·尿道下裂相关问题·

    作者单位: 430030 武汉,同济医科大学附属同济医院小儿外

    科(第一作者现在武汉市儿童医院外科,邮编:430016)

    PCR2SSCP 银染色法检测

    尿道下裂患儿雄激素受体基因突变

    王军 袁继炎 周学锋 许娟

    【摘要】 目的 研究尿道下裂的发生与雄激素受体基因突变间的关系。方法 运用盐析法从

    27 例不同类型尿道下裂患儿外周血中提取基因组 DNA ,然后通过聚合酶链反应2单链构象多态性分

    析(PCR2SSCP)银染色法检测雄激素受体基因第 2 和第 8 外显子基因突变情况。结果 1 例会阴型

    尿道下裂合并双隐睾、 1 例阴茎阴囊型尿道下裂患儿检出雄激素受体基因第 8 外显子突变 ,未发现第

    2外显子存在基因突变。结论 雄激素受体基因突变可能与尿道下裂的发生有关 ,并可能与严重尿

    道下裂的发生关系更为密切。

    【关键词】 尿道下裂; 受体 , 雄激素; 基因

    Androgen receptor gene mutation in children with hypospadias WA N G J un , YUA N Jiyan , ZHOU

    Xuef eng , et al . Department of Pediat ric S urgery , The A f f ilated Tongji Hospi tal , Tongji Medical Uni2

    versi ty , Wuhan 430030 , China

    【Abstract】 Objective To evaluate the status of androgen receptor gene in children with hypospa2

    dias.Methods Genomic DNA were ext racted f rom peripheral blood leucocytes of 27 boys with various de2

    gree of hypospadias. Androgen receptor gene mutations (exons 2 and 8) were identified by silver staining of

    single2st rand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction ( PCR2SSCP) . Results Of

    them , 2 patients with severe hypospadias (one with perineal hypospadias and bilateral cryptorchidism , one

    with penoscrotal hypospadias) were found exon 8 androgen receptor gene mutation. No exon 2 mutation

    was found. Conclusion Mutation of androgene receptor gene may be associated with severe hypospadias.

    【Key words】 Hypospadias ; Receptor , Androgen ; Genes

    尿道下裂是小儿泌尿生殖系最常见的先天性畸

    形之一 ,在其发病原因中雄激素受体(androgen re2

    ceptor , AR) 缺陷日益为人们所重视 ,并已深入到

    AR基因突变的研究[1 ]。本文应用聚合酶链反应2单

    链构象多态性( PCR2SSCP)银染色法分析尿道下裂

    患儿AR基因突变情况 ,以探讨尿道下裂的发生与

    AR基因突变间的关系。

    材料与方法

    一、标本来源及基因组DNA提取

    27 例尿道下裂患儿中 ,阴茎头型 3 例 ,阴茎干

    型11 例 ,阴茎阴囊型 8 例(其中 1 例合并有右隐

    睾) ,会阴型 5 例(其中 2 例合并有双隐睾) 。患儿年

    龄1. 5～14. 0岁 ,平均7. 9岁。所有患儿染色体核型

    为 46 ,XY。对照组为健康、无外生殖器异常及内分

    泌疾病的正常儿童 30 例。上述实验对象取外周静

    脉血 3 ml ,加 EDTANa2 抗凝 , 盐析法提取基因组

    DNA。

    二、聚合酶链反应(PCR)

    引物序列依据文献[2 ]

    ,由 Gibco BRL 公司合成 ,其碱基序列为:Exon 2 :Forward 5′ 2GCCTGCAGGT2

    TAATGCTGAAGACC 23′ , Reverse 5′ 2CCTAAGT2

    TATTTGATAGGGCCTTGCC23′ ; Exon 8 : Forward

    5′ 2GAGGCCACCTCCTTGTCAACCCTG 23′ , Re2

    serve 5′ 2GGAACATGTTCATGACAGACTGTACA

    2TCA3′。

    50μl PCR 反应体系组成: 10 ×Buffer 5μl ,10 mmol/ L dNTP 1μl ,引物一对 ,各 16 pmol ,MgCl2

    1. 5 mmol/ L , Taq 酶 2U ,加双蒸水至 48μl ,再加模

    板DNA 2μl ,混匀后石蜡油覆盖。有关 PCR扩增特

    异性循环参数为:94 ℃,30 s ;57 ℃,1 min (第 8 外显

    子为 59 ℃) ;72 ℃,1 min。35 个循环后 72 ℃延伸

    5 min。

    取 PCR扩增产物6μl 经质量分数为2 %琼脂糖

    凝胶电泳检测。

    91 中华小儿外科杂志2000 年2 月第21 卷第1 期 Chin J Pediat r Surg , February 2000 , Vol . 21 , No. 1

    ? 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.三、单链构象多态性(SSCP)分析

    取 PCR扩增产物 5μl 与等体积的变性液(体积

    分数为 95 %去离子甲酰胺、 10 mmol/ L EDTA pH

    8. 0 ,质量分数为0. 05 %溴酚蓝 ,0. 05 %二甲苯蓝)

    混合 ,100 ℃变性 5 min ,冰中骤冷 ,迅速加样 ,进行

    质量分数为 6 %(49∶ 1)非变性聚丙烯酰胺凝胶(胶

    块大小为 16 cm×30 cm×0. 06 cm) ,室温下电泳(胶

    中含体积分数为 10 %甘油) ......