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编号:95609
第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用
http://www.100md.com 《免疫细胞化学》

第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用

自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来近20余年内,这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料,发挥了其它技术难以取代的作用。近年来,此一技术的应用领域逐渐扩大并在两个主要进行了技术法的改进。一方面是应用一系列放大手段增强检测的灵敏度(详见二十二章 ),另一方面是提高其分辨率,即向电镜水平发展。Jacob(1971)首先用3H标记的核酸RNA探针与DNA杂交并在电镜水平显示获得成功,继后不少科技工作者在这方面做了大量的工作(Manning et al 1975,Steinert et al 1976,Hutchison et al 1982)。但所应用的均是同位素标记核酸探针,直到1986年Binder首先用生物素标记的rDNA及UI探针,在蜂蝇(Drosophila)卵巢,应用Lowicryl-K4M低温包埋的切片上进行原位分子杂交,以蛋白A和胶体金复合物作为显示系统,较好的保存了组织的形态学结构和较高的信噪比例。Webster等人(1986)应用生物素标记探针显示了细胞内mRNA的分布。Singer等(1989)成功的用双标记原位杂交技术,一方面检测整装抽提细胞内与骨架结合的mRNA,同时显示了该mRNA所表达的蛋白质。新近Fischer等利用地高辛标记rRNA探针在Lowicryl-K4M包埋的切片进行杂交,然后以抗地高辛等抗体结合胶体金颗粒进行显示,以银显示法加强获得极为满意的定位。总之,电镜水平的原位分子杂交技术在国外还处在不断提高和改进的阶段,在国内此一技术还刚起步。焦仁杰等(1992)报告了以生物素标记腺病毒的基因组探针与整装抽提的细胞进行电镜原位杂交技术,成功地证明了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系,胶体金颗粒呈簇状与串珠状结合在核骨架上。向正华等(1994)应用地高辛标记探针结合HRP的包埋前染色法显示了POMC mRNA定位于神经元的粗面内质网上。下面列举几种代表性的电镜原位杂交技术。

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al, 1982)

(1)将整封染色体铺片放置于金网上,在70%的酒精蒸汽固定4~15h,空气干燥。

(2)以强碱使DNA变性,将金网置于2×SSC内(应用0.1N NaOH调整至pH12),室温,2min。

(3)脱水,以70%和95%酒精各冲洗3次,空气干燥。

(4)杂交,金网覆于平面玻璃皿( Petri dish)内的杂交液滴上,每滴约10~15μl

,将此小碟置于盛于杂交缓冲的大塑料盒内,保持湿润,在60~65℃孵育4~24h。

杂交液的配制:6×SSC或6×TNS(1×TNS =0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000~50000cpm/10μl 3H cRNA)。

(5)杂交后冲洗,金网自杂交液中取出后立即用大量的2×SSC冲洗多次。RNA酶溶液(20μg/ml)室温冲洗,然后再用2×SSC室温冲洗,冲洗后梯度酒精脱水(70%,95%)空气干燥。

(6)浸入乳胶膜,应用L-4核乳胶液,水稀释4倍。浸膜后的金网,用胶带固定在载玻片上放在密封的黑色塑料盒内,4℃,时间根据同位素种类和靶mRNA含量而定,也可选择不同时间曝光,根据显影强弱确定最终显影的时间。

(7)显影。暗盒自冷房或冰箱中取出后,在室渐中回暖至少30min,以防核乳胶膜皱缩。然后在显影液(Kodax Microdol X)显影3~5min,温度18~24℃。水冲,在15% Kodax快速定影液定影5min,然后在空气中干燥。

所有溶液应尽可能新鲜配制。

(8)电镜观察。

二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术

(一)基本原理

应用DNA探针缺口翻译(nick translation)方法,通过碱基配对以一条DNA链为模板,将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP渗入有缺口的DNA链。将生物素标记的DNA探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种:一种是用HRP显示,类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法,利用地高辛-过氧化物酶HRP显色法进行光镜水平的厚片原位杂交免疫细胞化学染色,其步骤与第二十章 叙述的原位杂交免疫细胞化学基本方法相同,只是为了减少细胞微细结构的损伤,在包埋过程中减少H2O2和Triton X-10等易损伤细胞与组织结构的试剂用量(向正华等1993)。在显色完毕后,取反应阳性部位按常规电镜操作程序进行锇酸后固定,脱水,包埋,切片和观察。此法利用HRP免疫反应产物具有极高电子反应密度体积大小不一,加之非特异性反应产物常掩盖微细结构的背景,不易达到准确的定位。现在比较广泛应用的是生物素-蛋白A(PA)胶体金(gold)标记技术。用于原位杂交的电镜定位,取得较为满意的效果。其基本原理是利用生物素标记探针与细胞或组织进行原位杂交后,利用抗生物素抗体-结合蛋白A-金标记杂交体的超微结构定位,类似免疫电镜中的包埋后染色。在包埋剂应用方面,有报告应用环氧树脂包埋获得成功的。但大多数较满意的结果均获自低温亲水性包埋剂——Lowicryl-K4M,也有应用LR-white作为包埋剂的(详见第七章 )。

(二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术(Binder et al,1986)

1.固定 现认为应用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸缓冲液中(pH7.4),为较理想的固定剂,也有主张单纯用4%多聚甲醛的,因经实验证明如应用高浓度4%的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定时间在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS,在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸缓冲液中储存过夜。

2.脱水 次日,用0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)冲洗30min,然后进行脱水,①65%乙二醇,0℃,60min;②80%乙醇-35℃,120min;③100% K4M:80%乙醇 =1:1,-35℃,120min;④100% K4M:80%乙醇=2:1,-35℃,60min;⑤100% K4M -35℃,过夜。

3.包埋  按照Roth et al(1981),组织块包埋于盛有K4M的胶囊中,在-35℃紫外线灯(波长360nm)照射聚合24~48h。取出后置室温,用紫外线灯继续照射24h,使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温,如需长期保存,宜置于-70℃冰箱中,可保存近1年。

K4M配制(中等硬度)

交联接剂(cross-linker) 2.7mg

单体(monomer) 17.3mg

引发剂(initiator)0.10mg

可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量,组织块的硬度增加。

4.切片超薄切片50~60nm,捞于有覆有Formavar和碳膜的镍网上。

5.组织前处理和预杂交用含0.2mol/L Tris缓冲液的0.1mol/L甘氨酸(Ph7.4)冲洗15min,以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响,然后2×SSC冲洗15min,再用变性液(70%去离子甲酰胺,2×SSC)在65℃处理样品5~10min,以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中(50%去离子甲酰胺,0.5mol/L NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,pH7.5)37℃预处理15min。

6.杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴(约20μl)上,置于湿盒内37℃,1~2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同(详见第二十章 ),如为DNA探针须在沸水中先煮2~3min,以使之变性,然后迅速移至冰浴。

整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。

7.杂交后漂洗

含50%甲酰胺的2×SSC液 37℃ 30min

含50%甲酰胺的1×SSC液室温30min

无甲酰胺的1×SSC液室温20min

样品置1×SSC 4℃过夜

0.01mol/L PBS(pH7.2) 室温 10min

4%BSA 封闭  15min

8.羊抗生物素IgG抗体(sigma)1:100(稀释用PBS液:2% NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4, 0.278% Na2HPO4, 另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室温反应2h。

9.含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。

10.兔抗羊IgG的IgG相连10nm胶体金(Sigma)1:100(稀释用1%BSA缓冲液:20mmol/L Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl, 0.02mol/L叠氮钠,0.5% Triton X-100),室温反应1h。

11.1%BSA缓冲液3×30min,PBS(pH7.2)15min,蒸馏水洗5min,空气干燥。

12.醋酸双氧铀染色20min,柠檬酸铅染色15min,空气干燥后电镜观察。

应用本法标记有如下优点:(1)可获迅速的信号检测;(2)形态学保存较好;(3)与放射性同位素原位分子电镜杂交技术的信/噪比例相近。是目前公认在电镜水平应用同位素标记原位杂交技术较为理想的方法。胶体金颗粒电子密度高,明显地区别于非特异性染色与污染,能达到较为满意的超微结构定位。本技术的难点在于:①实验周期长;②亲水性低温包埋剂制作切片,由于亲水性强,捞取比较困难,切片易于破裂;③探针的纯度与杂交后彻底的漂洗,这是本实验成功的关系,而彻底的漂洗又易导致镍网切片的破裂,作用推荐应用大量漂洗液或漂洗中设置多个漂洗杯,勤换漂洗液,或用软塑料瓶加笔状喷头,增加水压等方法,但不论漂洗或喷水冲洗都必须注意水流与网面平行而不能垂直,否则更易导致切片的破裂。④杂交时间:Binder等证明杂交1h即可出现特异性,到5h之内不断增加。Lawrence和Singer(1985)实验也表明杂交后3~4h杂交时特异性就可达到最大值,虽然此后杂交仍继续进行,杂交率并不再增加。 焦仁杰等(1992)对整装细胞的试验也与上述实验相同,他们发现杂交4h和杂交20h相当,但前者的结构保存要好得多。他们实验表明,切片标本的杂交时间大约需9~10h。因此,选择最短而又最有效的杂交时间对有效地保持形态学结构是十分重要的。Binder认为生物素PA-Gold电镜杂交技术所需理想杂交时间为1~2h。⑤应用含甲酰胺(formamide)的缓冲液漂洗易导致金粒聚集的非特异性背景,因此Binder在实验后建议试用以PBS缓冲液漂洗5×10min代替含甲酰胺的盐液,经证明可避免或减少这种非特异性染色;⑥多数作者发现应用K4M包埋剂在电镜杂交技术是最理想的,其结果可与无包埋剂的培养细胞涂片、染色体铺片等的信/噪比值相等。

虽然生物素-PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片获得了较为满意的结果,但Lawarence和singer(1985)在比较了三种检测系统的信/噪(signal/Noise,S/N)得到的结果是32P标记为70、3H标记为20、而生物素标记的S/N值最低,为10。Webster等(1987)同时比较了生物素标记P0-HRP糖蛋白cDNA探针(包埋前染色)和生物素标记P0-糖蛋白cDNA探针-蛋白A-胶体金(包埋后染色)电镜杂交技术,观察15天大鼠三叉神经节 雪旺氏细胞髓鞘的标记,固定剂应用PLA溶液(4%多聚甲,15%(V/V)饱和苦味酸)和0.08%戊二醛(用磷酸缓冲液配),二者均获显示,但作者仍认为应用PA-Gold电镜杂交技术在K4M包埋切片上进行载网杂交的显示结果以及形态保存更为理想。

三、应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术

(一)基本原理

在地高辛标记核酸探针广泛用于光镜水平的原位杂交试验并获极为满意的结果后,科学工作者试图将其应用于电镜水平。其基本原理和生物素标记核酸探针-PA-Gold电镜杂交技术的基本原理相似,首先利用地高辛修饰核酸探针,与细胞或组织进行杂交,再用抗地高辛抗血清相连胶体金与之结合,进行细胞或组织特异核苷酸的超微结构定位。为增强金的显示效应,可用银加强法增强金粒的显示效应。

(二)基本操作方法(Fischer D et al, 1992)

1.组织处理

(1)固定:固定剂采用4%多聚甲醛(PFA,用PBS配制)加0.5%戊二醛(GA),保存在4℃。作者采取浸入法,即取大鼠肝脏放入冷固定剂中(4% PFA,不含GA),切成1mm3左右的小方块。修整好的组织块移入另一玻皿中,内盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。

(2)PBS(4℃)漂洗3~5min。

(3)脱水

时间乙醇浓度温度

2×15min 30% 4℃

30min 30% 4℃

30min 50% -20℃

2×30min 70%,90%,96%,100% -20℃

注意勿使酒精挥发致使组织干燥。

(4)浸透和包埋(Carlemalarm et al, 1989):由于K4M包埋剂有挥发性,因此,此步操作者必须带手套,在通风柜中进行,注意K4M包埋剂不要靠近O2,一切在低温下进行,最好设有恒低温的冷柜。

①Lowcryl K4M配方

1)交联剂A 2g

2)单体B 13g

3)引发剂 0.075g

混合1),2)后,再加“3)”轻搅匀,混匀后置于-20℃。

②浸透(infiltration),在-20℃进行

时间液体

1h 100%乙醇:K4M(1:1,V/V)

2×1h K4M

过夜 K4M

2×3h K4M

③包埋: 先将胶囊冷却,滴入几滴K4M,然后每个胶囊内放入一个组织块,以K4M充满胶囊,在室温放置30min,使包埋剂中气泡逸出。然后置于0℃-40℃之间,利用紫外线灯360nm波长照射5天,温度必须保存恒定。然后移至室温使温度回升,胶囊变硬。

④切片:由于胶囊是透明的,包埋在内的肝组织很容易识别。修块后进行切片,由于K4M是亲水性的,在切片过程中注意组织块表面一定不要让水浸湿,用200个网眼的镍网覆以For-mvar膜和碳膜捞取切片,空气干燥备用于杂交。

2.探针准备rRNA探针以Dig-UTP标记,注意探针不宜过长,否则影响对组织的穿透性。如过长,可事先用第二十章 介绍的探针水解法处理。

3.杂交本步骤均在湿盒内进行,将杂交液滴滴于蜡膜上,将镍网载有切片面覆于液滴上,在65℃杂交至少3h。杂交液含:5×SSC,0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探针10ng/μl(et 1×SSC配,含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸钠)。

4.杂交后漂洗 在室温用2×SSC漂洗3×5min,然后用PBST(PBS,0.1% Tween)漂洗2×10min。

5.显示

①以PBST加BT封闭(BT配方:PBST,1%BSA)孵育15min。

②应用抗地高辛抗体结合直径1mm的金粒,以PBST加BG稀释为1:30,室温孵育1h。

③以PBST漂洗3×5min。

④以带笔尖嘴软塑料壶冲洗6×15min。

⑤以银增强法,在暗室中孵育于显影液:促进液(Enhancer)1:1,4~20min。

⑥重复④。

⑦以2%醋酸铀(4min),枸缘酸铅1min染色,漂洗,空气干燥。

⑧电镜观察。

四、结语

原位分子杂交技术在电镜水平的应用,或简称为电镜原位分子杂交技术是基因表达在超微结构定位的一项极有前景的新兴技术。但要使之完善,还需要做许多工作。必须说明的是电镜原位杂交技术和光镜原位杂交技术一样必须设置对照实验组,对显示的结果的解释应持审慎的态度。一般应在重复多次实验的基础上才能得出对本实验的结论,不能只凭一次实验或一张电镜照片就勿忙结论。因原位杂交技术是高度敏感、高度特异性技术,影响因素很多。电镜原位杂交技术的影响和干扰因素更多。相信在不久的将来,随着电镜原位杂交技术的广泛应用,科技工作者将从实践中对本技术的实验流程不断完善并有更多的新的电镜原位杂交技术方法涌现。

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