鼻咽癌恶性转化基因的染色体定位研究
作者：贺 红 曹 亚 姚开泰
单位：410078 湖南医科大学肿瘤研究所
关键词：核酸杂交；基因探针；鼻咽肿瘤
中华医学杂志930606 摘要 利用JB6小鼠(P+)上皮系统和分子克隆技术已成功地从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆分离出恶性转化基因(Tx基因)，作者采用生物素——11-dUTP标记的Tx基因片断作探针进行染色体原位杂交，用连接有荧光素的新和素检测杂交信号，并分析杂交信号在R显带染色体上的位置，发现8号染色体上的杂交信号占杂交信号总数的57%(89/156)，而8q23及8q24.1两条带纹上的杂交信号占8号染色体上杂交信号数的51.8%(46/89)。所以我们将Tx基因定位于人染色体8q23→8q24.1。
利用JB6小鼠(P+)上皮系统和分子克隆技术，已成功地从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆分离出恶性转化基因Tx〔1〕。该基因可使正常细胞转化为癌细胞，接种于裸鼠有致瘤性。这一基因与一些常见的瘤基因及生长受体基因无同源性。在CNE3细胞中有转录产物。为了进一步了解Tx基因的物理性状和功能，我们研究了Tx基因的染色体定位。
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材料及方法
一、主要试剂
缺口转译试剂盒及生物素-11-脱氧尿嘧啶三磷酸核苷(生物素-11-dUTP)等试剂均为美国BRL公司产品。限制性内酶(Hind III)及其荧光素标记的亲和素(Avidin-FITC)从华美公司购进。甲酰胺为德国Merck公司产品，硫酸葡聚糖为瑞典Pharmacia公司产品。碘化丙啶为美国Sigma公司产品。
二、探针制备及标记
Tx基因全长16kb，将不含人ALu重复序列的2.8kb片段亚克隆至pSP70质粒中，构建全长为5.2kb的Tx pSP70重组质粒。按碱变性法常规制备该质粒DNA，HindIII酶消化质粒，使其线性化。
用生物素-11-dUTP经缺口转译法标记线性化的Tx pSP70重组质粒，分离纯化后，作为染色体原位杂交的探针。
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三、染色体标本制备
取健康献血员外周血，按常规培养，收获前6小时加入5-1溴脱氧尿嘧啶核苷(终浓度30μg/ml)，收获前2小时加秋水仙碱，常规收获制片，固定3次，滴片，玻片置荧光染料Hoechst-33258(1～3μg/ml)中染色，60℃水浴用紫外灯照射15分钟左右，将R显带预处理完毕的玻片置-20℃保存。
四、染色体原位杂交
参照文献〔2～5〕方法适当修改而成。(1)染色体标本预处理。PBS缓冲液清洗玻片，系列乙醇(60%、70%、80%、90及无水乙醇)脱水。RNA酶(RNase，100μg/ml)处理，37℃，1小时。2×柠檬酸钠缓冲液(SSC)清洗3次，系统列乙醇脱水。蛋白酶K(0.3μg/ml)室温下处理5～7分钟，2×SSC清洗1次，系列乙醇脱水。(2)制备竞争性杂交用DNA探针处理。用BRANSON-15P超声细胞粉碎器将人白细胞基因组DNA粉碎至300～500bp大小，取适量粉碎的人白细胞DNA与生物素标记的探针共同沉淀、干燥并溶解于杂交缓冲液中(50%甲酰胺；10%硫酸葡聚糖；2×SSC；100μg/ml ssDNA；0.05mM Tris-Cl；0.1mM EDTA)，探针终浓度约为1～5ng/μl。将探针置75℃水浴中变性5分钟，冰浴片刻，放入37℃培养箱30分钟。(3)染色体标本的预杂交及杂交。将染色体玻片标本在70%甲酰胺/2×SSC/50mmol磷酸盐缓冲液条件下，75℃变性5分钟～7分钟，立即转入冰凉的70%酒精中，90%、100%乙醇脱水，干燥片刻，加上探针液20μl，盖片，37℃杂交16小时以上。(4)洗脱。50%甲酰胺/2×SSC 42℃处理玻片3次，每次5分钟。2×SSC处理一次约10分钟，0.1×SSC处理3次，每次5分钟。(5)免疫荧光检测。将清洗后的玻片标本在4×SSC，0.05% Tween-20，2%BSA溶液中封闭15～20分钟。Avidin-FITC处理标本30分钟(Avidin-FITC 5μg/ml；4×SSC；0.05% Tween-20；1% BSA)。4×SSC，0.05% Tween-20清洗3次，每次5分钟。系列乙醇脱水，气干。碘化丙淀染色(5μg/ml)，盖玻片覆盖，置Nikon落射式荧光显微镜下观察并照相。
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结 果
低倍镜检查百余个核型，分析杂交信号位于染色单体上或贴在一条染色单体旁的分裂相67个，共检得杂交信号156个，其中位于8号染色体上的杂交信号呈散在分布，无富集现象。8号染色体上信号分布情况为：8q24.1，32.5%(29/89)；8q23，19.1%(17/89)；8q22，9%(8/89)；8q11，10%(9/89)，见图1～4。由此可以看出，8q23，8q24.1两条带纹上的杂交信号数占8号染色体上杂交信号数目的51.8%(46/89)，占杂交信号总数的29.5%(46/156)。有信号的核型中，49.2%(33/67)可检测出8q23或8q24.1位置上的杂交信号。而另一区域8p11→8q11虽信号稍多，但仅占8号染色体上杂交信号数的19.1%(17/89)，占杂交信号总数有10.9%。按照Garson〔6〕的方法，分析信噪比(Signal to noise ratio)即某条带上杂交信号数与该带的信号本底期待值之比，8q24.1为60∶1；8q23为35∶1，此种定位在人染色体8q23→8q24.1的位置。
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图1,2 原位杂交以后的R显带染色体,箭头所指为8q24.1位置上显示的生物
素标记Tx基因的杂交信号
图3，4 染色体原位杂交信号在染色体组的分布图，可见杂交信号
集中在8号染色体上，以8q23→8q24.1位置信号最为集中
讨 论
我们应用荧光标记的染色体原位杂交技术对鼻咽癌恶性转化基因Tx进行了定位研究。荧光镜下染色体及其R带纹呈红色，杂交信号为清晰的黄绿色，并有较明显的特殊分布，故FISH法用于基因定位有明显的优点。目前该技术在国外已成为细胞遗传学与分子生物学方法结合的重要研究手段，而国内应用该技术的报道还极少。
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染色体原位杂交的显带问题，一直是使人困扰的难题之一，国外许多应用FISH法的文献亦未能很好地解决此问题，我们采用Takahashi报道的方法加以改良，在杂交前预先对染色体进行R显带处理，杂交后再完成荧光染色，成功地同时显示了信号和清晰的带纹。
本实验用2.8kb不含人Alu重复序列的Tx基因片断作探针，进行染色体原位杂交，起初得到的杂交信号背景较高，可能该探针片段内含有Alu以外的其它重复序列，采用竞争性杂交技术以后，明显地降低了非特异性杂交信号。
对克隆的瘤基因进行物理性状的分析是了解其活化方式的重要前提。已知Tx基因定位的位置附近，即8q21→qter区域含有近10个致病基因或瘤基因，尤其是myc基因已被精确定位在8q24.12→8q14.13，myc基因的激活因子，瘤基因PVT1亦被定位在8q24〔3〕，myc基因与Burkitt's淋巴瘤发病有关，而且在鼻咽癌中有表达，深入研究与鼻咽癌发病有关的Tx基因与这些瘤基因的关系，以及它们在鼻咽癌发病中的作用将是非常有意义的。8q24.1既是普通型脆性位点，亦是远霉素A依赖的罕见型脆性位点，还是人乳头状瘤病毒18型的染色体整合位点，有关瘤基因、脆性部位、病毒DNA整合部位之间的关系也是一个耐人寻味的问题。
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注：本课题为国家自然科学基金及美国中华医学基金会(CMB)资助项目。
参考文献
1 Cao Ya,Sun Y,Poirier S,et al.Isolation and partial characterization of a transformation associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma.Molecular carcinogenesis,1991,4:297.
2 Pequigno St EV,Dutrillaux B,Magdelenat H,et al.Mapping of single-copy DNA sequences on human chromosomes byin situ hybridization with biotinylated probes:enhancement of edtection sensitivity by intensified-fluouescence digital-imaging microscopy.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:582.
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3 Takahashi E,Hori T,Connell O,et al.Mapping of the MYC gene to band 8q24.12→q24.13 by R-banding and distal to fra (8)(q24.11),FRA8E,by fluorescence in situ hybridization.CYtogenet Cell Genet,1991,57:109.
4 Kievits T,Dauwerse JG,Wiegant J,et al.Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization.Cytogenet Cell Genet,1990,53:134.
5 Nisson PE,Watkins PC,Menninger JC,Ward DC.Improved suppression hybridization with human DNA (Cot-1 DNA) enriched for repetitive DNA sequences.Focus,1991,13:2.
6 Garson JA,Bergne JA,Kemshead JT.Noverl non-isotopic in situhybridization technique detects small (1kb) uniquesequences in routinelyG-banded human chromosomes:fine mapping of N-myc and β-NGF genes.Nucleic Acids Research,1987,15:4761.
(收稿：1992-07-23 修回：1993-02-19), http://www.100md.com
单位：410078 湖南医科大学肿瘤研究所
关键词：核酸杂交；基因探针；鼻咽肿瘤
中华医学杂志930606 摘要 利用JB6小鼠(P+)上皮系统和分子克隆技术已成功地从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆分离出恶性转化基因(Tx基因)，作者采用生物素——11-dUTP标记的Tx基因片断作探针进行染色体原位杂交，用连接有荧光素的新和素检测杂交信号，并分析杂交信号在R显带染色体上的位置，发现8号染色体上的杂交信号占杂交信号总数的57%(89/156)，而8q23及8q24.1两条带纹上的杂交信号占8号染色体上杂交信号数的51.8%(46/89)。所以我们将Tx基因定位于人染色体8q23→8q24.1。
利用JB6小鼠(P+)上皮系统和分子克隆技术，已成功地从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆分离出恶性转化基因Tx〔1〕。该基因可使正常细胞转化为癌细胞，接种于裸鼠有致瘤性。这一基因与一些常见的瘤基因及生长受体基因无同源性。在CNE3细胞中有转录产物。为了进一步了解Tx基因的物理性状和功能，我们研究了Tx基因的染色体定位。
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材料及方法
一、主要试剂
缺口转译试剂盒及生物素-11-脱氧尿嘧啶三磷酸核苷(生物素-11-dUTP)等试剂均为美国BRL公司产品。限制性内酶(Hind III)及其荧光素标记的亲和素(Avidin-FITC)从华美公司购进。甲酰胺为德国Merck公司产品，硫酸葡聚糖为瑞典Pharmacia公司产品。碘化丙啶为美国Sigma公司产品。
二、探针制备及标记
Tx基因全长16kb，将不含人ALu重复序列的2.8kb片段亚克隆至pSP70质粒中，构建全长为5.2kb的Tx pSP70重组质粒。按碱变性法常规制备该质粒DNA，HindIII酶消化质粒，使其线性化。
用生物素-11-dUTP经缺口转译法标记线性化的Tx pSP70重组质粒，分离纯化后，作为染色体原位杂交的探针。
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三、染色体标本制备
取健康献血员外周血，按常规培养，收获前6小时加入5-1溴脱氧尿嘧啶核苷(终浓度30μg/ml)，收获前2小时加秋水仙碱，常规收获制片，固定3次，滴片，玻片置荧光染料Hoechst-33258(1～3μg/ml)中染色，60℃水浴用紫外灯照射15分钟左右，将R显带预处理完毕的玻片置-20℃保存。
四、染色体原位杂交
参照文献〔2～5〕方法适当修改而成。(1)染色体标本预处理。PBS缓冲液清洗玻片，系列乙醇(60%、70%、80%、90及无水乙醇)脱水。RNA酶(RNase，100μg/ml)处理，37℃，1小时。2×柠檬酸钠缓冲液(SSC)清洗3次，系统列乙醇脱水。蛋白酶K(0.3μg/ml)室温下处理5～7分钟，2×SSC清洗1次，系列乙醇脱水。(2)制备竞争性杂交用DNA探针处理。用BRANSON-15P超声细胞粉碎器将人白细胞基因组DNA粉碎至300～500bp大小，取适量粉碎的人白细胞DNA与生物素标记的探针共同沉淀、干燥并溶解于杂交缓冲液中(50%甲酰胺；10%硫酸葡聚糖；2×SSC；100μg/ml ssDNA；0.05mM Tris-Cl；0.1mM EDTA)，探针终浓度约为1～5ng/μl。将探针置75℃水浴中变性5分钟，冰浴片刻，放入37℃培养箱30分钟。(3)染色体标本的预杂交及杂交。将染色体玻片标本在70%甲酰胺/2×SSC/50mmol磷酸盐缓冲液条件下，75℃变性5分钟～7分钟，立即转入冰凉的70%酒精中，90%、100%乙醇脱水，干燥片刻，加上探针液20μl，盖片，37℃杂交16小时以上。(4)洗脱。50%甲酰胺/2×SSC 42℃处理玻片3次，每次5分钟。2×SSC处理一次约10分钟，0.1×SSC处理3次，每次5分钟。(5)免疫荧光检测。将清洗后的玻片标本在4×SSC，0.05% Tween-20，2%BSA溶液中封闭15～20分钟。Avidin-FITC处理标本30分钟(Avidin-FITC 5μg/ml；4×SSC；0.05% Tween-20；1% BSA)。4×SSC，0.05% Tween-20清洗3次，每次5分钟。系列乙醇脱水，气干。碘化丙淀染色(5μg/ml)，盖玻片覆盖，置Nikon落射式荧光显微镜下观察并照相。
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结 果
低倍镜检查百余个核型，分析杂交信号位于染色单体上或贴在一条染色单体旁的分裂相67个，共检得杂交信号156个，其中位于8号染色体上的杂交信号呈散在分布，无富集现象。8号染色体上信号分布情况为：8q24.1，32.5%(29/89)；8q23，19.1%(17/89)；8q22，9%(8/89)；8q11，10%(9/89)，见图1～4。由此可以看出，8q23，8q24.1两条带纹上的杂交信号数占8号染色体上杂交信号数目的51.8%(46/89)，占杂交信号总数的29.5%(46/156)。有信号的核型中，49.2%(33/67)可检测出8q23或8q24.1位置上的杂交信号。而另一区域8p11→8q11虽信号稍多，但仅占8号染色体上杂交信号数的19.1%(17/89)，占杂交信号总数有10.9%。按照Garson〔6〕的方法，分析信噪比(Signal to noise ratio)即某条带上杂交信号数与该带的信号本底期待值之比，8q24.1为60∶1；8q23为35∶1，此种定位在人染色体8q23→8q24.1的位置。
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图1,2 原位杂交以后的R显带染色体,箭头所指为8q24.1位置上显示的生物
素标记Tx基因的杂交信号
图3，4 染色体原位杂交信号在染色体组的分布图，可见杂交信号
集中在8号染色体上，以8q23→8q24.1位置信号最为集中
讨 论
我们应用荧光标记的染色体原位杂交技术对鼻咽癌恶性转化基因Tx进行了定位研究。荧光镜下染色体及其R带纹呈红色，杂交信号为清晰的黄绿色，并有较明显的特殊分布，故FISH法用于基因定位有明显的优点。目前该技术在国外已成为细胞遗传学与分子生物学方法结合的重要研究手段，而国内应用该技术的报道还极少。
, 百拇医药
染色体原位杂交的显带问题，一直是使人困扰的难题之一，国外许多应用FISH法的文献亦未能很好地解决此问题，我们采用Takahashi报道的方法加以改良，在杂交前预先对染色体进行R显带处理，杂交后再完成荧光染色，成功地同时显示了信号和清晰的带纹。
本实验用2.8kb不含人Alu重复序列的Tx基因片断作探针，进行染色体原位杂交，起初得到的杂交信号背景较高，可能该探针片段内含有Alu以外的其它重复序列，采用竞争性杂交技术以后，明显地降低了非特异性杂交信号。
对克隆的瘤基因进行物理性状的分析是了解其活化方式的重要前提。已知Tx基因定位的位置附近，即8q21→qter区域含有近10个致病基因或瘤基因，尤其是myc基因已被精确定位在8q24.12→8q14.13，myc基因的激活因子，瘤基因PVT1亦被定位在8q24〔3〕，myc基因与Burkitt's淋巴瘤发病有关，而且在鼻咽癌中有表达，深入研究与鼻咽癌发病有关的Tx基因与这些瘤基因的关系，以及它们在鼻咽癌发病中的作用将是非常有意义的。8q24.1既是普通型脆性位点，亦是远霉素A依赖的罕见型脆性位点，还是人乳头状瘤病毒18型的染色体整合位点，有关瘤基因、脆性部位、病毒DNA整合部位之间的关系也是一个耐人寻味的问题。
, http://www.100md.com
注：本课题为国家自然科学基金及美国中华医学基金会(CMB)资助项目。
参考文献
1 Cao Ya,Sun Y,Poirier S,et al.Isolation and partial characterization of a transformation associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma.Molecular carcinogenesis,1991,4:297.
2 Pequigno St EV,Dutrillaux B,Magdelenat H,et al.Mapping of single-copy DNA sequences on human chromosomes byin situ hybridization with biotinylated probes:enhancement of edtection sensitivity by intensified-fluouescence digital-imaging microscopy.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:582.
, http://www.100md.com
3 Takahashi E,Hori T,Connell O,et al.Mapping of the MYC gene to band 8q24.12→q24.13 by R-banding and distal to fra (8)(q24.11),FRA8E,by fluorescence in situ hybridization.CYtogenet Cell Genet,1991,57:109.
4 Kievits T,Dauwerse JG,Wiegant J,et al.Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization.Cytogenet Cell Genet,1990,53:134.
5 Nisson PE,Watkins PC,Menninger JC,Ward DC.Improved suppression hybridization with human DNA (Cot-1 DNA) enriched for repetitive DNA sequences.Focus,1991,13:2.
6 Garson JA,Bergne JA,Kemshead JT.Noverl non-isotopic in situhybridization technique detects small (1kb) uniquesequences in routinelyG-banded human chromosomes:fine mapping of N-myc and β-NGF genes.Nucleic Acids Research,1987,15:4761.
(收稿：1992-07-23 修回：1993-02-19), http://www.100md.com