肝细胞生长因子刺激大鼠离体肝细胞

    DNA合成的剂量2与时间2效应3

    邹 原 梅懋华

    (大连医科大学生理教研室 , 大连 116023)

    摘要 本工作采用3

    H2TdR掺入DNA法观察重组人肝细胞生长因子(r2hHGF)刺激大鼠离体肝细胞DNA合成的剂

    量与时间效应。实验结果表明:r2hHGF是最强的促肝细胞分裂剂 ,在一定剂量范围内 ,r2hHGF 与肝细胞 DNA 合成

    有明显的量效关系。 1 ng/ ml r2hHGF即可引起3

    H2TdR掺入显著增加( P < 0. 01) ,随剂量增加 ,刺激 DNA 合成的效

    应也随之增强;10 ng/ ml时3

    H2TdR掺入量最大 ,较对照组高 7 倍 ( P < 0. 001) , 剂量再增加即出现抑制效应; r2

    hHGF刺激肝细胞 DNA合成存在时间效应关系 ,表现为 r2hHGF 作用 24h ,DNA 合成量明显高于对照组( P < 0.

    01) ,48h作用达最高( P < 0. 001) ,随后开始下降 ,至 96h下降到相当于 24h的水平。

    关键词 肝细胞生长因子 DNA合成 原代肝细胞培养

    X 肝细胞生长因子 ( hepatocyte growth factor ,HGF) 是晚近新发现的生长因子[1 ]

    ,是由分子量

    75kD的α链和30kD的β链通过二硫键连接而成的

    二聚体。 HGF 在体内广泛分布 ,存在于肝、肾、脾、肺、脑、胸腺、胰腺、甲状腺、唾液腺等处。它是多效性

    因子 ,具有促细胞分裂剂(mitogen) 、促细胞运动剂

    (motogen)和促形态形成剂(morphogen)等作用 ,还

    能抑制几种肿瘤细胞生长 , 如黑色素瘤及鳞状细胞

    癌等。 HGF 受体是原癌基因 c2met 产物 ,为一跨膜

    蛋白 ,分子量为 190kD。由于 HGF 在体内分布的广

    泛性及其生物活性的多样性 ,HGF 已成为热门研究

    课题。

    大鼠肝部分切除 (PH) 或用 CCl4 染毒 ,其血浆

    HGF水平比对照组分别高 17 倍和 13 倍[2 ]。患暴发

    性肝衰病人血中 HGF 水平较正常人高 30 倍[3 ]。在

    这些情况下 ,HGF 水平的升高的生物学意义何在 ?

    它除了促进肝细胞分裂增殖以加速受损肝恢复外 ,是否还具有保护肝脏作用 ?这是值得进一步探讨的

    课题。我们已往的研究结果表明[4 ]

    ,从初生大鼠肝、成年大鼠 PH后的再生肝以及人胎肝提出的肝刺激

    因子(HSS) ,对染毒的肝细胞具有保护作用 ,它不仅

    可以促进肝细胞 DNA 合成 , 还可以提高肝细胞抗

    肝毒剂损伤能力。鉴于 HGF 和 HSS均可从受损肝

    及再生肝中提取 ,肝毒剂损伤或 PH 后二者含量均

    升高 ,二者均能刺激肝细胞分裂增殖 ,故我们推测

    HGF也可能具有保肝作用。在进行 HGF 保肝研究

    之前 ,首先应了解 HGF 刺激大鼠培养肝细胞 DNA

    合成剂量2与时间2效应关系。为此 ,本工作采用3

    H2

    TdR掺入DNA法 ,观察了 HGF 对原代培养大鼠肝

    细胞DNA 合成的作用 ,为进一步研究 HGF 的保肝

    作用提供实验依据。

    1 材料和方法

    1. 1 动物

    采用 Sprague2Dawley ( SD)雄性大鼠 ,体重 180

    - 220g ,分笼饲养于温度控制 ( 20 ±1 ℃ ) 和光控

    (06 :00 - 18 :00)的房间内 ,标准鼠食 ,自由饮水。

    1. 2 试剂

    重组人肝细胞生长因子( r2hHGF) 、胶原酶( Ⅳ

    型) 、胰岛素均为 Sigma 公司产品 ( St . Louis ,MO

    USA) ,RPMI21640 人工合成培养基为 Gibco 公司产

    品( Grand Island ,N Y USA) ,胰蛋白酶为 Difco 进口

    分装(1 :250 ,上海化学试剂采购供应站分装厂) ,牛

    血清白蛋白(BSA) 为上海松江精益试剂仪器厂产

    品。

    1. 3 肝细胞的分离和培养

    按照 Seglen 法[5 ]

    略加修改。简述如下:轻度乙

    醚麻醉大鼠 ,剖腹后作门静脉插管 ,剪断下腔静脉。

    用D2Hanks 液快速灌流以冲去残血 ,灌速 30 -

    40ml/ min , 约10min后换含0. 05 %胶原酶的 Han2

    ks液灌流 ,灌速 5ml/ min ,灌流 10min 左右 ,待肝脏

    失去弹性并出现裂纹后 , 取下肝脏 , 轻轻撕去包

    膜 , 将肝细胞分散于预冷的 Hanks液中 ,200 目滤

    网滤过 ,离心清洗三次 (600rpm/ min 40s , 500rpm/

    min 50s和 1000rpm/ min 60s) ,将肝细胞悬浮于含

    35 中国应用生理学杂志1997 ;13 (1)

    X 国家自然科学基金资助 ( №. 39470275)

    1996 - 3 - 5 收稿 1996 - 4 - 30 修回10 %小牛血清 ( 56 ℃, 30min 补体灭活) 的 RPMI2

    1640 的培养液中 ( RPMI21640 培养基 , 青霉素

    100U/ ml ,链霉素 100 μg/ ml , 胰岛素 10 - 8

    mol/ L ,地

    塞米松 10 - 6

    mol/ L) 。用 0. 4 %台盼蓝排除法测细胞

    存活率 ,达 90 %以上者用于实验。调细胞密度至 1 ×

    105

    细胞/ ml , 接种于 96 孔细胞培养板(Costar)中 ,置于饱和湿度 , 37 ℃及 5 %CO2 的培养箱中培养。

    18 - 20h 后换以含 r2hHGF的无血清 RPMI21640 培

    养液 , 以后每天换液一次。r2hHGF 用 0. 02mol/ L

    PBS(含 1 %BSA ,0. 35mol/ L NaCl ,pH = 7. 0)配制 ,并用此 PBS作对照实验。

    1. 4 DNA合成的鉴定

    测定DNA合成前 24h ,每孔加3

    H2TdR (中国原

    子能科学研究所) 5 μCi/ ml。测定前用 PBS (pH7. 4)

    洗孔 2 - 3 次 ,再加 0. 25 %胰蛋白酶和 0. 02 %ED2

    TA混合液(1 :3)消化 ,待细胞全部悬浮后 ,用 DYQ2

    Ⅱ型多头收集器将孔内细胞收集于 49 型纤维滤纸

    上 ,红外线烤干 ,置于微杯中 ,加闪烁液 ,用 FJ 2105

    全自动液闪计数器计数。实验进行两次 ,每次实验中

    每份样品三个复孔。以 cpm/孔代表3

    H2TdR 掺入

    DNA的量。

    1. 5 统计处理

    各组数据以均值 ±标准差( x ±s)表示 , P值经

    过 t 检验。

    2 结果

    2. 1 人肝细胞生长因子刺激肝细胞DNA合成的量

    效关系

    Fig. 1 Effect of r2hHGF on DNA synthesis with dose2dependent man2

    ner in rat hepatocytes in vit ro.

    □:cont rol : ■:r2hHGF

    实验用 r2hHGF剂量分别为 0. 5 ,1 ,2 ,5 ,10 ,20

    和 40ng/ ml。持续作用 48h 后收集细胞 ,测定3

    H2

    TdR掺入肝细胞 DNA 的量 ......