血清载脂蛋白的免疫测定(理论书籍)

第十八章血清载脂蛋白的免疫测定

http://www.100md.com 《动脉粥样硬化与生物化学检验》

第十八章血清载脂蛋白的免疫测定

血浆中蛋白质种类繁多，对各种单一蛋白进行快速而又特异的定量。目前公认的方法是免疫测定法，即利用其特异的抗体，采用测定抗原抗体复合物的方式定量。血浆(清)中载脂蛋白是以脂蛋白形式存在的少量蛋白，在解联剂作用下，使载脂蛋白从脂蛋白中分离出来，再利用相应的载脂蛋白抗体进行测定。

载脂蛋白的免疫测定方法很多，目前采用的方法各有其特点，所需条件也有差异，现将医学检验中常用的定量方法作一简要介绍。

第一节血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

一、载脂蛋白测定方法

1.单向免疫扩散法(radial immunodiffusion,RID)

该法较简单，一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清，扩散过程至少24h，最多需72h，测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单，应严格控制有关条件如：含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀；加入小孔的稀释抗原(血清)量要准确；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一，如琼脂糖凝胶浓度在1.5%～2.0%,可能仅测出LDL的ApoB，大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出，因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外，扩散过程中，凝胶板一定要水平，否则易使扩散环呈椭圆形，难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5～10.0mm为宜，应在两个方向测量直径，其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值，测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

2.电免疫测定法(electroimmunoassay,EIA)

该法灵敏，抗血清用量少，如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其电泳时间可缩短一倍，火箭峰高以1～4cm为宜，火箭峰的测量可以计算面积或峰高，峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml，又称为火箭电泳法。

3.免疫比浊法(immunoturbidimetry assay,ITA)

简便快速，在自动分析仪进行操作并能批量检测，是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种：一是测定光散射的，又名免疫散射比浊法(INA)；需用特殊的激光浊度仪；另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度，称为透射免疫比浊法(ITA)，其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定，速率法是根据散射光强度与时间的关系，以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度，后者与溶液中抗原量成正比，常可在1min内完成测定过程，可自动扣除空白；终点法比速率法稳定，一般多用终点法。

4.酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定，可测出ng级水平的抗原或抗体含量，该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

5.放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)

该法灵敏，抗血清用量少，所需设备较多，一般用¹²⁵I标记抗原作为示踪物，除ApoC-Ⅰ(不含酪氨酸)以外，都可以作碘标记(氯胺T法)，以双抗体法测定RIA法可检测最低至3～5ng。临床检验中不常用此法，主要用于动物实验的科学研究工作。

还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

血清载脂蛋白测定的方法，从测定原理、方法学评价及参考值，刘秉文和李健斋等人作了大量的工作，为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB₁₀₀血清，其后，国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并广泛应用于临床的疾病诊断，在部分大医院已成为常规检查项目。

刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值，本节将引用如下比较表：

表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗体	P，M	P，M	P	P，M	P	P
灵敏度(n)	0.3～10	0.1～0.5	100	100	150	100
测定范围(ng)	1～200	0.5～15	100～500	200～800	200～500	200～600
批内CV(%)	3～9	4～8	3～5	6	3～7	1
批间CV(%)	5～10	8～10	3～9	10	6～7	6
正常值(g/L)	1.0±0.2	1.5±0.2	1.2±0.2	1.2±0.1	1.2±0.2	1.7±0.2

P:多克隆抗体；M：单克隆抗体；RIA：放射免疫法；ELISA；酶联免疫法；RID：单向免疫扩散法；INA：免疫散射比浊法；ITA：免疫透射比浊法。

(源自：刘秉文，1995.)

表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗体	P	P，M	P	P	P	P
灵敏度(g)	0.5		20	5	30	20
测定范围(ng)	1～20	5～50	30～60	50～400	50～900	40～150
批内CV(%)	7	8	5	5	5	5
批间CV(%)	9	7	8	-	7	6
正常值(g/L)	0.25±0.4	0.35±0.05	0.76±0.2	0.29±0.02	0.37±0.09	0.36±0.03

(源自：刘秉文，1995.)

表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA
抗体	P	P	P
灵敏度(g)	5	0.2	20
测定范围(ng)	5～50	0.5～8	50～200
批内CV(%)	5	3.60	5
批间CV(%)	7	8	9
正常值(g/L)	0.17±0.03	0.14±0.05	0.14±0.04

(源自：刘秉文，1995.)

表18-4 ApoB₁₀₀免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗体	P，M	P，M	P	P，M	P	P
灵敏度(n)	5～10	2～20	50～300	300	300	300
测定范围(ng)	0～100	2～10	20～500	50～600	300～500	100～500
批内CV(%)	4～8	4～7	1～7	3～7	4～7	2
批间CV(%)	7～11	10	3～10	6～7	7～8	2
正常值(g/L)	0.9±0.2	0.85±0.1	0.6±0.3	0.8±0.2	0.8±0.2	0.8±0.3

(源自：刘秉文，1995.)

表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	INA
抗体	P	P	P
灵敏度(n)	1	5	50
测定范围(ng)	5～30	15～100	-
批内CV(%)	7	3	5
批间CV(%)	9	5	8
正常值(g/L)	0.05±0.03	0.06±0.002	0.06±0.01

(源自：刘秉文，1995.)

表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA	RID	ITA
抗体	P	P	P	P	P
灵敏度(g)	10	0.3	45	40	10
测定范围(ng)	10～80	0.5～5	70～600	40～600	12～50
批内CV(%)	6	3	6.5	2.1	3.3
批间CV(%)	10	8	8.2	3.9	6.2
正常值(g/L)	0.04±0.01	0.033±0.008	0.04±0.002	0.039±0.017	0.04±0.01

(源自：刘秉文，1995.)

表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA	RID	INA	ITA
抗体	P	P	P	P	P	P
灵敏度(g)	1	0.3	10	76	20	15
测定范围(ng)	2～20	1～6	20～80	76～600	50～400	30～120
批内CV(%)	13	4.3	8	2.5	6.3	5.2
批间CV(%)	13	4.3	8	3.5	6.3	5.2
正常值(g/L)	0.15±0.06	0.16±0.03	0.12±0.04	0.127±0.037	0.12±0.03	0.11±0.03

(源自：刘秉文，1995.)

二、人血浆(清)载脂蛋白参考值比较

刘秉文于1995年对国人血浆(清)各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较，其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫测定法的比较

	RIA	ELISA	EIA	RID	ITA
抗体	P	P，M	P	P	P
灵敏度(n)	0.2～8	0.5	20	35	5
测定范围(ng)	0.8～100	0.5～6	20～200	50～300	20～400
批内CV(%)	6	4	8	5.9	2
批间CV(%)	9	8	5	7.2	5
正常值(g/L)	0.05±0.02	0.04±0.01	0.10±0.04	0.035±0.01	0.04±0.01

(源自：刘秉文，1995.)

表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	年龄	均值±s(mg/dl)
张祖辉	1998	RID	307	男	20-77	122.1±13.7
刘秉文			318	女	20-77	125.5±15.9
李键斋等	1986	EIA	291	男+女	19-50	119±17
周新等*	1990	EIA	692	男	13-85	129.1±16.1
	1990	EIA	477	女	18-80	130.5±14.2
Albers等	1976	RID	20	男+女	11.5±7.3	115.7±7.3
Cheung等	1977	RID	172	男	20-65	120±20
Cheung等	1977	RID	188	女	20-65	135±25
Reman等	1978	RID	95	男	40-49	137±23
Reman等	1978	RID	104	女	40-49	137±23
Schonfelcl等	1974	RIA	41	男	13-58	100±35
Schonfelcl等	1974	RIA	34	女	16-58	104±34
Karlin等	1976		23	男	20-39	130±3
Karlin等	1976		19	女	20-39	154±6
Avogaro等	1978	EIA	60	男	20-60	128±22
Avogaro等	1978	EIA	60	女	20-60	134±20
Mordasini等	1980	EIA	50	男	20-60	113±9
Mordasini等	1980	EIA	50	女	20-60	125±17
Miller等	1980	EIA	8	男	34-70	122±27
Miller等	1980	EIA	8	女	52-68	149±20
Rosseneu等	1981	IAN	12	男	29	139±15
Rosseneu等	1981	IAN	14	女	30	147±24
Assmann等	1982	INA	3032	男	20-65	136±23
Assmann等	1982	INA	1367	女	20-60	146±25

(源自：刘秉文，1995)

*：作者补充。

表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	均值±s(mg/dl)
罗静聪	1988	RID	76	男+女	26.7±4.6
刘秉文	1988	ELISA	41	男+女	24.2±5.9
胡维诚	1987	RID	160	男+女	27.0±4.4
Curry等	1976	RID	19	男	78.0±1.7
			19	女	83.0±25
Cheung等	1977	RID	172	男	33.0±5
			188	女	36.0±6
Assmann等	1977	EIA	15	男	34.1±5
			15	女	38.3±5.5
Schonfeld等	1977	RLA	29	男+女	40.5±8.9
Maupovic等	1981	ELA	50	男+女	68.0±18
Goldberg等	1980	RIA	50	男	25.0±1
			50	女	26.0±1
De Backnev等	1982	INA	70	男+女	43.0±6.9
Zech等	1983	RID	27	男+女	24.0±0.6
Noma等	1983	RLA	27	男+女	32.0±8.3
Nukita等	1984	EIA	156	男+女	40.0±9

(源自：刘秉文，1995)

表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	均值±s(mg/dl)
周新等	1986	EIA	608	男	83.2±13.9
			511	女	80.4±13.4
李健斋等	1986	EIA	727	男+女	76±19
吴兆丰、刘秉文	1987	RID	304	男	87.9±14.4
			320	女	86.7±14.4
Albers等	1975	RIA	349	男+女	81.0±20
Bantorich等	1975	RIA	82	男+女	90.0±24
Bedford等	1976	RIA	128	男+女	87.0±30
Schonfeld等	1974	RIA	42	男+女	83.0±16
Brussaard等	1980	EIA	60	男+女	63±16
Fruchart等	1981	EIA	144	男+女	90
Curry等	1978	EIA	38	男	90±2.0
			36	女	88±11
Curry等	1978	RID	20	男+女	87±26
Lees等	1970	RID	64	男+女	83±25
Snuderman等	1975	RID	31	男	82±22
Fievet等	1979	INA	206	男	129±31
			271	女	120±34
Heuck等	1979	INA	68	男+女	82.0±23
Rossenue等	1981	INA	70	男	92±13
Durrington等	1976	INA	29	男+女	85±11

(源自：刘秉文，1995)

表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	均值±s(mg/dl)
傅明德等	1987	ELISA	202	男	7.6±2.5
			214	女	8.0±2.3
Polz等	1980	RID	10	男+女	6.9±2.0
Curry等	1981	ELA	68	男+女	6.0±1.5

(源自：刘秉文，1995)

表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	均值±s(mg/dl)
傅明德等	1987	ELISA	202	男	5.2±1.9
			241	女	4.9±1.8
范萍等	1989	RID	67	男+女	3.9±1.7
Schonfeld等	1979	RIA	93	男+女	3.9±1.4
Curry等	1981	EIA	68	男+女	4.0±2.0
Kashyap等	1977	RIA	32	男+女	5.0±0.4

(源自：刘秉文，1995)

表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	均值±s(mg/dl)
傅明德等	1988	ELISA	134	男	11.6±3.6
			135	女	12.0±3.7
范萍等	1989	RID	67	男+女	12.7±3.7
刘秉文等	1987	IRA	21	男+女	9.2±2.1
Schonfeld等	1979	RID	93	男+女	15.4±6.2
Curry等	1980	ELA	54	男+女	10.9±3.0
Kashyap等	1981	RIA	29	男+女	11.1±0.9

(源自：刘秉文，1995)

表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较

作者	发表时间	方法	例数	性别	均值±s(mg/dl)
刘铭锋、刘秉文等	1987	ELISA	42	男+女	3.57±1.24
刘铭锋、刘秉文等	1987	ELA	50	男+女	4.70±1.18
刘铭锋、刘秉文等	1992	RID	116	男	3.95±0.98
			122	女	4.00±1.32
张东升、夏辉明	1991	ELISA	25	男+女	3.45±1.24
Blum等	1980	RIA	26	男+女	3.6±1.3
Gregg等	1984	RIA	12	男+女	4.8±1.2
Wesgraber等	1984	RIA		男+女	5(3.5-7.0)

(源自：刘秉文，1995)

王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数，如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外，并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录，供参考。

表18-16 血脂与脂蛋白水平(mmol/L)

项目	男(225例)	女(58例)	P值
TC	4.87±0.73	5.16±0.84	<0.05
TG	1.27±0.66	1.25±0.71	>0.05
HDL-C	1.41±0.35	1.54±0.36	<0.02
HDL₂-C	0.56±0.17	0.63±0.19	<0.02
HDL₃-C	0.86±0.23	0.91±0.19	>0.05
LDL-C	2.95±0.68	3.13±0.12	>0.05

(源自:王抒，1996)

表18-17 几项常用比值^*

项目	男	女
LDL-C/HDL-C	2.21±0.72	2.16±0.80
HDL₂-C/HDL₃-C	0.66±0.12	0.69±0.15
ApoB/ApoAⅠ	0.72±0.16	0.74±0.17
ApoAⅠ/ApoAⅡ	4.10±0.65	4.10±0.68
ApocⅡ/ ApoCⅢ	0.39±0.12	0.41±0.16

男女组间无显著意义

(源自：王抒，1996)

表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数

项目	X±S	p5	p25	p50	p75	p95
男(225例)
ApoAⅠ(g/L)	1.42±0.17	1.17	1.30	1.43	1.51	1.72
ApoAⅡ(g/L)	0.36±0.66	0.28	0.32	0.35	0.40	0.46
ApoB(g/L)	1.01±0.21	0.72	0.86	1.00	1.14	1.38
ApoCⅠ(mg/L)	53±17	31	43	50	60	83
ApoCⅡ(mg/L)	34±16	13	24	31	42	69
ApoCⅢ(mg/L)	44±17	26	34	41	51	74
ApoE(mg/L)	44±17	26	34	41	51	74
Lp(α)(mg/L)	144125	26	53	107	185	382
女(58例)
ApoAⅠ(g/L)	1.45±0.14	1.21	1.34	1.44	1.55	1.74
ApoAⅡ(g/L)	0.36±0.06	0.26	0.33	0.36	0.39	0.44
ApoB(g/L)	1.07±0.23	0.71	0.90	1.08	1.20	1.49
ApoC(mg/L)	53±18	30	39	51	61	92
ApoCⅡ(mg/L)	41±18	20	28	38	49	77
ApoCⅢ(mg/L)	104±40	52	72	100	129	184
ApoE(mg/L)	51±18	33	37	48	58	89
Lp(α)(mg/L)	154±116	35	66	117	207	464

国内的已有报道表明，人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的，目前认为主要原因有：①检测方法与仪器不同；②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一；③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清；④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立，尚需付出艰辛的劳动。

校对时间：1999-12-21 马海茸

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