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    106 中国临床肿瘤学教育专辑 (2007)

    乳腺癌干细胞的研究进展

    上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤科 张凤春 林叔陈 宋彩丽 徐迎春

    一、 引言

    干细胞是具有自我更新、无限增殖及多向分化能力的细胞群体。最近越来越多的证据显示肿瘤组织

    及肿瘤细胞系中的细胞存在着等级性,即存在着不同分化阶段的的细胞,这些细胞在性质及功能上存在

    着诸多差异,其中有一部分的肿瘤细胞充当干细胞的角色,在启动肿瘤形成和维持肿瘤生长中起决定性

    作用命名为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)。Blair 等[1]

    的研究则使人们开始关注肿瘤干细胞与正常干

    细胞的关系。他们发现能在体外形成白血病克隆的细胞、能在免疫缺陷鼠体内形成急性髓系白血病的细

    胞均表达正常造血干细胞的标志 CD34,但与正常造血干细胞不同,不表达 Thy-1。2003 年,Al-Hajj 等

    人[2]

    则第一次从实体瘤——乳腺癌组织中分离出乳腺癌干细胞。

    二、 乳腺癌干细胞的分离

    一直以来对乳腺癌干细胞缺乏有效的分离方法,因此对其生物学行为的研究也比较缓慢。最近人们

    采用了各种策略分离出乳腺癌干细胞。

    1. CD44+CD24-/lowlin-

    CD44是一种归巢细胞粘附分子,是一种I型跨膜糖蛋白分子,其配体是透明质烷。近年来CD44被用

    于乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤干细胞的分离。Al-Hajj等[2]

    从乳腺癌病人组织中分离出CD44+CD24

    -/lowESA+lin-群细胞,这群细胞只需200个就可以在NOD/SCID鼠中5~6个月后形成大约1cm的肿瘤,而CD44+CD24-/lowESA-lin-细胞、CD44+CD24+细胞、CD44-细胞、CD24+细胞则无致瘤性或致

    瘤性低。与未分选的细胞相比,CD44+CD24-/lowESA+lin-群细胞致瘤性提高了50倍。

    2. Hoechst33342染料排斥法

    Hoechst33342是一种DNA增补性染料,能结合到DNA的AT丰富系列的小沟处,干细胞及肿瘤干细胞

    因带有ABC转运蛋白而能将染料泵出而表现为染料暗淡的特征而被分离出来,所分选出来的染色暗淡的

    细胞被称为侧亚群(side population,SP)细胞,而大部分深染的细胞被称为non-SP细胞或MP细胞。Kondo

    等[3]

    采用此方法鉴定出MCF-7乳腺癌细胞系中SP比例为2.0%。然而因为SP与non-SP部分相连在一起,因

    此带有一定的主观性。Patrawala等[4]

    改进了这种分离方法,他们使用了Coulter Epics流式细胞仪,这种细

    胞仪能将SP与non-SP分为独立的两群,并采用HL60-dox作为对照组,HL60不含SP细胞,而HL60-dox则含

    大于90%的SP细胞,将HL60-dox滴定到HL60细胞中,并进行流式分析以检测该系统的灵敏性,之后检测

    发现MCF-7中SP比例为0.2%。产生SP表型的主要原因是因为高表达ABCG2[5]。加入verapamil之后SP比例

    大大减少,奇怪的是verapmi并不抑制ABCG2的功能,而只抑制P-糖蛋白的功能[6]

    ,因此为什么加入

    verapamil可以导致SP比例减少机制不明。 中国临床肿瘤学教育专辑 (2007) 107

    Hoechst33342染料排斥法对染色流程要求比较严格,染色温度、染色时间、verapamil浓度等对实验结

    果影响很大,样本制备的微小差异也可能对实验结果造成重大影响。Kondo等[3]

    采用Hoechst33342染料方

    法发现C6胶质瘤细胞中只含0.4%的SP,然而最新的研究表明大部分的C6胶质瘤细胞是肿瘤干细胞,具有

    自我更新能力及致瘤性,采用Hoechst33342染色法会导致染料在non-SP比SP聚集更多有毒性的Hoechst染

    料,从而可能造成non-SP自我更新能力低、致瘤性低的假象[7]。因为染料排斥法具有不需要寻找特定的肿

    瘤干细胞特异的表面分子标志物等优点,已经成为目前广泛使用的多种肿瘤干细胞分离方法,然而其可

    靠性有待进一步评价。

    3. CD55

    Hoechst33342染料排斥法的上述缺点促使人们寻找一种无染料的简便的肿瘤干细胞分离系统。CD55

    是一种补体衰变加速因子,与C3转化酶结合,阻止了C3b的沉积,并抑制了攻膜复合物的形成,从而使肿

    瘤细胞逃脱补体的攻击。近年的研究表明CD55与肿瘤细胞的活动度、新生血管形成、细胞凋亡的解救、肿瘤的致瘤性、肿瘤的侵袭及转移等有关[8]。Xu等人[9]

    发现从MCF-7中分离出的CD55hig、CD55low分别

    落在SP、MP部分。去除CD55hig群的MCF-7细胞后,大部分的SP消失了。提示采用CD55抗体可以替代

    Hoechst33342染料排斥法。克隆形成实验显示CD55hig的克隆形成效率高于CD55low,而且CD55hig细胞

    具有进一步分化的能力。CD55在细胞系中的SP、MP的表达模式具有普遍性,在MDA-MB-231乳腺癌细

    胞系、Lovo、RCM-1结直肠腺癌细胞系、TIG-1–20肺成纤维细胞系等均观测到类似现象。因此CD55hi群

    细胞可能是一群具有干细胞、肿瘤干细胞样性质的细胞。但作者并未对其体内致瘤性进一步评价。而且

    一些细胞如PC3前列腺癌细胞不含SP细胞,DLD1细胞的SP、MP表达相似水平的CD55。为什么CD55hig

    可以替代SP,ABCG2与CD55的相互间调节关系如何有待进一步探讨。

    三、 乳腺癌干细胞的体外培养

    肿瘤干细胞既能发生对称性分裂,引起肿瘤干细胞的自我更新,也能够发生非对称性分裂产生干细

    胞与祖细胞,后者进一步分化成后代细胞。因此如何使分选出来的干细胞只发生对称性分裂产生干细胞

    本身,而不发生分化是一个值得深入探讨的问题。研究表明在无血清的含bFGF、EGF的培养液下培养可

    以乳腺癌细胞可以形成微球体,这种微球体富含CD44+/CD24-/low细胞,不表达分化腔上皮、肌上皮等

    分化标志物,在分化条件下培养具有多系分化的能力,致瘤性也明显提高,提示通过微球体培养成功的

    分离出了乳腺癌干细胞,并成为乳腺癌干细胞体外培养的一种常规方法[10, 11]。

    四、 乳腺癌干细胞与信号转导通路

    目前的观点认为肿瘤干细胞是处在一系列信号传导通路的调控网络中。Wnt、Notch、Hedgehog等通

    路参与着许多正常干细胞的自我更新过程,对许多肿瘤包括乳腺癌的发生发展起着不可磨灭的作用。这

    些信号通路在调控着乳腺癌干细胞的过程中也可能发挥着重大作用。

    研究表明,Wnt通路的活化促进了乳腺干细胞的自我更新,引起了乳腺干细胞比例的增加[12, 13]。乳

    腺癌干细胞高表达 wnt-1、下游分子 β-catenin[4, 14, 15]。COMMA-D β-geo (CDβgeo)乳腺癌细胞系转染108 中国临床肿瘤学教育专辑 (2007)

    β-catenin 后形成乳腺微球体的比例增加了 ......

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