IL1对肾小球系膜细胞转化生长因子基因表达及细胞外基质合成的作用
作者：赵志辉 王海燕 高进 朱世乐
单位：100034北京医科大学第一医院肾病中心
关键词：
中华医学杂志930517 晚近的工作表明，在系膜增值性肾小球炎症及硬化过程中，IL1转化生长因子β(TGFβ)mRNA基因表达与IV型胶原、纤维连结蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)合成积聚密切相关〔1〕。为了进一步探讨白细胞介素1(IL1)与细胞外基质合成的关系，我们利用培养的肾小球系膜细胞(MSC)观察基因重组IL1β(rIL1β)对MSC表达转化生长因子β(TGFβ)及分泌合成蛋白多糖、胶原蛋白的调节作用。
一、材料和方法
1.rIL1β对MSC TGFβ基因表达的影响：按经典方法培养肾小球MSC，在转种MSC内加rIL1β 10U/ml为1组，不加rIL1β为2组，分别于0、3、6、12小时收集细胞。按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA〔2〕。紫外分光光度计测RNA的量及纯度，吸光值260nm与280nm之比约1.8～2.0。用碱变地提取纯化TGFβ质粒(中国医学科学院刘启光研究员赠送)，EcoRI限制性内切酶消化，低溶点胶回收DNA，其片段为2.0kb。光敏生物素标记与检测药盒标记TGFβ cDNA探针。按经典方法进行斑点杂交，用亲和素-碱性磷酸酶显色，计算机密度扫描。
, 百拇医药
2.rIL1β对MSC胶原含量的影响：1、2组分别于0、3、7、12天收集细胞计数。用羟脯氨酸法测定经胶原酶消化后上清液内的羟脯氨酸的量。羟脯氨酸占胶原含量的14%，胶原含量以羟脯氨酸含量乘以7.14用紫外分光光度计测量细胞总蛋白含量来校正胶原含量(胶原μg/细胞总蛋白mg)。
3.rIL1β对MSC摄取35S的影响：1、2组分别于1、3、5、7、12天收集细胞，在收集前24小时加入35S-NaSO4 3.7MBq/ml(100μCi/ml)，3H-TdR 37KBq/ml(1μCi/ml)，用Beckman Ls9800液体闪烁计数器测量35S的掺入量，用每分钟衰变率(DPM)表示。
二、结果
1.rIL1β对MSC TGFβ基因表达的影响：斑点杂交显示大鼠膜腔巨噬细胞(Mφ)经脂多糖刺激，有TGFβ mRNA基因表达。肾小球MSC加5%胎牛血清(FCS)未发现TGFβ基因表达，当加入5%FCS的同时加入rIL1β，在3、6、12小时均发现MSC TGFβ mRNA基因表达(表1)。
, 百拇医药
表1 rIL1β对MSC TGFβ基因表达的影响
细胞
1
2
3
4
(O.D)
MSC(A)
0
181
167
200
Mu(B)
, 百拇医药
0
312
255
188△
*计算机图象分析
2.rIL1β对MSC胶原含量的影响：当在培养的MSC内加入rIL1β 10U/ml后的第7天和第12天，MSC的胶原含量明显增加，而无rIL1β组的第7和12天MSC胶原含量无明显变化(表2)。
表2 rIL1β对系膜细胞胶原蛋白合成的影响
组别
胶原含量(μg/100mg)
1组
, 百拇医药
0(天)
4.2±0.7
3
4.0±1.2
7
6.8±0.7*
12
7.0±1.0*
2组
7(天)
4.2±0.8
12
, http://www.100md.com
4.6±0.5
*P<0.01 n=3
3.rIL1β对MSC摄取35S的作用：在培养的MSC内加入rIL1β后1、3、5、7、12天MSC对35S的DPM分别为700±109，798±118，877±182，1586±282，866±164(P<0.01)。第7天有明显增加。
三、讨论
研究证明，大多数组织细胞可产生TGFβ，几乎所有细胞上均有TGFβ受体。在正常肾小球有TGFβ基因表达〔3〕，Okuda等〔4〕报告了系膜增殖性肾炎的肾小球TGFβ mRNA表达明显增加，并且TGFβ可使培养的肾小球MSC分泌蛋白多糖增加8～10倍。本研究证实肾小球MSC不仅有TGFβ mRNA基因表达，而且还进一步证明IL1可促进MSCTGFβ mRNA基因表达。
, http://www.100md.com
Stotki等〔5〕报告只有含IL1的条件培养基可导致肾盂肾炎的瘢痕形成。Matsumoto等〔6〕研究认为在局灶节段肾小球硬化的早期，肾小球IL1活性明显增加，提示IL1在局灶节段性肾小球硬化中起着一定作用。在系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中IL1，TGFβ mRNA基因表达与肾小球病理改变及IV型胶原，FN，TLN合成积聚密切相关〔1〕。本研究同时证实细胞因子IL1可以刺激肾小球MSC合成蛋白多糖，并增加MSC的胶原含量，而在肾小球生化组成成份中主要是硫酸软骨素蛋白多糖和硫酸皮肤素蛋白多糖及IV型胶原。
综上所述，IL1可以促进肾小球MSC TGFβ mRNA基因表达，直接或间接地促进肾小球MSC细胞外基质的合成积聚，提示IL1是系膜增殖性肾小球炎症、硬化发病机理中一个重要的调节因子。
本课题为国家自然科学基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 赵志辉，王海燕，章友康等.系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中IL-1与TGFβmRNA基因表达.中华医学杂志，1992.72：195.
2 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guandinium thiocyanate-phenol-choroform extraction.Analytical Biochemistry,1987,162:156.
3 Mackay K,Kondaiah P,Danielpour D,et al.Expression of transforming growth factor β1 and β2 in rat glomeruli.Kidney Int,1990,38:1095.
, 百拇医药
4 Okuda S,Languino LR,Ruoslahti E,et al.Elevated of expression of transforming growth factor β and proteoglycan production in experimental glomerulonephritis,Possible role in expression of the mesangial extracellular matrix.J Clin Invest,1990,86:453.
5 Stotki IK.Production of kidney scars by endotoxin elicited macrophage in the rat.Xth International Congress of Nephrology.London.1987:361.
6 Matsumoto K,Atkins RC.Glomerular cells and macrophages in the progression of experimental focal and segmental glomerulosclerosis.Am J Pathol,1989,134:933.
(收稿：1992-09-18 修回：1993-02-16), 百拇医药
单位：100034北京医科大学第一医院肾病中心
关键词：
中华医学杂志930517 晚近的工作表明，在系膜增值性肾小球炎症及硬化过程中，IL1转化生长因子β(TGFβ)mRNA基因表达与IV型胶原、纤维连结蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)合成积聚密切相关〔1〕。为了进一步探讨白细胞介素1(IL1)与细胞外基质合成的关系，我们利用培养的肾小球系膜细胞(MSC)观察基因重组IL1β(rIL1β)对MSC表达转化生长因子β(TGFβ)及分泌合成蛋白多糖、胶原蛋白的调节作用。
一、材料和方法
1.rIL1β对MSC TGFβ基因表达的影响：按经典方法培养肾小球MSC，在转种MSC内加rIL1β 10U/ml为1组，不加rIL1β为2组，分别于0、3、6、12小时收集细胞。按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA〔2〕。紫外分光光度计测RNA的量及纯度，吸光值260nm与280nm之比约1.8～2.0。用碱变地提取纯化TGFβ质粒(中国医学科学院刘启光研究员赠送)，EcoRI限制性内切酶消化，低溶点胶回收DNA，其片段为2.0kb。光敏生物素标记与检测药盒标记TGFβ cDNA探针。按经典方法进行斑点杂交，用亲和素-碱性磷酸酶显色，计算机密度扫描。
, 百拇医药
2.rIL1β对MSC胶原含量的影响：1、2组分别于0、3、7、12天收集细胞计数。用羟脯氨酸法测定经胶原酶消化后上清液内的羟脯氨酸的量。羟脯氨酸占胶原含量的14%，胶原含量以羟脯氨酸含量乘以7.14用紫外分光光度计测量细胞总蛋白含量来校正胶原含量(胶原μg/细胞总蛋白mg)。
3.rIL1β对MSC摄取35S的影响：1、2组分别于1、3、5、7、12天收集细胞，在收集前24小时加入35S-NaSO4 3.7MBq/ml(100μCi/ml)，3H-TdR 37KBq/ml(1μCi/ml)，用Beckman Ls9800液体闪烁计数器测量35S的掺入量，用每分钟衰变率(DPM)表示。
二、结果
1.rIL1β对MSC TGFβ基因表达的影响：斑点杂交显示大鼠膜腔巨噬细胞(Mφ)经脂多糖刺激，有TGFβ mRNA基因表达。肾小球MSC加5%胎牛血清(FCS)未发现TGFβ基因表达，当加入5%FCS的同时加入rIL1β，在3、6、12小时均发现MSC TGFβ mRNA基因表达(表1)。
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表1 rIL1β对MSC TGFβ基因表达的影响
细胞
1
2
3
4
(O.D)
MSC(A)
0
181
167
200
Mu(B)
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0
312
255
188△
*计算机图象分析
2.rIL1β对MSC胶原含量的影响：当在培养的MSC内加入rIL1β 10U/ml后的第7天和第12天，MSC的胶原含量明显增加，而无rIL1β组的第7和12天MSC胶原含量无明显变化(表2)。
表2 rIL1β对系膜细胞胶原蛋白合成的影响
组别
胶原含量(μg/100mg)
1组
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0(天)
4.2±0.7
3
4.0±1.2
7
6.8±0.7*
12
7.0±1.0*
2组
7(天)
4.2±0.8
12
, http://www.100md.com
4.6±0.5
*P<0.01 n=3
3.rIL1β对MSC摄取35S的作用：在培养的MSC内加入rIL1β后1、3、5、7、12天MSC对35S的DPM分别为700±109，798±118，877±182，1586±282，866±164(P<0.01)。第7天有明显增加。
三、讨论
研究证明，大多数组织细胞可产生TGFβ，几乎所有细胞上均有TGFβ受体。在正常肾小球有TGFβ基因表达〔3〕，Okuda等〔4〕报告了系膜增殖性肾炎的肾小球TGFβ mRNA表达明显增加，并且TGFβ可使培养的肾小球MSC分泌蛋白多糖增加8～10倍。本研究证实肾小球MSC不仅有TGFβ mRNA基因表达，而且还进一步证明IL1可促进MSCTGFβ mRNA基因表达。
, http://www.100md.com
Stotki等〔5〕报告只有含IL1的条件培养基可导致肾盂肾炎的瘢痕形成。Matsumoto等〔6〕研究认为在局灶节段肾小球硬化的早期，肾小球IL1活性明显增加，提示IL1在局灶节段性肾小球硬化中起着一定作用。在系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中IL1，TGFβ mRNA基因表达与肾小球病理改变及IV型胶原，FN，TLN合成积聚密切相关〔1〕。本研究同时证实细胞因子IL1可以刺激肾小球MSC合成蛋白多糖，并增加MSC的胶原含量，而在肾小球生化组成成份中主要是硫酸软骨素蛋白多糖和硫酸皮肤素蛋白多糖及IV型胶原。
综上所述，IL1可以促进肾小球MSC TGFβ mRNA基因表达，直接或间接地促进肾小球MSC细胞外基质的合成积聚，提示IL1是系膜增殖性肾小球炎症、硬化发病机理中一个重要的调节因子。
本课题为国家自然科学基金资助项目
, 百拇医药
参考文献
1 赵志辉，王海燕，章友康等.系膜增殖性肾小球炎症、硬化过程中IL-1与TGFβmRNA基因表达.中华医学杂志，1992.72：195.
2 Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guandinium thiocyanate-phenol-choroform extraction.Analytical Biochemistry,1987,162:156.
3 Mackay K,Kondaiah P,Danielpour D,et al.Expression of transforming growth factor β1 and β2 in rat glomeruli.Kidney Int,1990,38:1095.
, 百拇医药
4 Okuda S,Languino LR,Ruoslahti E,et al.Elevated of expression of transforming growth factor β and proteoglycan production in experimental glomerulonephritis,Possible role in expression of the mesangial extracellular matrix.J Clin Invest,1990,86:453.
5 Stotki IK.Production of kidney scars by endotoxin elicited macrophage in the rat.Xth International Congress of Nephrology.London.1987:361.
6 Matsumoto K,Atkins RC.Glomerular cells and macrophages in the progression of experimental focal and segmental glomerulosclerosis.Am J Pathol,1989,134:933.
(收稿：1992-09-18 修回：1993-02-16), 百拇医药