第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用
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《免疫细胞化学》
在自身免疫性疾病的诊断中，目前常常用免疫细胞化学技术检查相应的自身抗体作为重要诊断依据之一，并以此探讨自身免疫性疾病发生的免疫机理。
用免疫荧光法可以检查的自身抗体日益增多，具有器官特异性的自身抗体如甲状腺球蛋白抗体和甲状腺微粒体抗体，甲状腺第二胶质抗体，肾上腺抗体，胃壁细胞抗体，皮肤表皮间粘合质（Intercellular Cement of epidermis）抗体和基底细胞层抗体，唾液腺导管细胞抗体，胰岛细胞抗体，肾小球基底膜抗体，结肠粘膜上皮多糖物质抗体，精子抗体，卵巢抗体，胃G细胞抗体等。
用免疫荧光法可以检查出的非器官特异性自身抗体，有抗核抗体，平滑肌抗体，线粒体抗体、横纹肌抗体、神经髓鞘（外周）抗体、抗网状纤维抗体等。
还有报告用免疫荧光法检查血细胞自身抗体如抗白细胞（淋巴细胞）、红细胞，血小板抗体等。
一、抗核抗体（Antinuclear antibodies, ANA）的检测 Friou等（1957）首先用免疫荧光法检查出存在于SLE病人血清中的NAN，Alexander和Duthie（1958）证实了Friou等的结果。 Friou等（1958）检查了28例SLE病人血清中有27例ANA阳性。一例阴性属临床长期不活动性病人。以后大量报告都指出用免疫荧光间接法检查ANA对于临床诊断SLE有重要价值，其阳性率在80%～100%之间，阳性对于SLE病有确诊价值，但阴性不能完全排除SLE，因为少数活动性SLE其ANA可能维持阴性，Fessel氏认为可能是一种亚型。正常人0%～4%，类风湿关节炎、皮肌炎、硬皮病、sjogeren’s综合征，混合性结缔组织病、慢性活动性肝炎等多种疾病也呈不同程度的ANA阳性率，ANA可能是一种自身免疫反应的一个重要指标。ANA在各种疾病中的百分率见表15-1。
表15-1 抗核抗体在各种疾病中的百分率
临床诊断
人次
阳性率（%）
临床诊断
人次
阳性率（%） SLE
61
98.5 Grave’s病
15
23.5 SLE（？）
14
57.1
风湿病
30
23.3 DLE
19
52.6
风湿性心肌炎
54
20.3
类风湿病
66
31.8
心肌炎
145
8.3
皮肌炎
21
60.6
病毒性心肌炎
25
24.0
重症肌无力
9
66.6
冠心病
281
3.6
甲状腺炎（桥本氏病）
24
29.1
心肌梗塞
17
35.4
亚急性甲状腺炎
15
40.0
心肌病
42
16.6 I130治疗后甲亢
46
32.6
糖尿病
37
24.3
甲状腺机能亢进（甲亢）
300
22.0
慢性萎缩性胃炎
96
8.3
甲状腺机能低下（甲低）
17
23
胃炎
36
0
结缔组织病
13
59.2
胃溃疡
23
0
疑为自身免疫性疾病
869
23.5
胃癌
35
11.4
急性肝炎
82
22.7
非特异性溃疡性结肠炎
11
54.5
乙型肝炎
82
65.8
十二指肠溃疡
8
37.5
慢性肝炎（HBsAg）
132
27.3 HBsAg带菌者
23
4.3
慢性活动性肝炎
9
77.7
慢性气管炎
791
20.8
慢性迁延性肝炎
44
19.1
过敏性紫斑
3
0
肝硬化
61
27.3
烧伤
12
0
胆汁性肝硬化
3
0
高脂血症
6
0
肝癌
18
27.7 Adison’s病
3
0
肝黄萎缩
27
18.5
雷诺氏病
3
2例阳性
地方性甲状腺肿
21
28.6
扁平苔藓
11
0
地方甲状腺肿手术后
25
0
正常对照
281
5.3 Hargraves对狼疮细胞（1948）已进行了大量的研究，证明引起狼疮细胞发生的因子，为抗核成分的抗体。抗核抗体是一组对细胞核内DNA，RNA或组蛋白、或这些物质的分子复合物的自身抗体，目前发现至少有十七种。这些抗核抗体对于结缔组织病的致病病因的探讨和临床诊断均有重要帮助。这
些结缔组织病各有不同的抗核抗体谱（Antinuclear Antibodies profile）。
目前，国内已建立了11种测定方法，提高了结缔组织病的诊断水平。
用作检查ANA的抗原很多，如鸡的红细胞核，人白细胞，皮肤，甲状腺、脾脏、淋巴瘤、胸腺、肾、羊膜细胞、颊细胞等，还有Hela细胞，大小白鼠的肝和肾冰冻切片（4～6μm）等，以成年小白鼠的肝切片最为常用。用动物细胞核作抗原，可以避免血型的干扰因素。Konice氏等（1978）报告用马疫锥虫（Trypanosoma equiperdum, TE）作抗原测定SLE病人血清中抗双链DNA
（dsDNA）因TE的核和动基体为不含蛋白的纯dsDNA，抗原性纯一，特异性强，不需提纯，为天然的dsDNA底物，据认为抗dsDNA抗体为SLE所特有，一些研究指出dsDNA抗体与SLE病情活动及狼疮肾炎的发病机理有密切关系，持续高滴度的抗dsDNA抗体是狼疮肾炎的不祥之兆。
1．抗核抗体的荧光形态及临床意义 ANA的荧光形态和其相应抗原有密切关系，ANA的抗原性质和自身免疫性疾病有关，所以，观察荧光形态与临床诊断可能有一定联系。
（1）周边型（或称核周型）：可见荧光以核边缘强，核轮鲜明，靠核膜的荧光呈绒毛状，核中心荧光弱或无。这是天然DNA或去氧核糖蛋白的抗体产生的一种荧光形态，肝细胞核，肾小管上皮细胞核和鸡红细胞核较典型。常见于活动性系统性红斑狼疮病人血清中。药物引起的狼疮样综合征也常出现。这些病人病情严重，肾受累的约占56%，与疾病进行性发展和狼疮细胞现象密切相关。
（2）均质型（或称弥散型）：可见全核呈均匀一致的黄绿色荧光，核轮廓明确。血清中这种抗体用脱氧核糖蛋白吸收可以消除。证明是由核蛋白抗体（主要是IgG类）与核中脱氧核糖蛋白反应的结果。此种荧光形态常见于活动性系统性红斑狼疮病人，偶见于恶性病或结缔组织病。滴度多在1：160以上。如将血清适当稀释即可出现其它染色形态，证明其中尚有其他荧光形态的抗体混在其中。弱阳性均质型意义不明，
供血员有3%～10%的阳性。
（3）斑点型（或称小结型）：核轮廓不鲜明，核内呈斑点状荧光。由核内Sm抗原引起的一种抗体，包括IgG、IgM或IgA三类抗体。当用原血清染色时，斑点呈大团块状，稀释血清时变为分散的斑点状。主要见于硬皮病及肢端动脉痉挛病（雷诺氏病），也见于系统性红斑狼疮。
（4）核仁型：仅是核仁呈现黄绿色荧光，血清中此类抗体较少见。用
肝细胞核和培养细胞作抗原可以检查出来。因血片中粒细胞及正常淋巴细胞中缺乏核仁抗原，检查不出此抗体。此型抗体可有IgG、IgM或IgA类。最常见于系统性硬化症、硬皮病、皮肌炎和 sjogren’s综合征，其他胶原病很少见。
其次，还可见核膜型、结节样网状型等，没有明确的诊断意义。ANA的相应抗原和荧光类型见表15-2。
表15-2 ANA的相应抗原和荧光类型
相应抗原
荧光类型
抗DNA抗体 dsDNA
周边型 SSDNA
周边型 dsDNA+SSDNA
周边型
抗核蛋白抗体
脱氧核蛋白
均质型
组蛋白
均质型
可溶性核抗原（ENA）
斑点型
抗核仁抗体
低分子RNA
核仁型
核糖体系RNA
核仁型
2．ANA的滴度与病情的关系 Tablonska等的研究认为活动期红斑狼疮ANA的滴度在1：160或更高，国内的报告滴度在≥1：80则显示病情的活动性，滴度高是系统性红斑狼疮诊断的依据之一，高滴度与病情活动性相平行。高俊达（1979）对于ANA滴度变化的临床意义研究指出，60例系统性红斑狼疮病人血清中ANA滴度的变化与病情活动性、脏器损害、预后和其他化验指标的关系如下：
（1）ANA滴度在1：80～160以上有80.5%属临床活动性，有89.5%～97.8%缓解期病人在1：160以下。
（2）ANA滴度变化与临床症状是一致关系，但先于疾病的活动而升高，后于症状的缓解而下降。
（3）ANA滴度变化与狼疮细胞、血沉、尿蛋白和血清γ球蛋白含量异常一致。
（4）ANA滴度可作强的松用量的选择参考，ANA滴度在1：160以上者要加紧积极治疗，1：40以下者可减至维持量。 ANA的免疫组织化学检查对于诊断没有皮肤损害的红斑狼疮病帮助更大，取病人的皮肤作冰冻切片，用ANA IgG荧光抗体直接法染色，可见在表皮与真皮连接处显示荧光带。Tuffanelli报告病人有皮肤损害，直接免疫荧光检查ANA的阳性率为90%，在正常皮肤中红斑狼疮病人ANA的阳性率可达56%，而后者在其他疾病极少见，因而有较大的诊断意义。
二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用
目前的研究指出，用免疫细胞化学检查病人血清中的dsDNA抗体为作为系统性红斑狼疮的诊断依据之一。佐佐木毅等和徐世玉等发现一些临床症状和血清学检查不典型的红斑狼疮病人，在发病早期就出现抗dsDNA抗体，认为这可能有助于早期诊断。
1．用马疫锥虫抗原检测抗dsDNA抗体方法
（1）底物制备：用马疫锥虫感染小鼠2～4天后，取小鼠的外周血，按血液细胞计数法作马疫锥虫计数，达到4.3×106～5.6×106时即采尾血涂片，空气干燥后直接使用或4℃保存备用。
（2）方法和结果：血涂片加入少量水溶去红细胞，待干。加入一滴被检血清于其上，移湿盒中，在室温中30～40min，用0.01mol/L pH7.4PBS洗5～10min，取出吸干，加兔抗人IgG荧光抗体，在湿盒中染色30～45min，再按上法洗片，待干，荧光显微镜检查。阳性者可见锥虫的核及动基体发出明亮绿色荧光。
2．用短膜虫抗原检测抗dsDNA抗体方法
（1）底物制备：用北京生物制品研究所制备的短膜虫涂片标本作抗原。
（2）方法和结果：用上述马疫锥虫抗原的间接免疫荧光染色法。短膜虫是一种血鞭毛虫，动基体中含纯净的dsDNA可作为抗原，阳性结果可见虫体近尾或中部有一致密荧光亮点，为
动基体，近头部有一淡绿色亮点，为细胞核。阴性结果动基体上无荧光。阳性血清自1：5稀释，测定效价。
3．用酸洗脱鼠肝细胞抗原检测抗dsDNA抗体方法（参考Ta的方法）
（1）底物准备：将6个月小白鼠剪断上腔静脉，立即用0.01mol/L pH7.4 的PBS从门静脉灌洗至鼠肝发白，取出肝组织剪成接触面为0.15cm×0.5cm的小块，印片，空气中干燥后用丙酮固定10min，再空气干燥。浸入0.1mol/L HCl中洗脱30min，并轻轻的摇动，随后，再用0.15mol/L PBS pH7.4洗2次，每次10min，再用0.01mol/L pH7.6的PBS洗5min，空气干燥。即可用或在4℃中贮存。
（2）方法和结果：用间接免疫荧光法检测，阳性结果可见细胞核呈黄绿色荧光。用酸洗脱鼠肝细胞标本作抗原与马疫锥虫、短膜虫法比较结果，和马疫锥虫法符合率达93%，其中马疫锥虫法4例阳性，为系统性硬皮病，而此法为阴性，说明此法较马疫锥虫法更特异。此法与短膜虫法比较，符合率为95%，P>0.05，说明二法无显著差别。其中此法阳性而短膜虫法阴性的3例，均符合系统性红斑狼疮诊断，并均有肾损害。短膜虫法阳性而此法阴性的6例均为待查病例，不能证实为系统红斑狼疮诊断，说明此法在特异性方面更佳。
三 、抗核仁抗体的检测法
用HEP-2细胞或大鼠肝细胞作抗原，作间接免疫荧光染色。结果可见细胞核核仁呈现明亮的
黄绿色荧光。抗核仁抗体在硬皮病、皮肌炎、系统性硬化症等中最多见。
四、抗组蛋白抗体的检测方法
1．组蛋白的提取方法 取大白鼠肝40g
加入160ml0.01mol/L Ph7.4 Tris HCl缓冲液，制成匀浆后进行浓度梯度离心（27000rpm×60min），沉淀物中加入蒸馏水90ml，再以超声粉碎仪将细胞打碎，离心（3000rpm×15min）取上清液，再加入一定量的1mol/L
硫酸，使硫酸的最终浓度为0.2mol/L,
混匀后，离心（3000rpm×15min），取上清液，加入4～5倍体积的无水乙醇，置于-20℃冰箱3天后，离心（3000rpm×15min）以乙醚洗涤沉淀，真空干燥，储存于-20℃冰箱中备用。
2．酸处理的鼠肾底物
鼠肾冰冻切片（厚度4μm），以丙酮固定后吹干，密封，在-20℃冰箱中储存备用。用前再于0.1mol/L盐酸中浸泡30min，然后再置于0.01mol/L pH7.4PBS中浸泡2次。
3．组蛋白重建的鼠肾底物 在上述酸处理的鼠肾底物上加入30μl乙制备好的组蛋白，稀释浓度为25μl/ml，在室温中湿盒内孵育30min后，以0.01mol/L p7.4PBS浸2次。
4．检测方法 用组蛋白重建的鼠肾底物，做间接免疫荧光测定
。
5．结果 1960年Kunkle首先在SLE中发现抗组蛋白抗体（Antihistone antibody ,AHA），是诊断药物性SLE的一项较好的指标。在活动期SLE中AHA可达90%。
五、抗着丝点抗体的检测方法
1．HEP-2细胞涂片的制备 HEP-2 细胞系人喉癌上皮细胞，在完全Eagle培养液中，37℃，二氧化碳孵育48～72h，使细胞生长达到一定数量，约1.2～1.5×106/ml，经胰酶消化后，可以传代或分装到置有玻片的培养皿中，继续用Eagle液培养及上述条件孵育，48h细胞不仅贴附于玻片上并已长成单细胞层。取出玻片用丙酮固定15min，自然干燥后待用，或保存于-20℃或4℃中。
表15-3 各种抗核抗体及临床意义
抗体名
别名
临床意义
抗Sm抗体 SLE标记抗体，阳性率15～28%，常伴抗RNP抗体，有补体减少及肾受累
抗RNP抗体
抗U1-snRNP抗体
抗MO抗体
各种自身免疫病均可出现 ，单独高效价见于混合结缔组织病（MCTD）。
抗SS-B抗体
抗La抗体
干燥综合征的标记抗体（27%）
抗Ha抗体 SLE 5%，
同时抗SS-A阳性
抗SS-A抗体
抗RO抗体
干燥综合征为78%阳性，SLE49%系统性硬皮病23%
抗Scl-70抗体
抗Og抗体
系统性硬皮病的标记抗体44%
抗Scl-86抗体
抗Scl-抗体
阳性系统性硬皮病进行性。局部者阴性。
抗Ki抗体 SLE特有12%阳性。
抗PCNA抗体
抗Ne抗体 SLE阳性1%。
抗JO-1抗体
多发性肌炎的标记抗本（24%），阳性者多有肺病变
抗KO-1抗体
多发性肌炎60%
抗PM-1抗体
多见于系统性硬皮症（55%）
抗Ma抗体
分类不明的胶原病
抗MOS抗体
同上
抗RANA抗体
抗SS-C抗体
类风湿性关节炎80%～90%
抗dsDNA抗体 SLE所特有60%
抗ssDNA抗体
见于各种胶原病
注：Sm（Smith）；RNP：核糖核蛋白；Sn：为小核；SSB：干燥综合征B；SS-A：干燥综合征-A，Scl-70：硬皮病70，抗原分子量70000； PCNA：增殖细胞抗原；PM-1：多发性肌炎-；RANA：类风湿性关节核抗原；dsDNA：双链DNA；ssDNA：单链DNA。
2．染色方法 用间接免疫荧光法。
3．结果 着丝点抗原是紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质，当与相应抗体结合后荧光图型为约46个圆的荧光亮点。国际上多用HEP-2细胞，因这种细胞核大，分裂相旺盛，着丝点容易显露，这种抗体在进行性系统性硬化症（PSS）中阳性率可达31%～98%，是PSS的CREST型的标记抗体，CRESF是指具有软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，毛细血管扩张的PSS患者。
六、抗甲状腺自身抗体（Thyroid Autoantiodies）的检测方法 Roitt等（1956）和Witebsby等（1957）就发现桥本氏病人血清中有对甲状腺提取的抗体活性，后来White（1957）首次用间接免疫荧光染色方法研究桥本氏病人血清存在对甲状腺胶质（thyroid colloid）的抗体获得成功。此后，Landing等（1958）和Holbrow等（1959）以不固定的甲状腺切片作抗原。检查出慢性甲状腺炎（Chronie thyroiditis）病人血清中有和细胞浆结合而呈现明亮染色的抗体。Blizzard等（1960）, Doniach 等（1960）发现第二胶质抗体，血高γ球蛋白，沉淀素阴性，鞣酸细胞血凝试验阴性，抗甲状腺微粒体补体结合试验阴性。Balfoour等（1961）用免疫荧光法研究一些甲状腺病人时总结指出：甲状腺胶质抗体有三种不同的荧光形态：一种是呈三维状云絮状，是一种血清沉淀素阳性产生的抗甲状腺球蛋白抗体。另一种是胶质部分荧光呈裂纹形，胶质无明显阳性荧光，
而胶质边缘和裂纹处呈明亮荧光，鞣酸化细胞血凝反应阳性，沉淀素反应阴性。第三种即上述的胶质呈均匀荧光形状，证实这是一种称第二胶质的抗体。近30多年的研究证明免疫荧光方法检查甲状腺自身抗体是一个特异、敏感、简便的方法，对于临床诊断和治疗，随访和预后，甲状腺某些疾病的自身免疫性质的发病机理研究等，都有一定的实用价值。我们20年大量研究结果也证明确实如此。用免疫荧光法检查甲状腺自身抗体已成为许多国家中，诊断甲状腺疾病的常规检查项目之一。
检查这种抗体的免疫荧光方法要求取正常人的甲状腺或手术摘出的甲状腺组织，用冰冻节片（3～6μm）用作甲状腺球蛋白抗体检查切片需要经56℃纯甲醇固定3min；用作甲状腺微粒体抗原切片无需固定处理，因固定会破坏微粒体的抗原性。按常规间接方法进行。
关于甲状腺抗体的研究已报告有甲状腺球蛋白抗体，微粒体抗体，第二胶质抗体，甲状腺刺激免疫球蛋白抗体，甲状腺激素T4及T3抗体，细胞表面的促甲状腺激素受体的抗体等。
表15-4 不同甲状腺疾病甲状腺自身抗体的阳性率（%）
诊断
甲状腺上皮微粒体抗体（%）
甲状腺球蛋白抗体（%）
甲状腺抗体总阳性率（%） LATS（%）
桥本氏病
89
78
98
－ Graves’s病
37
85
53
80
原发性甲低
57
52
75
－
正常对照
5
7
6
－
七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测 Johnson（1965）首次用免疫荧光组织化学间接法在狼疮样肝炎病人血清中发现了SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whitingham用病人自身平滑肌作抗原，证实了SMA的自身免疫性
。狼疮性肝炎或慢性活动性肝炎病人血清中SMA的阳性率可达80%以上。Donidht和 Whitehouse先后报告了急生病毒性肝炎病人血清中SMA为IgM，而慢性活动性肝炎病人血清中SMA在发病初期（1～4期）为IgM，而后为IgG。Anderson利用纯化肌浆蛋白为抗原与肝炎病人血清中分离的IgM和IgM类SMA进行吸收试验，证明了SMA的特异性。Holborrow Gamel和 Renbe先后观察了SMA与鼠肝细胞，肾小球及人的甲状腺上皮细胞和血小板等组织为抗原的免疫荧光染色结果，证明这些组织的抗原性均与平滑肌肌动蛋白有着共同性抗原。, http://www.100md.com 参见：
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