血小板活化因子拮抗剂对急性肝脏损害保护作用的实验研究
作者：张 帆 王家驰 过晋源
单位：(武汉，同济医科大学附属同济医院内科 430030)
关键词：血小板激化因子；动物，实验；肝
中华医学杂志900705
摘要 应用血小板活化因子(PAF)特异性拮抗剂(WEB2086)对D-氨基半乳糖加内毒素 (GalN/E)引起的大鼠急性肝脏损害模型进行了研究。结果，WEB2086可明显减轻由GalN/E引起的肝脏损害，WEB2086可显著减少肝脏损害时过氧化脂质和骨过氧化物酶的升高，防止超氧化物歧化酶活性降低。提示PAF可能通过活化粒细胞，产生氧自由基等，在肝脏损害的发病过程中起到重要的介质作用。
血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)是近年来在炎性和过敏反应中发现的一种炎性介质，它具有引起血小板聚集、活化中性粒细胞、抑制心肌收缩力和增加血管通透性等生物活性，而在内毒素、创伤、失血和过敏性休克等病理生理过程中起到重要作用[1，2]。鉴于急性肝脏损害的发生常与炎性反应、过敏反应、内毒素血症等有关。因此，我们应用PAF特异性拮抗剂(WEB2086)来观察对D-氨基半乳糖胺加内毒素(GalN/E)引起大鼠急性肝脏损害的影响，以探讨PAF与肝脏损害的关系和WEB2086对损害时的影响。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料
SD雄性大鼠59只，体重180～250g。腹腔注射半乳糖胺500mg/kg和内毒素0.1mg/mg/(GalN/E)。以诱导大鼠急性肝脏损害。分别在注射后4小时和24小时处死大鼠。在4小时处死的大鼠分为GalN/E组6只，用WEB2086 40mg/kg处理组6只。在24小时处死的大鼠中分为1组：GalN/E组17只；2组：WEB2086 1mg/kg处理5只；3组：用WEB2086 20mg/kg处理5只；4组：用WEB2086 40mg/kg处理10只；5组：正常对照组10只，仅在腹腔内注射生理盐水(1ml/100g)。各WEB2086处理组均于注射GalN/E前半小时腹腔注射WEB2086 1次(按各组不同剂量)。大鼠均在戊巴比妥(30mg/kg)麻醉下剖腹。从下腔静脉抽血，并取肝组织标本待测。
WEB2086：联邦德国Boehrnger Ingelheim公司Heuer博士馈赠。半乳糖胺：重庆医科大学化学教研室提供。内毒素：上海生物制品研究所生产的精制大肠杆菌O111B4内毒素。
, 百拇医药
二、检测指标
1. 血清酶学：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、酸性磷酸酶(ACP)。(ACP用对-硝基酚法测定)。
2. 肝匀浆过氧化脂质(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定：取1g肝组织于4°C 0.15mol/L KCl溶液(1：10)中，在冰浴中研磨成肝匀浆。MDA按Ohkawa方法[3]测定；SOD按 Misra方法[4]测定。肝匀浆蛋白含量用Lorry法测定。
3. 肝匀浆骨过氧化物酶(MPO)的检测。用邻联大茴香铵还原法[5]测定，以对照组每毫克蛋白的光密度变化值为1个酶活性单位。
4. 病理学检查：取肝右叶组织1g于2.5%戊二醛液中固定2小时后作电镜标本。取肝右叶组织1块置10%甲醛液中固定，石蜡包埋切片，HE染色。根据文献[6]略加修改将光镜下肝脏损害程度分为5级：0级：肝小时结构正常，肝细胞无明显异常；1级：肝细胞仅有变性或点状肝细胞坏死；2.级：肝细胞灶状或片状坏死，但坏死程度小于整个肝组织切片的25%；3级：肝细胞坏死量占整个切片的25～50%；4级：肝细胞坏死量大于整个肝组织的50%。
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结 果
一、血清学检查
大鼠注射GalN/E24小时后，ALT、AST和ACP值均显著高于对照组(P〈0.01)；应用WEB2086(1mg/kg)时，ALT值比GalN/E组虽有明显降低(P〈0.05)，但AST和ACP值与GalN/E组差异无显著意义(P〉0.05)；当增加WEB2086的剂量到20mg/kg或40mg/kg时，ALT、AST和ACP值则明显低于GalN/E组(P〈0.01)，其中ALT降低与WEB2086的剂量增加呈负相关(P〈0.05)。但各组ALT、AST和ACP值仍明显高于正常对照组(P〈0.01)(表1)。在GalN/E组中，24小时大鼠死亡率为23 5%(4/17)，而用WEB2086的各组均无死亡。
表1 各组在肝脏损害时的血清学变化(U，
± S) 分组
, 百拇医药
动物数
(只)
ALT
AST
ACP
给药4小时
WEB2086组
6
147±53ΔΔ
121±27ΔΔ
240±36ΔΔ
GalN/E组
6
, 百拇医药
111±27ΔΔ
108±15ΔΔ
218±40ΔΔ
给药2小时
1组
17
2138±727ΔΔ
1386±529ΔΔ
706±253ΔΔ
2组
5
1504±591ΔΔ*
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1164±180ΔΔ
540±104ΔΔ
3组
5
955±66ΔΔ**
888±227ΔΔ**
334±186Δ**
4组
10
767±766ΔΔ**
391±303ΔΔ**
310±198**
, 百拇医药
5组
10
28±17
42±12
187±32
注：与5组(正常对照组)比 Δ P〈0.05， ΔΔ P〈0.01；
与1组(GalN/E组)比 *P〈0.05， ** P〈0.01
注射GalN/E 4小时的大鼠，ALT、AST和ACP值也明显高于对照组(P〈0.01)，但显著低于GalN/E 24小时的酶学变化(P〈0.01)。预防性应用WEB2086(40mg/kg)未能明显改善GalN/E引起血清酶活性增加。
二、肝脏MDA、SOD和MPO值的测定
, 百拇医药
注射GalN/E24小时后的大鼠,肝脏MDA和MPO值均明显升高(P〈0.01)，同时SOD值显著降低(P〈0.01)。应用WEB2086(40mg/kg)后，可明显防止GalN/E所致肝脏MDA和MPO值的升高(P〈0.05～0.01)，并减少SOD值的降低(P〈0.01)(表2)。
表2 注射GalN/E 24小时WEB2086对MDA、M、SOD和MPO值的影响 分组
动物数
(只)
MDA
(nmol/mg)
SOD
(U/mg)
, http://www.100md.com MPO
(U/mg)
正常对照组
10
1.3±0.3
8.4±1.7
1.00±0.13
GalN/E组
13
8.9±4.9Δ
3.6±2.3Δ
3.58±1.89Δ
, 百拇医药 WEB2086
(40mg/kg)
10
4.7±3.3*Δ
6.7±2.8**
1.16±0.56**
注：与GalN/E组比较 * P〈0.05， ** P〈0.01；
与正常对照组比较 Δ P〈0.01
三、肝脏组织学观察
光镜观察肝脏组织受损程度结果见表3，给予GalN/E 4小时，肝细胞仅为轻度水样变性，点状坏死，偶见灶状坏死，两组的肝脏损害无明显差异。说明对短期肝脏损害WEB2086无明显防护作用。当GalN/E诱导肝脏损害24小时后，肝细胞坏死程度明显加剧。表现为弥漫性片状坏死，肝小叶结构消失，肝内出血，伴有大量炎性细胞浸润和胆色素颗粒沉着，预防性应用WEB2086可明显减轻肝细胞坏死的发生。且与WEB2086用药量呈显著负相关(γ=-0.66，P〈0.01)。
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表3 光镜下肝脏受损程度的分级 分组
动物数
(只)
分级
0
1
2
3
4
给药4小时
WEB2086组
6
0
, 百拇医药
2
4
0
0
GalN/E组
6
0
4
2
0
0
给药24小时
1组
17
, 百拇医药
0
0
2
5
10
2组
5
0
0
0
2
3
3组
5
, 百拇医药
0
0
2
2
1
4组
10
0
4
4
1
1
5组
10
, 百拇医药
10
0
0
0
0
电镜观察GalN/E诱导肝脏损害24小时后，肝窦明显扩张，窦腔内充满坏死的细胞碎屑，肝细胞内质网扩张空泡化，线粒体肿胀，嵴消失，甚至空泡化，胞浆内糖原明显减少或消失。而WEB2086(40mg/kg)组的肝脏电镜仅表现为肝窦轻度扩张，胞浆内糖原丰富，内质网无明显异常，线粒体体积虽有增大，但无明显嵴肿胀，窦内皮细胞有轻度受损，偶见灶状肝细胞坏死。讨 论
PAF拮抗剂是一类能在动物模型中抑制PAF生物作用的的药物，并可作为研究PAF的病理生理机制[7]。WEB2086是其中的一种新型强效特异性拮抗剂[8]。
, 百拇医药
PAF是一种与花生四稀酸代谢密切相关的磷脂，它主要由受损害的细胞膜所释放。多种细胞都可合成和释放PAF，如内皮细胞，中性粒细胞、单核-巨噬细胞、血小板等[9]。木冈清英等[10]发现，内毒素诱导小鼠暴发性肝功能衰竭时，肝脏Kupffer细胞产生PAF增多，内毒素可刺激腹腔巨噬细胞合成和释放PAF[11]。我们应用PAF拮抗剂可防止GalN/E诱导的肝脏损害，提示GalN/E引起肝脏损害时，肝脏可能合成和释放PAF增多。
PAF合成释放增多在肝脏损害中的作用机制尚不清楚。本实验结果提示可能与以下三方面作用有关：(1)活化粒细胞：GalN/E引起肝脏损伤时，肝脏粒细胞标记酶——MPO活性明显增高，WEB2086可显著减少MPO活性的增加，这间接地说明PAF可能与粒细胞活化有关。Valone等[12]报道，PAF可刺激并增加人体单核细胞的细胞毒性作用。WEB2086可特异性地抑制PAF所诱导的粒细胞活化[7，8]。(2)防止氧自由基产生：给予大鼠GalN/E 24小时后，肝脏脂质过氧化物显著升高，而氧自由基清除剂SOD则明显降低；应用WEB2086可有效地防止肝脏MDA的升高和SOD的降低，提示WEB2086对肝损害的保护作用可能与抑制自由基产生有关。近年来研究表明，氧自由基可导致细胞膜，酶及核酸等蛋白质的结构和活性改变。氧自由基主要来源于粒细胞活化和黄嘌呤氧化酶系统。PAF不仅具有活化粒细胞的作用，而且可通过诱导血小板聚积产生血栓、增加血管通透性而引起组织水肿，从而导致组织缺血，并激活黄嘌呤氧化酶系统产生氧自由基。(3)稳定溶酶体膜：ACP是肝细胞溶酶体的标记酶，本实验观察到，WEB2086可明显耻止在GalN/E诱导肝脏损害时ACP的漏出，说明WEB2086可能具有稳定溶酶体膜的作用。
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本实验应用PAF拮抗剂虽能有效地减轻由Galn/E引起的肝脏损害，但并不能完全防止。这表明在肝脏损害过程中，除PAF外，可能还有许多其它炎性介质参与，如白三烯、肿瘤坏死因子、血栓素等。PAF拮抗剂并不能清除GalN/E对肝脏的直接毒性作用，但能防止各种毒性物质通过PAF而介导肝脏损害的发生。
参考文献
1. Terashita Z, et al. Protective effects of a platelet activating factor antagonist and its combined treatment with prostaglandin El in traumatic shock. J Cardiovas Pharmacol 1988；12：505.
2. Stahl GL, et al. Detection of PAF during traumatic shock. Circ Shock 1988；26：237.
, http://www.100md.com
3. Ohkawa L, et al. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobartituric acid reaction. Anal Biochem 1979；95：351.
4. Misra HP, et al. The role of superoxide anion the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxid dimudase. J Biol Chem 1972；247：317.
5. Krawitsz JE, et al. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Gastroenterology 1984；87：1344.
, 百拇医药
6. Villarruel MC, et al. Studies on the mechanism of alloxandiabetes potentiation of carbon tetrachloride-induced liver. Br J Exp Path 1982；63：388.
7. Casals-Stenzel J, et al. Pharmacology of PAF antagonists. Prog Biochem Pharmacol 1988；22：58.
8. Casals-Stenzel J, et al. Pharmacological actions of WEB2086,a new specific antagonist of platelet activating factor. J Pharmacol Exp Ther 1987；241：974.
, 百拇医药 9. Terashita Z, et al. Is PAF a mediator of endotoxin shock?Eur J Pharmacol 1987；241：97.
10. 木冈清英，他.实验的急性肝不全诱导マヴスにおける肝粘着性细胞の血小板活化因子产生について.日本消化器病学会杂志 1989；86：759.
11. Inarrea P, et al. Synthesis of PAF-acether and blood volume changes in grqm negative sepsis. Immunopharmacology 1985；9：45.
12. Valone FH, et al. Enhanced human monocyte cytotoxicity by PAF Immunology 1988；64：715.
(1990年1月16日收稿 同年4月12日修回), 百拇医药
单位：(武汉，同济医科大学附属同济医院内科 430030)
关键词：血小板激化因子；动物，实验；肝
中华医学杂志900705
摘要 应用血小板活化因子(PAF)特异性拮抗剂(WEB2086)对D-氨基半乳糖加内毒素 (GalN/E)引起的大鼠急性肝脏损害模型进行了研究。结果，WEB2086可明显减轻由GalN/E引起的肝脏损害，WEB2086可显著减少肝脏损害时过氧化脂质和骨过氧化物酶的升高，防止超氧化物歧化酶活性降低。提示PAF可能通过活化粒细胞，产生氧自由基等，在肝脏损害的发病过程中起到重要的介质作用。
血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)是近年来在炎性和过敏反应中发现的一种炎性介质，它具有引起血小板聚集、活化中性粒细胞、抑制心肌收缩力和增加血管通透性等生物活性，而在内毒素、创伤、失血和过敏性休克等病理生理过程中起到重要作用[1，2]。鉴于急性肝脏损害的发生常与炎性反应、过敏反应、内毒素血症等有关。因此，我们应用PAF特异性拮抗剂(WEB2086)来观察对D-氨基半乳糖胺加内毒素(GalN/E)引起大鼠急性肝脏损害的影响，以探讨PAF与肝脏损害的关系和WEB2086对损害时的影响。
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材料与方法
一、材料
SD雄性大鼠59只，体重180～250g。腹腔注射半乳糖胺500mg/kg和内毒素0.1mg/mg/(GalN/E)。以诱导大鼠急性肝脏损害。分别在注射后4小时和24小时处死大鼠。在4小时处死的大鼠分为GalN/E组6只，用WEB2086 40mg/kg处理组6只。在24小时处死的大鼠中分为1组：GalN/E组17只；2组：WEB2086 1mg/kg处理5只；3组：用WEB2086 20mg/kg处理5只；4组：用WEB2086 40mg/kg处理10只；5组：正常对照组10只，仅在腹腔内注射生理盐水(1ml/100g)。各WEB2086处理组均于注射GalN/E前半小时腹腔注射WEB2086 1次(按各组不同剂量)。大鼠均在戊巴比妥(30mg/kg)麻醉下剖腹。从下腔静脉抽血，并取肝组织标本待测。
WEB2086：联邦德国Boehrnger Ingelheim公司Heuer博士馈赠。半乳糖胺：重庆医科大学化学教研室提供。内毒素：上海生物制品研究所生产的精制大肠杆菌O111B4内毒素。
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二、检测指标
1. 血清酶学：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、酸性磷酸酶(ACP)。(ACP用对-硝基酚法测定)。
2. 肝匀浆过氧化脂质(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定：取1g肝组织于4°C 0.15mol/L KCl溶液(1：10)中，在冰浴中研磨成肝匀浆。MDA按Ohkawa方法[3]测定；SOD按 Misra方法[4]测定。肝匀浆蛋白含量用Lorry法测定。
3. 肝匀浆骨过氧化物酶(MPO)的检测。用邻联大茴香铵还原法[5]测定，以对照组每毫克蛋白的光密度变化值为1个酶活性单位。
4. 病理学检查：取肝右叶组织1g于2.5%戊二醛液中固定2小时后作电镜标本。取肝右叶组织1块置10%甲醛液中固定，石蜡包埋切片，HE染色。根据文献[6]略加修改将光镜下肝脏损害程度分为5级：0级：肝小时结构正常，肝细胞无明显异常；1级：肝细胞仅有变性或点状肝细胞坏死；2.级：肝细胞灶状或片状坏死，但坏死程度小于整个肝组织切片的25%；3级：肝细胞坏死量占整个切片的25～50%；4级：肝细胞坏死量大于整个肝组织的50%。
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结 果
一、血清学检查
大鼠注射GalN/E24小时后，ALT、AST和ACP值均显著高于对照组(P〈0.01)；应用WEB2086(1mg/kg)时，ALT值比GalN/E组虽有明显降低(P〈0.05)，但AST和ACP值与GalN/E组差异无显著意义(P〉0.05)；当增加WEB2086的剂量到20mg/kg或40mg/kg时，ALT、AST和ACP值则明显低于GalN/E组(P〈0.01)，其中ALT降低与WEB2086的剂量增加呈负相关(P〈0.05)。但各组ALT、AST和ACP值仍明显高于正常对照组(P〈0.01)(表1)。在GalN/E组中，24小时大鼠死亡率为23 5%(4/17)，而用WEB2086的各组均无死亡。
表1 各组在肝脏损害时的血清学变化(U，
± S) 分组, 百拇医药
动物数
(只)
ALT
AST
ACP
给药4小时
WEB2086组
6
147±53ΔΔ
121±27ΔΔ
240±36ΔΔ
GalN/E组
6
, 百拇医药
111±27ΔΔ
108±15ΔΔ
218±40ΔΔ
给药2小时
1组
17
2138±727ΔΔ
1386±529ΔΔ
706±253ΔΔ
2组
5
1504±591ΔΔ*
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1164±180ΔΔ
540±104ΔΔ
3组
5
955±66ΔΔ**
888±227ΔΔ**
334±186Δ**
4组
10
767±766ΔΔ**
391±303ΔΔ**
310±198**
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5组
10
28±17
42±12
187±32
注：与5组(正常对照组)比 Δ P〈0.05， ΔΔ P〈0.01；
与1组(GalN/E组)比 *P〈0.05， ** P〈0.01
注射GalN/E 4小时的大鼠，ALT、AST和ACP值也明显高于对照组(P〈0.01)，但显著低于GalN/E 24小时的酶学变化(P〈0.01)。预防性应用WEB2086(40mg/kg)未能明显改善GalN/E引起血清酶活性增加。
二、肝脏MDA、SOD和MPO值的测定
, 百拇医药
注射GalN/E24小时后的大鼠,肝脏MDA和MPO值均明显升高(P〈0.01)，同时SOD值显著降低(P〈0.01)。应用WEB2086(40mg/kg)后，可明显防止GalN/E所致肝脏MDA和MPO值的升高(P〈0.05～0.01)，并减少SOD值的降低(P〈0.01)(表2)。
表2 注射GalN/E 24小时WEB2086对MDA、M、SOD和MPO值的影响 分组
动物数
(只)
MDA
(nmol/mg)
SOD
(U/mg)
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(U/mg)
正常对照组
10
1.3±0.3
8.4±1.7
1.00±0.13
GalN/E组
13
8.9±4.9Δ
3.6±2.3Δ
3.58±1.89Δ
, 百拇医药 WEB2086
(40mg/kg)
10
4.7±3.3*Δ
6.7±2.8**
1.16±0.56**
注：与GalN/E组比较 * P〈0.05， ** P〈0.01；
与正常对照组比较 Δ P〈0.01
三、肝脏组织学观察
光镜观察肝脏组织受损程度结果见表3，给予GalN/E 4小时，肝细胞仅为轻度水样变性，点状坏死，偶见灶状坏死，两组的肝脏损害无明显差异。说明对短期肝脏损害WEB2086无明显防护作用。当GalN/E诱导肝脏损害24小时后，肝细胞坏死程度明显加剧。表现为弥漫性片状坏死，肝小叶结构消失，肝内出血，伴有大量炎性细胞浸润和胆色素颗粒沉着，预防性应用WEB2086可明显减轻肝细胞坏死的发生。且与WEB2086用药量呈显著负相关(γ=-0.66，P〈0.01)。
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表3 光镜下肝脏受损程度的分级 分组
动物数
(只)
分级
0
1
2
3
4
给药4小时
WEB2086组
6
0
, 百拇医药
2
4
0
0
GalN/E组
6
0
4
2
0
0
给药24小时
1组
17
, 百拇医药
0
0
2
5
10
2组
5
0
0
0
2
3
3组
5
, 百拇医药
0
0
2
2
1
4组
10
0
4
4
1
1
5组
10
, 百拇医药
10
0
0
0
0
电镜观察GalN/E诱导肝脏损害24小时后，肝窦明显扩张，窦腔内充满坏死的细胞碎屑，肝细胞内质网扩张空泡化，线粒体肿胀，嵴消失，甚至空泡化，胞浆内糖原明显减少或消失。而WEB2086(40mg/kg)组的肝脏电镜仅表现为肝窦轻度扩张，胞浆内糖原丰富，内质网无明显异常，线粒体体积虽有增大，但无明显嵴肿胀，窦内皮细胞有轻度受损，偶见灶状肝细胞坏死。讨 论
PAF拮抗剂是一类能在动物模型中抑制PAF生物作用的的药物，并可作为研究PAF的病理生理机制[7]。WEB2086是其中的一种新型强效特异性拮抗剂[8]。
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PAF是一种与花生四稀酸代谢密切相关的磷脂，它主要由受损害的细胞膜所释放。多种细胞都可合成和释放PAF，如内皮细胞，中性粒细胞、单核-巨噬细胞、血小板等[9]。木冈清英等[10]发现，内毒素诱导小鼠暴发性肝功能衰竭时，肝脏Kupffer细胞产生PAF增多，内毒素可刺激腹腔巨噬细胞合成和释放PAF[11]。我们应用PAF拮抗剂可防止GalN/E诱导的肝脏损害，提示GalN/E引起肝脏损害时，肝脏可能合成和释放PAF增多。
PAF合成释放增多在肝脏损害中的作用机制尚不清楚。本实验结果提示可能与以下三方面作用有关：(1)活化粒细胞：GalN/E引起肝脏损伤时，肝脏粒细胞标记酶——MPO活性明显增高，WEB2086可显著减少MPO活性的增加，这间接地说明PAF可能与粒细胞活化有关。Valone等[12]报道，PAF可刺激并增加人体单核细胞的细胞毒性作用。WEB2086可特异性地抑制PAF所诱导的粒细胞活化[7，8]。(2)防止氧自由基产生：给予大鼠GalN/E 24小时后，肝脏脂质过氧化物显著升高，而氧自由基清除剂SOD则明显降低；应用WEB2086可有效地防止肝脏MDA的升高和SOD的降低，提示WEB2086对肝损害的保护作用可能与抑制自由基产生有关。近年来研究表明，氧自由基可导致细胞膜，酶及核酸等蛋白质的结构和活性改变。氧自由基主要来源于粒细胞活化和黄嘌呤氧化酶系统。PAF不仅具有活化粒细胞的作用，而且可通过诱导血小板聚积产生血栓、增加血管通透性而引起组织水肿，从而导致组织缺血，并激活黄嘌呤氧化酶系统产生氧自由基。(3)稳定溶酶体膜：ACP是肝细胞溶酶体的标记酶，本实验观察到，WEB2086可明显耻止在GalN/E诱导肝脏损害时ACP的漏出，说明WEB2086可能具有稳定溶酶体膜的作用。
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本实验应用PAF拮抗剂虽能有效地减轻由Galn/E引起的肝脏损害，但并不能完全防止。这表明在肝脏损害过程中，除PAF外，可能还有许多其它炎性介质参与，如白三烯、肿瘤坏死因子、血栓素等。PAF拮抗剂并不能清除GalN/E对肝脏的直接毒性作用，但能防止各种毒性物质通过PAF而介导肝脏损害的发生。
参考文献
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(1990年1月16日收稿 同年4月12日修回), 百拇医药