创新发展络病学 推进中医药国际化进程 络病理论指导血管病变防治研究取得系列重要进展——第三届国际络病学大会学术报告及系列研究报道(8)
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动脉粥样硬化(AS)是一种炎症性疾病,是内皮细胞炎症反应损伤的结果。药物干预可延缓炎症的发生与发展。曾定尹教授领导的课题组采用白介素1β(IL-1β)包裹冠状动脉外膜,构建小型猪冠状动脉早期炎症及内膜增殖模型,并观察通心络干预对冠状动脉早期炎症反应和内膜增殖的抑制作用及其作用机制。
通心络对白介素1β介导的小型猪
冠状动脉早期炎症反应及内膜增殖的抑制作用(一)
中国医科大学附属第一医院 关启刚 曾定尹 周旭晨 程颖 苗志林
大连市中心医院心内科 孙喜琢 何学志 韩凤桐 张利
摘要
目的 探讨通心络对IL-1β介导的小型猪冠状动脉早期炎症反应及内膜增殖的抑制作用及可能机制。
, 百拇医药
方法 24头小型猪被随机分为假手术组、模型组和通心络[1 g/(kg·d)]治疗组,各组8只,喂养2周后分离冠状动脉;假手术组血管予生理盐水处理,模型组和通心络组用IL-1β 2.5 μg处理。术后2周采用冠脉造影观察各组管腔狭窄情况,然后处死动物,截取包裹血管段,进行病理学检查,并采用逆转录聚合酶链反应,测定各组手术处理血管段单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、P选择素、E选择素、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞间黏附分子1(VCAM-1) mRNA的表达。
结果 冠状动脉造影显示,模型组冠脉管腔20%~30%狭窄,病理学检查可见模型组内膜增殖、炎性细胞浸润,平滑肌细胞内膜下迁移。通心络组管腔狭窄程度、内膜增殖及炎性细胞浸润现象较模型组明显减轻。逆转录聚合酶链反应显示,通心络组MCP-1、P选择素、E选择素、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达强度均低于模型组(P<0.05)。
结论 通心络对IL-1β诱导的冠状动脉炎症反应及内膜增殖具有明显的抑制作用。通过抑制细胞因子和黏附因子的表达可能是其主要作用途径。
, 百拇医药
方法
IL-1β悬液的制备
200 mg琼脂糖微粒加入10 ml Hcl溶液(1 mol/L)中,1200 转/分离心,琼脂糖微粒重悬于生理盐水溶液中,加入细胞因子IL-1β 200 μg,悬液置于室温1小时,4℃过夜,再次离心,1200转/分,弃上清,微球重悬于Tris/Hcl缓冲液,1小时,生理盐水洗脱,最后微粒重悬于生理盐水溶液中,浓度为50 μg/ml。
动物模型制作
将假手术组、模型组和通心络组小型家猪喂养2周后肌注安定(1 mg/kg)和盐酸氯氨酮(1.5 mg/kg),然后静注苯巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉,气管插管,呼吸机辅助呼吸。行开胸手术,剪开心包,选择左前降支及回旋支近端管腔外径近似的两处血管节段(长1~1.5 cm)分离。模型组和通心络组,在血管外膜包裹吸附含IL-1β 2.5 μg琼脂糖微粒悬液的纸巾;假手术组,只在血管外膜单纯包裹吸附含生理盐水琼脂糖微粒的纸巾(无IL-1β),关胸。待动物恢复自主呼吸后,拔掉气管插管。术后给与青霉素肌注,单圈饲养,假手术组和模型组继续喂养普通饲料,而通心络组继续喂养通心络[1 g/( kg·d)],共2周。
, 百拇医药
冠状动脉造影
经动物颈动脉插管行冠脉造影,观察局部冠状动脉狭窄情况。用血管造影系统连续观察记录造影图像,全部冠脉造影资料采用CRS-PC系统,按照标准方法学定量分析病变长度、管腔狭窄百分比及管腔狭窄面积。
病理检查
处死动物截取包裹纸巾的冠脉节段,分为两段用于光镜检测和分子生物学检测。
光镜 HE染色,观察血管形态学变化,采用计算机图像分析系统测管腔面积(CA)、内弹力板包绕面积(IEL)、外弹力板包绕面积(EEL)。计算新生内膜面积[(NIA)=IEL- CA和中膜面积(MA)=EEL-IEL] 。
逆转录聚合酶链反应 测定血管壁组织MCP-1、P选择素、E选择素、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达。
, 百拇医药
(1)采用异硫氰酸胍法提取血管标本中的总RNA。取1 μl总RNA,采用逆转录试剂盒(RNA PCR Kit)合成cDNA。(2)取2 μl逆转录产物进行PCR扩增反应。MCP-1引物序列扩增产物长度为750 bp。P选择素引物序列扩增产物长度为547 bp。E选择素引物序列扩增产物长度为242 bp。VCAM-1引物序列扩增产物长度为417 bp。ICAM-1引物序列扩增产物长度为352 bp。GAPDH引物序列扩增产物长度为245 bp。扩增条件为90℃预变性10分钟后进行以下循环:94℃变性80秒,55℃退火90秒,72℃延伸60秒。循环30次,最后72℃延伸10分钟。取5 μl扩增产物,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化已啶染色,然后经凝胶图像扫描,进行光密度分析,测定样本mRNA的相对表达量。
(未完待续)
表1 冠状动脉造影测量结果(X±s)
组别(n=8)
, http://www.100md.com
管腔狭窄程度(%)
管腔狭窄面积(%)
假手术组
0
0
模型组
20.12±3.34
18.26±4.68
通心络组
8.21±1.04*
6.89±2.45
注:通心络组与模型组相比,*为P<0.05。
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表2 血管形态学测量结果比较(mm2,X±s)
组别(n=8)
管腔面积
新生内膜面积
中膜面积
假手术组
2.33±0.66
1.02±0.22
模型组
1.65±0.40
0.73±0.15
1.02±0.34
, 百拇医药
通心络组
2.02±0.58*
0.31±0.06*
1.02±0.09
注:与模型组相比,*为P<0.05。
表3 MCP-1、P选择素、E选择素、VCAM-1、ICAM-1 mRNA表达的光密度扫描值(X±s)
假手术组
模型组
通心络组
MCP-1/GAPDH
12.4±3.14
, 百拇医药
63.0±13.83*
20.1±3.45a
P选择素/GAPDH
23.4±4.41
74.4±3.12*
43.5±6.4a
E选择素/GAPDH
79.1±12.1*
36.9±2.24a
VCAM-1/GAPDH
28.6±4.46
, http://www.100md.com
87.7±6.12*
35.7±2.56a
ICAM-1/GAPDH
14.6±0.54
54.1±9.01*
28.2±1.78a
注:模型组与假手术组相比,*为P<0.05;通心络组与模型组相比,*为P<0.05。
图1 各组冠状动脉造影图像
注:A为假手术组,前降支、回旋支均无狭窄;B为模型组,前降支、回旋支约20%~30%狭窄;C为通心络组,前降支、回旋支可见10%左右轻度狭窄。
HE染色(×10) HE染色(×10) HE染色(×10)
图2 各组手术处理血管段病理学图像
A为假手术组,B为模型组,C为通心络组。
(表1~3,图1~2相关内容见下期), http://www.100md.com