第八章 配子与胚胎生物技术.ppt
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第八章 配子与胚胎生物技术
第一节 动物胚胎移植
胚胎移植(embryo transfer)：将动物的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。
提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。
一、胚胎移植发展历史
二、胚胎移植的意义
三、胚胎移植的生理学基础和原则
(一)生理学基础
(二)胚胎移植的基本原则
(三)胚胎移植应具备的基本条件
四、胚胎移植的技术程序
胚胎移植时，希望一次从供体母畜得到多数胚胎，所以要进行超数排卵处理，同时，胚胎移植成功的根本条件是供体和受体必须同时发情，故需人为控制供受体的发情时间，进行同期化处理。
(一)供受体准备
选择的供体不但应有育种上的价值，期望从它们得到很多的后代，而且生殖机能应处于较高的水平。
受体母畜可选用非优良品种的个体或土种家畜但亦应具有良好的繁殖性能和健康状态，体型中上等。
(二)超数排卵
在母畜发情周期的适当时间，注射促性腺 激素，使卵巢中比在自然情况下有较多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵(superovulation)，简称超排。
超数排卵主要应用于牛和羊，效果明显，对于产多胎的猪意义不大，而母马很难产生反应。一般认为以10～20个最为理想。
1.母牛
2、母羊
(三)供体母畜的配种
超数排卵处理的母畜发情后，根据育种的需要，应选择优良公畜的精液，在适宜时间进行人工授精。为了得到较多的发育正常的胚胎，应使用活率高密度大的精液，而且将授精次数增加到2次或3次，两次间隔8～10h。
(四)胚胎的收集
胚胎的收集是利用冲洗液将胚胎由生殖道中冲洗，并收集在器皿中。
冲洗时要考虑到配种时间、发生排卵的大致时间、胚胎的运行速度和发育阶段等因素，只有这样，才能顺利迅速地进行操作，得到较高的收集率。关于各种家畜受精后胚胎发育的速度和运行情况(所处部位)收集时间不应早于排卵后的第一天，亦即最早要在发生第一次卵裂
之后，否则不宜辨别卵子是否已受精。一般是在配种后3～8d，发育至4～8个细胞以上为宜。牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植(配种后6～8d)。
1.手术法收集胚胎
按照外科手术的要求，在腹部适当部位作一切口，用注射器吸取冲洗液注入输卵管或子宫角内，进行冲洗，同时观察卵巢上的排卵情况，计算排卵率。冲洗部位决定于胚胎所处位置，亦即取决于冲洗是在配种后的第几天进行以及胚胎的运行速度。
冲洗操作，要求迅速准确，防止对伤口、生殖器官和冲洗液的污染，避免对动物有过多刺激和对生殖器官造成损伤。一般来说，术后生殖道易发生不同程度的粘连，严重时会造成不孕。这是手术法的最大缺点。冲洗之后，立即缝合伤口，宜单独饲养，注意伤口愈合情况。
2.非手术法收集胚胎
牛的非手术收集胚胎可利用二路式导管冲卵器，将冲洗液通过内管注入子宫角内，然后导出冲洗液，外管前端连接以气囊，当将冲卵器插入子宫内时，充气使气囊胀大，堵住子宫颈内口以免冲洗液经子宫颈流出。
非手术法冲取胚胎，每侧子宫角需用冲洗液100～150ml。应用非手术法冲洗收集胚胎时，只能当胚胎都进入子宫角后进行。牛、马的胚胎用非手术法收集时，一般在配种后6～8d进行。
3.冲洗液
收集胚胎的冲洗液有多种，在早期的胚胎移植试验中，各种生理盐液如林格氏液、洛克氏液、台氏液等和自体血清以及血清和盐液的混合液，曾作为冲洗收集胚胎之用。现在多采用杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)、布林斯特液(Brinster's medium-3)、合成输卵管液(SOF)、惠屯氏液(Whitten's medium)、海姆氏液(Ham's F-10)以及199培养液(TCM199)。它们除含各种盐类外，还含有多种有机成分，不但用于冲洗收集胚胎，还用于体外培养、冷冻保存和解冻等处理程序。
(五)胚胎的检查
* 收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况。正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)一般外形整齐清晰，大小较一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。
(六)胚胎的保存和培养
* 保存是使胚胎在体外一定条件下(降温)停止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时，升温后进行移植。
* 培养则是在体温条件下，于培养液中，使之继续发育。
* 放在室温条件下，胚胎只能存活10～20h。当温度降至20℃以下时，胚胎即停止发育，存活时间可以延长。
* 胚胎在体温环境下(37℃)的培养，有一部分可正常发育，但发育持续的时间和达到的阶段也是非常有限的，一般只能持续3～4d。
* 利用兔体(输卵管)进行活体内培养(保存)，然后再取出移植至同种畜体内，在羊、猪、牛、马都已试验成功，经过长途运输，移植后妊娠产仔，但必须进行两次冲洗和移植的手术，降低了它的实用价值。
* 冷冻长期保存牛、绵羊、山羊的胚胎经冷冻解冻后能够存活，且移植后均可受胎产仔。
* 在冷冻前需先依次经过含有由低浓度到高浓度防冻剂的杜氏培养液，防冻剂的最高梯度为1.0～1.5mol/L。每种浓度中停留5～10min，在最后一种浓度中降温冷冻。胚胎冷冻时必须采取缓慢降温。由室温降至-5℃～-7℃，每分钟降1℃，在此温度下进行诱发结冰，然后按每分钟降0.3℃～0.5℃的速度降至-33℃～-38℃，此后可直接浸入液氮保存。
* 解冻时不必控制升温速度，可直接放在室温条件下(20℃～25℃)或在35℃～37℃水浴中解冻。
* 解冻后必须再把防冻剂清除掉。方法是使胚胎按相反的方向(由高浓度向低浓度)依次通过含有不同浓度的防冻剂的培养液，最后移至不含防冻剂的培养液中进行移植。
* 牛胚胎冷冻较新的一种方法是在塑料细管中进行冷冻，一端装有胚胎和冷冻培养液，另一端为蔗糖液，解冻后随即被蔗糖液稀释，以冲淡防冻剂的含量，将塑料管直接装入移植器中，然后注入子宫。
(七)胚胎的移植
* 胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物
1.手术法移植
* 在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，用注射器或移植管将胚胎注入到同侧子宫角上端或输卵管壶腹部内(以胚胎发育阶段而定)。只需吸取少量的冲洗液连同胚胎一块注入。
2.非手术移植法
* 牛的非手术移植，主要方式是将一只手伸入直肠，先检查黄体位于哪一侧和发育情况，然后握住子宫颈(如同人工授精操作一样)，另一只手将移植管(注射器连接以导管或特制金属移植器)插入与黄体同侧的子宫角内，注入胚胎。
(八)供体和受体的术后观察
* 对术后的供体和受体不但要求注意它们的健康情况 ......
第八章 配子与胚胎生物技术
第一节 动物胚胎移植
胚胎移植(embryo transfer)：将动物的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。
提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。
一、胚胎移植发展历史
二、胚胎移植的意义
三、胚胎移植的生理学基础和原则
(一)生理学基础
(二)胚胎移植的基本原则
(三)胚胎移植应具备的基本条件
四、胚胎移植的技术程序
胚胎移植时，希望一次从供体母畜得到多数胚胎，所以要进行超数排卵处理，同时，胚胎移植成功的根本条件是供体和受体必须同时发情，故需人为控制供受体的发情时间，进行同期化处理。
(一)供受体准备
选择的供体不但应有育种上的价值，期望从它们得到很多的后代，而且生殖机能应处于较高的水平。
受体母畜可选用非优良品种的个体或土种家畜但亦应具有良好的繁殖性能和健康状态，体型中上等。
(二)超数排卵
在母畜发情周期的适当时间，注射促性腺 激素，使卵巢中比在自然情况下有较多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵(superovulation)，简称超排。
超数排卵主要应用于牛和羊，效果明显，对于产多胎的猪意义不大，而母马很难产生反应。一般认为以10～20个最为理想。
1.母牛
2、母羊
(三)供体母畜的配种
超数排卵处理的母畜发情后，根据育种的需要，应选择优良公畜的精液，在适宜时间进行人工授精。为了得到较多的发育正常的胚胎，应使用活率高密度大的精液，而且将授精次数增加到2次或3次，两次间隔8～10h。
(四)胚胎的收集
胚胎的收集是利用冲洗液将胚胎由生殖道中冲洗，并收集在器皿中。
冲洗时要考虑到配种时间、发生排卵的大致时间、胚胎的运行速度和发育阶段等因素，只有这样，才能顺利迅速地进行操作，得到较高的收集率。关于各种家畜受精后胚胎发育的速度和运行情况(所处部位)收集时间不应早于排卵后的第一天，亦即最早要在发生第一次卵裂
之后，否则不宜辨别卵子是否已受精。一般是在配种后3～8d，发育至4～8个细胞以上为宜。牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植(配种后6～8d)。
1.手术法收集胚胎
按照外科手术的要求，在腹部适当部位作一切口，用注射器吸取冲洗液注入输卵管或子宫角内，进行冲洗，同时观察卵巢上的排卵情况，计算排卵率。冲洗部位决定于胚胎所处位置，亦即取决于冲洗是在配种后的第几天进行以及胚胎的运行速度。
冲洗操作，要求迅速准确，防止对伤口、生殖器官和冲洗液的污染，避免对动物有过多刺激和对生殖器官造成损伤。一般来说，术后生殖道易发生不同程度的粘连，严重时会造成不孕。这是手术法的最大缺点。冲洗之后，立即缝合伤口，宜单独饲养，注意伤口愈合情况。
2.非手术法收集胚胎
牛的非手术收集胚胎可利用二路式导管冲卵器，将冲洗液通过内管注入子宫角内，然后导出冲洗液，外管前端连接以气囊，当将冲卵器插入子宫内时，充气使气囊胀大，堵住子宫颈内口以免冲洗液经子宫颈流出。
非手术法冲取胚胎，每侧子宫角需用冲洗液100～150ml。应用非手术法冲洗收集胚胎时，只能当胚胎都进入子宫角后进行。牛、马的胚胎用非手术法收集时，一般在配种后6～8d进行。
3.冲洗液
收集胚胎的冲洗液有多种，在早期的胚胎移植试验中，各种生理盐液如林格氏液、洛克氏液、台氏液等和自体血清以及血清和盐液的混合液，曾作为冲洗收集胚胎之用。现在多采用杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)、布林斯特液(Brinster's medium-3)、合成输卵管液(SOF)、惠屯氏液(Whitten's medium)、海姆氏液(Ham's F-10)以及199培养液(TCM199)。它们除含各种盐类外，还含有多种有机成分，不但用于冲洗收集胚胎，还用于体外培养、冷冻保存和解冻等处理程序。
(五)胚胎的检查
* 收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况。正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)一般外形整齐清晰，大小较一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。
(六)胚胎的保存和培养
* 保存是使胚胎在体外一定条件下(降温)停止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时，升温后进行移植。
* 培养则是在体温条件下，于培养液中，使之继续发育。
* 放在室温条件下，胚胎只能存活10～20h。当温度降至20℃以下时，胚胎即停止发育，存活时间可以延长。
* 胚胎在体温环境下(37℃)的培养，有一部分可正常发育，但发育持续的时间和达到的阶段也是非常有限的，一般只能持续3～4d。
* 利用兔体(输卵管)进行活体内培养(保存)，然后再取出移植至同种畜体内，在羊、猪、牛、马都已试验成功，经过长途运输，移植后妊娠产仔，但必须进行两次冲洗和移植的手术，降低了它的实用价值。
* 冷冻长期保存牛、绵羊、山羊的胚胎经冷冻解冻后能够存活，且移植后均可受胎产仔。
* 在冷冻前需先依次经过含有由低浓度到高浓度防冻剂的杜氏培养液，防冻剂的最高梯度为1.0～1.5mol/L。每种浓度中停留5～10min，在最后一种浓度中降温冷冻。胚胎冷冻时必须采取缓慢降温。由室温降至-5℃～-7℃，每分钟降1℃，在此温度下进行诱发结冰，然后按每分钟降0.3℃～0.5℃的速度降至-33℃～-38℃，此后可直接浸入液氮保存。
* 解冻时不必控制升温速度，可直接放在室温条件下(20℃～25℃)或在35℃～37℃水浴中解冻。
* 解冻后必须再把防冻剂清除掉。方法是使胚胎按相反的方向(由高浓度向低浓度)依次通过含有不同浓度的防冻剂的培养液，最后移至不含防冻剂的培养液中进行移植。
* 牛胚胎冷冻较新的一种方法是在塑料细管中进行冷冻，一端装有胚胎和冷冻培养液，另一端为蔗糖液，解冻后随即被蔗糖液稀释，以冲淡防冻剂的含量，将塑料管直接装入移植器中，然后注入子宫。
(七)胚胎的移植
* 胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物
1.手术法移植
* 在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，用注射器或移植管将胚胎注入到同侧子宫角上端或输卵管壶腹部内(以胚胎发育阶段而定)。只需吸取少量的冲洗液连同胚胎一块注入。
2.非手术移植法
* 牛的非手术移植，主要方式是将一只手伸入直肠，先检查黄体位于哪一侧和发育情况，然后握住子宫颈(如同人工授精操作一样)，另一只手将移植管(注射器连接以导管或特制金属移植器)插入与黄体同侧的子宫角内，注入胚胎。
(八)供体和受体的术后观察
* 对术后的供体和受体不但要求注意它们的健康情况 ......
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