肿瘤药理学研究方法.ppt
http://www.100md.com
参见附件(2170kb)。
肿瘤药理学研究方法概述
药理学研究方法的演进
? 药理学研究方法，通常是以各种生理生化方法为基础的。
? 随着生命科学的发展，药理学研究从整体，发展到组织、细胞和分子水平。
? 现代分子生物学的发展，为药理学研究提供了更丰富的手段。
肿瘤药理学研究常规方法
? 整体水平：荷瘤小鼠(瘤体生长、转移)；
? 细胞水平：细胞增殖(MTT)、分化(形态、酶学)、凋亡(形态、流式细胞计数)；
? 分子水平：蛋白表达(Western, 流式细胞计数)，蛋白活性( 酶学、转运)，DNA扩增、变异(Southern、PCR)，mRNA表达(Northern, RT-PCR)。
转录调控研究方法在药理学中的应用
? 肿瘤的发生和发展，与肿瘤细胞的基因变异和表达异常有密切关系。针对肿瘤细胞特异性的基因表达异常，可能发现有特异性作用的抗肿瘤药物。
? 基因表达调控，是现代生物医学研究的前沿领域。
? DNA转录形成RNA，RNA翻译形成蛋白质，这一过程称为基因表达。
? 基因表达的调控，可以发生在各个水平上 。
RNA转录的有关理论
? 基因5'非编码区含有转录起始区和相应基因序列，称为启动子。
? 启动子由三类DNA序列组成，一类是基础(或核心)启动子单元，一类是启动子近端单元，一类是启动子远端单元。
? 典型的核心启动子单元是由TATA盒(位于转录起始点上游25bp左右)和嘧啶富含区单元(转录起始点)组成，它们是PolII的主要DNA靶点。
? 启动子近端单元通常位于转录起始点上游50-200bp 。
? 启动子远端单元则可位于转录起始点上游或下游的不同距离的区域。
? 转录因子与它们结合，调节PolII的活性，影响转录起始过程。
? 转录调控是通过影响在起始、延长、终止过程中PIC的组装和催化效率来达到的。在起始阶段PIC的组装，是整个转录过程的限速环节。
转录因子
? 不同基因的表达是通过一个复杂的调控网络调节的，在这一网络中，特定的转录因子将信号传递给特定的靶基因。
? 外界刺激信号通过信号转导通路，经过一系列酶促反应，影响相应的转录因子，最终引起相关基因的改变，产生一定的生物学效应。
? 多数转录因子是DNA结合蛋白，结合于靶基因的调节DNA元件，或称为顺式作用元件(cis-acting element)。
? 转录因子也称为反式作用因子(trans-acting factor)。
? 哺乳类细胞大约含有2-3千种转录因子，有限数量的转录因子，是通过组合效应来实现对其自身和其它基因表达调控的。
组合效应：三种转录因子及其DNA结合序列，通过不同的排列组合，可产生九种调节方式。
? 转录因子一般有两个特征性的功能簇，一个是DNA结合功能簇，可与基因的特定调节位点，即顺式调节单元直接结合；
? 另一个功能簇则显示转录激活或抑制活性。
? 有时，这两个功能簇也可位于不同的蛋白分子上，共同形成分子伴侣。
转录调控研究的常用方法
? 转录调控研究可分为两类，既蛋白质与DNA的相互作用，和蛋白质与蛋白质的相互作用。
蛋白质与DNA的相互作用
DNA足印法
? 这是一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。
? 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，可保护所结合的DNA区域不受DNase I 或其它分子的消化。通过比较转录因子存在与否时，消化的DNA条带分布，可以了解转录因子所结合的具体DNA序列。
应用示例
? 拓扑异构酶IIα是肿瘤治疗的一个重要靶点。肿瘤细胞的拓扑异构酶II表达下降，可能是其对该类细胞毒性药物产生抗性的机理。
? Hoechst 33342是合成的化合物，可促进拓扑异构酶II的表达，可能作为克服肿瘤抗药性的辅助化疗药物。
Western Blot：与对数生长期(1)相比，生长停滞期的细胞(2)的拓扑异构酶IIa表达明显下降。Hoechst 33342处理(3)可恢复生长停滞期的细胞(2)拓扑异构酶IIa表达。
DNase I 足印：Distamycin A(a)和Hoechst 33342 (b)可单独产生DNA足印，Distamycin A 的DNA结合作用比Hoechst 33342 更广泛。Hoechst 33342 主要结合于ICB2的位置。(c)核蛋白可与Hoechst 33342 竞争结合ICB2的位置。ICB1和2显示拓扑异构酶IIa基因启动子上CCAAT序列位置。
? 足印法结果显示， Hoechst 33342能结合于拓扑异构酶II的启动子DNA区域，而可能抑制有关转录因子与其相应DNA结合位点的结合。
? Hoechst 33342 的竞争性结合序列主要是ICB2，这是一个已知的拓扑异构酶IIa启动子抑制区。
凝胶延迟实验
? 凝胶延迟实验也称Gel Shift或Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 。
? 是另一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。
? 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，形成的复合物在非变性凝胶电泳时的迁移速度，明显慢于单独的DNA片段。根据标记的DNA片段的迁移情况，可以很敏感地反映出蛋白质与其DNA靶序列的结合。
应用示例
? 为进一步验证ICB2序列的结合蛋白，用ICB2探针作了凝胶迁移实验，并对结合蛋白的可能身份，进行确定。
NIH3T3细胞提取核蛋白，与放射性标记的ICB2 DNA双链探针结合后电泳。1：仅含有探针与核蛋白； 2，3：分别加入非标记的竞争性原始或变异探针(含有NF-YA的结合位点)；4，5，6：分别加入NF-YA，NF-YB和Sp1抗体。F，游离探针；S，迁移的DNA-蛋白质复合物；Su，迁移的DNA-蛋白质-抗体复合物。
核蛋白凝胶迁移实验中，Hoechst 33342可与ICB2探针发生特异性竞争结合。(a)ICB2探针；(b)GC富含区探针。
? 结果表明，ICB2的结合蛋白复合物含有NF-YA和NF-YB。而Hoechst 33342可与结合蛋白复合物发生特异性竞争，结合ICB2。
报告子测定
? 是一种分析和检测基因序列中顺式调控元件的功能测定方法。
? 基本原理：用基因重组方法将待测定的顺式调控元件序列连接到含有报道基因的表达载体内，转染到细胞中。报道基因的表达水平可以精确测定。
? 报道基因常用的有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，萤火虫酶(Luciferase)基因，β半乳糖苷酶(β-Gal)和绿色荧光蛋白(GFP)等。
应用示例
? 为确定NF-YA在拓扑异构酶IIa转录调控中的意义 ......
肿瘤药理学研究方法概述
药理学研究方法的演进
? 药理学研究方法，通常是以各种生理生化方法为基础的。
? 随着生命科学的发展，药理学研究从整体，发展到组织、细胞和分子水平。
? 现代分子生物学的发展，为药理学研究提供了更丰富的手段。
肿瘤药理学研究常规方法
? 整体水平：荷瘤小鼠(瘤体生长、转移)；
? 细胞水平：细胞增殖(MTT)、分化(形态、酶学)、凋亡(形态、流式细胞计数)；
? 分子水平：蛋白表达(Western, 流式细胞计数)，蛋白活性( 酶学、转运)，DNA扩增、变异(Southern、PCR)，mRNA表达(Northern, RT-PCR)。
转录调控研究方法在药理学中的应用
? 肿瘤的发生和发展，与肿瘤细胞的基因变异和表达异常有密切关系。针对肿瘤细胞特异性的基因表达异常，可能发现有特异性作用的抗肿瘤药物。
? 基因表达调控，是现代生物医学研究的前沿领域。
? DNA转录形成RNA，RNA翻译形成蛋白质，这一过程称为基因表达。
? 基因表达的调控，可以发生在各个水平上 。
RNA转录的有关理论
? 基因5'非编码区含有转录起始区和相应基因序列，称为启动子。
? 启动子由三类DNA序列组成，一类是基础(或核心)启动子单元，一类是启动子近端单元，一类是启动子远端单元。
? 典型的核心启动子单元是由TATA盒(位于转录起始点上游25bp左右)和嘧啶富含区单元(转录起始点)组成，它们是PolII的主要DNA靶点。
? 启动子近端单元通常位于转录起始点上游50-200bp 。
? 启动子远端单元则可位于转录起始点上游或下游的不同距离的区域。
? 转录因子与它们结合，调节PolII的活性，影响转录起始过程。
? 转录调控是通过影响在起始、延长、终止过程中PIC的组装和催化效率来达到的。在起始阶段PIC的组装，是整个转录过程的限速环节。
转录因子
? 不同基因的表达是通过一个复杂的调控网络调节的，在这一网络中，特定的转录因子将信号传递给特定的靶基因。
? 外界刺激信号通过信号转导通路，经过一系列酶促反应，影响相应的转录因子，最终引起相关基因的改变，产生一定的生物学效应。
? 多数转录因子是DNA结合蛋白，结合于靶基因的调节DNA元件，或称为顺式作用元件(cis-acting element)。
? 转录因子也称为反式作用因子(trans-acting factor)。
? 哺乳类细胞大约含有2-3千种转录因子，有限数量的转录因子，是通过组合效应来实现对其自身和其它基因表达调控的。
组合效应：三种转录因子及其DNA结合序列，通过不同的排列组合，可产生九种调节方式。
? 转录因子一般有两个特征性的功能簇，一个是DNA结合功能簇，可与基因的特定调节位点，即顺式调节单元直接结合；
? 另一个功能簇则显示转录激活或抑制活性。
? 有时，这两个功能簇也可位于不同的蛋白分子上，共同形成分子伴侣。
转录调控研究的常用方法
? 转录调控研究可分为两类，既蛋白质与DNA的相互作用，和蛋白质与蛋白质的相互作用。
蛋白质与DNA的相互作用
DNA足印法
? 这是一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。
? 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，可保护所结合的DNA区域不受DNase I 或其它分子的消化。通过比较转录因子存在与否时，消化的DNA条带分布，可以了解转录因子所结合的具体DNA序列。
应用示例
? 拓扑异构酶IIα是肿瘤治疗的一个重要靶点。肿瘤细胞的拓扑异构酶II表达下降，可能是其对该类细胞毒性药物产生抗性的机理。
? Hoechst 33342是合成的化合物，可促进拓扑异构酶II的表达，可能作为克服肿瘤抗药性的辅助化疗药物。
Western Blot：与对数生长期(1)相比，生长停滞期的细胞(2)的拓扑异构酶IIa表达明显下降。Hoechst 33342处理(3)可恢复生长停滞期的细胞(2)拓扑异构酶IIa表达。
DNase I 足印：Distamycin A(a)和Hoechst 33342 (b)可单独产生DNA足印，Distamycin A 的DNA结合作用比Hoechst 33342 更广泛。Hoechst 33342 主要结合于ICB2的位置。(c)核蛋白可与Hoechst 33342 竞争结合ICB2的位置。ICB1和2显示拓扑异构酶IIa基因启动子上CCAAT序列位置。
? 足印法结果显示， Hoechst 33342能结合于拓扑异构酶II的启动子DNA区域，而可能抑制有关转录因子与其相应DNA结合位点的结合。
? Hoechst 33342 的竞争性结合序列主要是ICB2，这是一个已知的拓扑异构酶IIa启动子抑制区。
凝胶延迟实验
? 凝胶延迟实验也称Gel Shift或Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 。
? 是另一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。
? 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，形成的复合物在非变性凝胶电泳时的迁移速度，明显慢于单独的DNA片段。根据标记的DNA片段的迁移情况，可以很敏感地反映出蛋白质与其DNA靶序列的结合。
应用示例
? 为进一步验证ICB2序列的结合蛋白，用ICB2探针作了凝胶迁移实验，并对结合蛋白的可能身份，进行确定。
NIH3T3细胞提取核蛋白，与放射性标记的ICB2 DNA双链探针结合后电泳。1：仅含有探针与核蛋白； 2，3：分别加入非标记的竞争性原始或变异探针(含有NF-YA的结合位点)；4，5，6：分别加入NF-YA，NF-YB和Sp1抗体。F，游离探针；S，迁移的DNA-蛋白质复合物；Su，迁移的DNA-蛋白质-抗体复合物。
核蛋白凝胶迁移实验中，Hoechst 33342可与ICB2探针发生特异性竞争结合。(a)ICB2探针；(b)GC富含区探针。
? 结果表明，ICB2的结合蛋白复合物含有NF-YA和NF-YB。而Hoechst 33342可与结合蛋白复合物发生特异性竞争，结合ICB2。
报告子测定
? 是一种分析和检测基因序列中顺式调控元件的功能测定方法。
? 基本原理：用基因重组方法将待测定的顺式调控元件序列连接到含有报道基因的表达载体内，转染到细胞中。报道基因的表达水平可以精确测定。
? 报道基因常用的有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，萤火虫酶(Luciferase)基因，β半乳糖苷酶(β-Gal)和绿色荧光蛋白(GFP)等。
应用示例
? 为确定NF-YA在拓扑异构酶IIa转录调控中的意义 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PPT附件(2170kb)。