitin sulphate. Archs Oral Biol, 1990,35(4): 301.
3、Nakashinma M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Archs Oral Biol, 1991,36:655.
, 百拇医药
4、Tsukamoto Y, Fukutani S, Shinike T. et al . Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Archs Oral Biol, 1992,37:1045.
5、Hayashi Y, Imai M, Goto Y, et al. Pathological mineralization on a serially massaged cell line from rat pulp. J Oral Pathol Med, 1993,22:175.
6、彭彬，樊明文，体外人牙髓细胞的矿化特征，中华口腔医学杂志，1997：32(5)：2.
7、郝建军，激素和生长因子与牙乳头细胞、牙髓细胞、牙胚分化和矿化关系的体外实验研究<学位论文>西安：第四军医大学，1997。29.
8、Bonucci E. Matrix vesicles: There role in calicification, In: Linde A,ed . Dentin and dentinogenesis. Florida:CRC Press,1984.Vol 1.135.
9、Goldberg M. Septier D, Lecolle S,et al .Dental mineralization. Int J Dev Biol, 1995,39(1): 69., http://www.100md.com