1，25双羟维生素D3对成骨样细胞骨架和基因表达的影响*
作者：薛 延 袁润英 相 东 王红霞李希斌** 刘正梅** 吴克斌*** 范慕贞***
单位：北京积水潭医院生化研究室，免疫研究室，北京 100035；**北京市神经外科研究所细胞生物学研究室；***中日友好医院临床医学研究所生化研究室
关键词：1；25双羟基维生素D3；成骨样细胞；细胞骨架；纤粘蛋白；基因表达
解剖学报980114
摘 要 用荧光免疫法研究了1，25双羟基维生素D3对大鼠成骨样细胞(ROS17/2.8)
细胞骨架的影响和用斑点杂交技术研究了1，25(OH)2D3对人成骨样细胞(OS-732)基因
, 百拇医药
表达的影响。结果表明：在10-7mol/L 1,25(OH)2D3连续作用4d后，大鼠ROS17/2.8细胞
的微管蛋白和波形纤维蛋白明显改善，纤粘蛋白荧光明显增强。而在1，25(OH)2D3作
用前后OS-732细胞c-myc和met D基因均处于高度活跃表达状态。本文还讨论了细胞分
化与细胞骨架及基因表达的关系。
1α,25双羟基维生素D3[简称D3或1,25(OH)2D3]是一种钙调节激素，对血钙具有双
向调节作用。有关1，25(OH)2D3对人或大鼠成骨样细胞增殖和诱导分化作用国内外已
, 百拇医药
有报道[1～3]。为了进一步探讨1，25(OH)2D3对成骨样细胞诱导分化及其调控机理。本
实验着重研究了1，25(OH)2D3对大鼠成骨样细胞(ROS17/2.8)细胞骨架，细胞表面纤粘
蛋白(FN)改变和对人成骨样细胞(OS-732)c-myc和met D基因表达的影响。
材料和方法
1.细胞培养
将免疫室建立的人成骨样细胞系OS-732和大鼠ROS17/2.8细胞系(北京医科大学杜
, 百拇医药 国光教授赠)，置于含10%～20%小牛血清(哈尔滨)的RPMI1640(Gibco)培养基，37℃，5% CO2 的培养箱内，每3d换液1次。将1，25(OH)2D3(FHoffmamnLa-Roche)用无水乙
醇配成10-8和10-7mol/L浓度，加入上述细胞。对照组加等量乙醇。
2. 细胞骨架免疫荧光染色
2.1 微丝免疫荧光染色：细胞盖片经PBS漂洗后，用4%多聚甲醛固定20min后用冷
丙酮固定7min。漂染后，加1∶50稀释的鬼笔环肽(TRITC-Phalloidin)，Sigma公司)结合
F-actin。暗处放置、漂洗、封片。
, 百拇医药
2.2 微管免疫荧光染色：细胞盖片用冷甲醇固定20min，PBS漂洗，加1∶50稀释的
抗海胆微管蛋白抗体(Polyscience公司)1～2h，再加FITC羊抗兔IgG(北京生物制品研究
所)，漂洗、封片。
2.3 波形纤维蛋白荧光染色：抗波形纤维蛋白单克隆抗体(北京市神经外科研究所
细胞生物学室)，细胞盖片用冷甲醇固定20min，PBS漂洗，加抗波形纤维蛋白单克隆
抗体孵育2h，再加羊抗鼠IgG(北京生物制品研究所)。漂洗、封片。2.4 纤粘蛋白(FN)
免疫荧光染色：细胞盖片固定步骤同微丝，然后用PBS漂洗，加抗FN抗体(北京医科
, 百拇医药
大学)，在室温放置1h。漂洗，加FITC-羊抗兔IgG抗体，室温放置、漂洗、封片。荧
光染色后用NikonDiaphot荧光显微镜观察。采用自动曝光系统摄片。
3. 基因表达技术
3.1 细胞RNA的提取：按White等[4]方法加以改进，在给药后2～3d，收集4×107/ml
不同组别细胞，用超声波处理20s，用10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA缓冲液及5%的
NP-40溶解，离心取上清，加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取，取水相，再加等体积氯仿提取，取水相，用1mmol/L NaAC和95%的乙醇沉淀RNA，用紫外分光
, 百拇医药
光度法进行RNA的纯度鉴定和定量分析。
3.2 基因探针的制备[5]c-myc和Met D基因探针分别为8.5kb, ECORI/Hind Ⅲ片段和
11kb ECORI/HindⅢ片段的PBR322质粒。经碱裂解法抽提DNA后进行DNA纯度鉴定和
定量分析。
3.3 缺口翻译标记探针：采用BRL公司的Nick Translation Kit进行α-32P-dCTP标记。
反应总体积为50μl，其中非标记的dATP、dGTP、dTTP各0.2mmol/L, α-32P-dCTP为
50μCi，放射活性为6 000Ci/mmol。
, 百拇医药
3.4 斑点杂交：取20～40μgRNA用15×SSC对倍系列稀释，用点样板(Bio-Rad,USA)将样品点在硝酸纤维膜上，杂交步骤按White法[4]进行。杂交后薄膜在室温晾干，用X光胶片加增减屏在-80℃曝光。3d显影。
结 果
1. 微管(MT)免疫荧光染色
OS-732，ROS17/2.8细胞外形较小且均一。荧光主要集中在核周围，微管以核为中
心形成网状分布，细胞边缘荧光弥散(图1)。经10-8mol/L1,25(OH)2D3处理后第4d，ROS17/2.8细胞微管加长，延伸至整个细胞荧光亦有所增强(图2)。
2.微丝(MF)免疫荧光染色
, 百拇医药
ROS17/2.8细胞微丝束清晰，较粗，沿细胞纵轴方向排列并分布于整个细胞(图3)。
用10-8mol/L1,25(OH)2D3处理后4d ROS17/2.8细胞微丝减少，变细，荧光弥散(图4)。
3.波形纤维蛋白免疫荧光染色
ROS17/2.8细胞波形纤维丝围绕核形成网状分布(图5)。用10-8mol/L 1,25(OH)2D3处
理后，波形纤维丝加长、清晰、荧光亦有增强(图6)。
4.纤粘蛋白(FN)免疫荧光
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ROS17/2.8细胞表面的FN细丝互相连接成网络，荧光弥散(图7)。用10-7mol/L1,25(OH)2D3处理后第4d，可看到细胞表面的FN细丝增多，荧光增强(图8)。
5.c-myc和met D基因在OS-732细胞中的表达
斑点杂交显示，细胞总RNA含量低于0.08μg时，仍能检测到c-myc的斑点，表明
OS-732细胞c-myc基因呈现高度活跃表达状态，c-myc基因杂交自显影黑度与所加总
RNA量呈正相关。在用10-8和10-7D3处理后第3d，细胞c-myc基因含量未见明显改变(图
, http://www.100md.com
9)。在总RNA含量为5.4μg以上时，能清晰地检测出met D基因表达斑点，表明met D基
因呈现活跃表达状态。在用10-7mol/LD3处理后第2d，检测metD基因含量未见明显改变
(图10)。
图9 OS-732细胞在1，25(OH)2D3诱导分化前后c-myc基因表达斑点杂交分析.A对照组；
B 10-7mol/L1,25(OH)2D3处理后；C 108mol/L 1,25(OH)2D3处理后
, 百拇医药
图10 OS-732细胞在1，25(OH)2D3诱导分化前后met D基因表达的斑点杂交分析.A对照
组；B 10-7mol/L1,25(OH)2D3处理后
Fig.9 Dot blotanalysis of c-myc gene expression in OS-732 cells before andafter 1,25(OH)2
D3 treatment A; control OS-732cells B:OS-732 cells treated by 10-7mol/L 1,25(OH)2D3
, http://www.100md.com C:OS-732 cells treated by 10-8mol/L1,25(OH)2D3.
Fig.10 Dot blot analysis of met D gene expression in OS-732 cellsbefore and after 1,25(OH)2 D3 treatment A:Control OS-732cells.B;OS-732 cells treated by 10-7 mol/L 1,25(OH)2D3.
讨 论
细胞形态的维持主要由细胞骨架所决定，而细胞骨架由微丝、微管和波形纤维蛋
白组成，三者高度协调分布，与胞核，质膜，细胞器相连，构成了细胞形态骨架和运
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动协调系统。此外，细胞外基质及其受体对于维持细胞形态也十分重要。如通过整合
素(integrin)与细胞表面FN相连，形成内外相连的复杂系统，传递信息，共同调节细胞
的生长与分化[5～7]。ROS17/2.8细胞微丝较发达，粗、清晰、布满整个细胞，而微管和
波形纤维蛋白集中在核周围，细胞表面的FN荧光较弱。用1，25(OH)2D3处理后，ROS
17/2.8微管和波形纤维蛋白伸展，加长，细胞表面FN免疫，荧光增强，说明1，25(OH)2D3使ROS17/2.8细胞的微管和波形纤维蛋白的组装改善[7]，细胞表面粘着力增强[8]，表
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明1，25(OH)2D3对ROS17/2.8细胞分化有明显作用。使ROS17/2.8细胞具有成骨细胞的
表型特征。用1，25(OH)2D3处理后17/2.8细胞微丝应力纤维减少并解聚。应力显微的数
量与细胞贴壁及运动状态有关，静止时明显，运动时解聚。这一结果与D3处理时细胞
的状态及对细胞状态的影响有关。OS-732细胞中的c-myc和met D)基因都处于活跃表达
状态。c-myc基因一般来说是与增殖、分化有关的基因，它作用于核内DNA结合蛋白。
而met D(或MNNG-HOS转化基因)是具有一种用于分子克隆得到的新的转化基因，来自
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化学致癌的人成骨样细胞系[9]。定位于7号染色体(7P11.4～7qter)。尽管1，25(OH)2D3抑制OS-732细胞增殖和诱导分化的作用已得到证实[1,2]，但本实验观察到1，25(OH)2D3
对OS-732细胞骨架和c-myc及met D基因表达无明显作用，这是否表明这两种基因与OS-
732细胞增殖与分化无关，还是与其他基因有关以及与基因表达细胞类型及细胞发育分
化不同阶段有关，都有待于进一步探讨。
收稿1997-01 修回 1997-06
本文图1～8见插图第12页
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.3860069)
图 版 说 明
图1对照组大鼠ROS17/2.8细胞微管蛋白免疫荧光在核周围呈网状分布，细胞边缘荧光
弥散 ×1 000
图2 用10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理后第4dROS17/2.8细胞微管束加长，荧光增强×1 000
图3 对照组ROS17/2.8细胞微丝束荧光清晰，较粗，扩展至整个细胞×1 000
图4 10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理ROS17/2.8细胞后第4d，微丝荧光明显减少 ×1 000
, http://www.100md.com
图5 对照组ROS17/2.8细胞波形纤维蛋白免疫荧光显示网状分布×1 000
图6 经10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理后，ROS17/2.8细胞波形纤维丝扩展、加长、荧光明显
增强 ×1 000
图7 对照组ROS17/2.8细胞表面FN免疫荧光呈弱阳性反应×800
图8 经10-7mol/L 1,25(OH)2D3处理后，ROS17/2.8细胞表面FN荧光增强 ×800
Explanationof figures
Fig.1 Theimmunofluorescence of microtubule network in the perinulearregion in ROS17/2.8
, 百拇医药
cells. ×1 000
Fig.2 The immumofluorescence of microtubules enhanced andspreaded in ROS17/2.8 cells
on day 4 after 10-8mol/L1,25(OH)2D3 treatment. ×1 000
Fig.3 The immunofluorescence of microfilament bundles was clear,thick and spreaded all
over the cell in ROS17/2.8 cells. ×1 000
Fig.4 The immunofluorescence of microfilament bundles inROS17/2.8 cell decreased on day
, http://www.100md.com
4 after 10-8mol/L 1,25(OH)2D3treatment. ×800
Fig.5 The immunofluorescence of vimentin in ROS 17/2.8 cells. ×1 000
Fig.6 The immunofluorescence of vimentin in ROS 17/2.8 cellssignficantly increased and
spreaded after 10-8mol/L1,25(OH)2D3 treatment. ×1 000
Fig.7 The immunofluorescence of fibronectins in the surface ofROS 17/2.8 cells exhibited
, 百拇医药
slightly positive reaction. ×800
Fig.8 The immunofluorescence of fibronectins in the surface ofROS 17/2.8 cells increased
after 10-8mol/L1,25(OH)2D3treatment. ×800
参 考 文 献
[1] 薛 延，王红霞，袁润英等.1α25双羟维生素D3对成骨细胞增殖与分化的影响.中国骨
质疏松杂志，1996；2(1)：28
, http://www.100md.com
[2] Scheven B A A, Van Der Veen MJ, Damen CA, et al. Effect ofmethotrexate on human
osteoblasts medulation by 1,25dihydroxyvitamin D3. J Bone Miner Res, 1995; 10(6):874
[3] Wergedal JE, Matsuyama T, Strong DD. Differentiation ofnormal human bone cells by
transforming growth factor-beta and1,25(OH)2 vitamin D3. Metabolism, 1992;41(1):42
, 百拇医药
[4] White BA, Bancroft FC. Cytoplasmic dot hybridization. Simpleanalysis of relative mRNA
levels in multiple small cell or tissuesamples. J Biol Chem, 1982; 257(15):8569
[5] 萨姆布鲁克 J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1992：16～34； 49～56
[6] 李希斌，刘正梅，邵文剑.人脑胶质瘤细胞系BT325细胞的免疫荧光研究.解剖学报，1990；21(3)：269
[7] Luegmayr E, Varga F, Frank T, et al. Effects oftriiodothyronine on morphology, growth
, 百拇医药
behavior and the actin cytoslkeleton inmouse osteoblastic cells (MC3T3-E1). Bone,1996;18(6):591
[8] 吕桂芝，林仲翔，周立新等.外源性三磷酸腺苷对人胃癌细胞(MGC-803)增殖和细胞
骨架的影响.解剖学报，1990；21(3)：274
[9] Cooper CS, Park M, Blair DG, et al. Molecular Coloning of anew transforming gene from a
chemically transformed human cell line.Nature, 1984; 311(5981):29
, 百拇医药 EFFECTOF 1,25 DIHYDROXYVITAMIN D3 ON CYTOSKELTAL
STRUCTURE AND GENE EXPRESSION IN
OSTEOBLAST-LIKE CELLS
Xue Yan△,Yuan Runying, Xiang Dong, Wang Hongxia,Li Xibin*, Liu Zhengmei*, Wu Kebin**,Fan Muzhen**
(Deaprtment of Biochemistry, Beijing Ji Shui Tan Hospital,Beijing;
*Beijing Neurosurgical Institute; **China-JapanFrendship Hospital)
, http://www.100md.com
The study was carried out to investigatethe effects of 1,25 dihydroxyvitamin D3 [1，25
(OH)2D3] on cytoskeleton in ratosteoblast-like cells (ROS 17/2.8) by immunofluorescent
staining methods and on gene expression in human osteoblast-likecells (OS-732) by a dot
blot techique.
The results showed that the microtubulesand vimentins improved and the immunoflurore-
, http://www.100md.com
scence of fibronectins increased in ROS 17/2.8 cells after 4 daysusing 10-7 mol/L 1,25(OH)2D3
treatment. However c-myc and met D highly expressed in OS-732cells after and before 1,25
(OH)2D3 treatment. Also the relationshipsof cell differentiation and cytoskeletal structure and
gene expression were discussed. KEY WORDS 1,25 Dihydroxyvitamin D3;Osteoblast-like cell; Cytoskeleton; Fibronectin;
Gene expression
______________________
△Department of Biochemistry, Beijing JiShui Tan Hospital, Beijing 100035, China, 百拇医药(作者：薛 延 袁润英 相 东 王红霞李希斌** 刘正梅** 吴克斌*** 范慕贞***)
单位：北京积水潭医院生化研究室，免疫研究室，北京 100035；**北京市神经外科研究所细胞生物学研究室；***中日友好医院临床医学研究所生化研究室
关键词：1；25双羟基维生素D3；成骨样细胞；细胞骨架；纤粘蛋白；基因表达
解剖学报980114
摘 要 用荧光免疫法研究了1，25双羟基维生素D3对大鼠成骨样细胞(ROS17/2.8)
细胞骨架的影响和用斑点杂交技术研究了1，25(OH)2D3对人成骨样细胞(OS-732)基因
, 百拇医药
表达的影响。结果表明：在10-7mol/L 1,25(OH)2D3连续作用4d后，大鼠ROS17/2.8细胞
的微管蛋白和波形纤维蛋白明显改善，纤粘蛋白荧光明显增强。而在1，25(OH)2D3作
用前后OS-732细胞c-myc和met D基因均处于高度活跃表达状态。本文还讨论了细胞分
化与细胞骨架及基因表达的关系。
1α,25双羟基维生素D3[简称D3或1,25(OH)2D3]是一种钙调节激素，对血钙具有双
向调节作用。有关1，25(OH)2D3对人或大鼠成骨样细胞增殖和诱导分化作用国内外已
, 百拇医药
有报道[1～3]。为了进一步探讨1，25(OH)2D3对成骨样细胞诱导分化及其调控机理。本
实验着重研究了1，25(OH)2D3对大鼠成骨样细胞(ROS17/2.8)细胞骨架，细胞表面纤粘
蛋白(FN)改变和对人成骨样细胞(OS-732)c-myc和met D基因表达的影响。
材料和方法
1.细胞培养
将免疫室建立的人成骨样细胞系OS-732和大鼠ROS17/2.8细胞系(北京医科大学杜
, 百拇医药 国光教授赠)，置于含10%～20%小牛血清(哈尔滨)的RPMI1640(Gibco)培养基，37℃，5% CO2 的培养箱内，每3d换液1次。将1，25(OH)2D3(FHoffmamnLa-Roche)用无水乙
醇配成10-8和10-7mol/L浓度，加入上述细胞。对照组加等量乙醇。
2. 细胞骨架免疫荧光染色
2.1 微丝免疫荧光染色：细胞盖片经PBS漂洗后，用4%多聚甲醛固定20min后用冷
丙酮固定7min。漂染后，加1∶50稀释的鬼笔环肽(TRITC-Phalloidin)，Sigma公司)结合
F-actin。暗处放置、漂洗、封片。
, 百拇医药
2.2 微管免疫荧光染色：细胞盖片用冷甲醇固定20min，PBS漂洗，加1∶50稀释的
抗海胆微管蛋白抗体(Polyscience公司)1～2h，再加FITC羊抗兔IgG(北京生物制品研究
所)，漂洗、封片。
2.3 波形纤维蛋白荧光染色：抗波形纤维蛋白单克隆抗体(北京市神经外科研究所
细胞生物学室)，细胞盖片用冷甲醇固定20min，PBS漂洗，加抗波形纤维蛋白单克隆
抗体孵育2h，再加羊抗鼠IgG(北京生物制品研究所)。漂洗、封片。2.4 纤粘蛋白(FN)
免疫荧光染色：细胞盖片固定步骤同微丝，然后用PBS漂洗，加抗FN抗体(北京医科
, 百拇医药
大学)，在室温放置1h。漂洗，加FITC-羊抗兔IgG抗体，室温放置、漂洗、封片。荧
光染色后用NikonDiaphot荧光显微镜观察。采用自动曝光系统摄片。
3. 基因表达技术
3.1 细胞RNA的提取：按White等[4]方法加以改进，在给药后2～3d，收集4×107/ml
不同组别细胞，用超声波处理20s，用10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA缓冲液及5%的
NP-40溶解，离心取上清，加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取，取水相，再加等体积氯仿提取，取水相，用1mmol/L NaAC和95%的乙醇沉淀RNA，用紫外分光
, 百拇医药
光度法进行RNA的纯度鉴定和定量分析。
3.2 基因探针的制备[5]c-myc和Met D基因探针分别为8.5kb, ECORI/Hind Ⅲ片段和
11kb ECORI/HindⅢ片段的PBR322质粒。经碱裂解法抽提DNA后进行DNA纯度鉴定和
定量分析。
3.3 缺口翻译标记探针：采用BRL公司的Nick Translation Kit进行α-32P-dCTP标记。
反应总体积为50μl，其中非标记的dATP、dGTP、dTTP各0.2mmol/L, α-32P-dCTP为
50μCi，放射活性为6 000Ci/mmol。
, 百拇医药
3.4 斑点杂交：取20～40μgRNA用15×SSC对倍系列稀释，用点样板(Bio-Rad,USA)将样品点在硝酸纤维膜上，杂交步骤按White法[4]进行。杂交后薄膜在室温晾干，用X光胶片加增减屏在-80℃曝光。3d显影。
结 果
1. 微管(MT)免疫荧光染色
OS-732，ROS17/2.8细胞外形较小且均一。荧光主要集中在核周围，微管以核为中
心形成网状分布，细胞边缘荧光弥散(图1)。经10-8mol/L1,25(OH)2D3处理后第4d，ROS17/2.8细胞微管加长，延伸至整个细胞荧光亦有所增强(图2)。
2.微丝(MF)免疫荧光染色
, 百拇医药
ROS17/2.8细胞微丝束清晰，较粗，沿细胞纵轴方向排列并分布于整个细胞(图3)。
用10-8mol/L1,25(OH)2D3处理后4d ROS17/2.8细胞微丝减少，变细，荧光弥散(图4)。
3.波形纤维蛋白免疫荧光染色
ROS17/2.8细胞波形纤维丝围绕核形成网状分布(图5)。用10-8mol/L 1,25(OH)2D3处
理后，波形纤维丝加长、清晰、荧光亦有增强(图6)。
4.纤粘蛋白(FN)免疫荧光
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ROS17/2.8细胞表面的FN细丝互相连接成网络，荧光弥散(图7)。用10-7mol/L1,25(OH)2D3处理后第4d，可看到细胞表面的FN细丝增多，荧光增强(图8)。
5.c-myc和met D基因在OS-732细胞中的表达
斑点杂交显示，细胞总RNA含量低于0.08μg时，仍能检测到c-myc的斑点，表明
OS-732细胞c-myc基因呈现高度活跃表达状态，c-myc基因杂交自显影黑度与所加总
RNA量呈正相关。在用10-8和10-7D3处理后第3d，细胞c-myc基因含量未见明显改变(图
, http://www.100md.com
9)。在总RNA含量为5.4μg以上时，能清晰地检测出met D基因表达斑点，表明met D基
因呈现活跃表达状态。在用10-7mol/LD3处理后第2d，检测metD基因含量未见明显改变
(图10)。
图9 OS-732细胞在1，25(OH)2D3诱导分化前后c-myc基因表达斑点杂交分析.A对照组；
B 10-7mol/L1,25(OH)2D3处理后；C 108mol/L 1,25(OH)2D3处理后
, 百拇医药
图10 OS-732细胞在1，25(OH)2D3诱导分化前后met D基因表达的斑点杂交分析.A对照
组；B 10-7mol/L1,25(OH)2D3处理后
Fig.9 Dot blotanalysis of c-myc gene expression in OS-732 cells before andafter 1,25(OH)2
D3 treatment A; control OS-732cells B:OS-732 cells treated by 10-7mol/L 1,25(OH)2D3
, http://www.100md.com C:OS-732 cells treated by 10-8mol/L1,25(OH)2D3.
Fig.10 Dot blot analysis of met D gene expression in OS-732 cellsbefore and after 1,25(OH)2 D3 treatment A:Control OS-732cells.B;OS-732 cells treated by 10-7 mol/L 1,25(OH)2D3.
讨 论
细胞形态的维持主要由细胞骨架所决定，而细胞骨架由微丝、微管和波形纤维蛋
白组成，三者高度协调分布，与胞核，质膜，细胞器相连，构成了细胞形态骨架和运
, http://www.100md.com
动协调系统。此外，细胞外基质及其受体对于维持细胞形态也十分重要。如通过整合
素(integrin)与细胞表面FN相连，形成内外相连的复杂系统，传递信息，共同调节细胞
的生长与分化[5～7]。ROS17/2.8细胞微丝较发达，粗、清晰、布满整个细胞，而微管和
波形纤维蛋白集中在核周围，细胞表面的FN荧光较弱。用1，25(OH)2D3处理后，ROS
17/2.8微管和波形纤维蛋白伸展，加长，细胞表面FN免疫，荧光增强，说明1，25(OH)2D3使ROS17/2.8细胞的微管和波形纤维蛋白的组装改善[7]，细胞表面粘着力增强[8]，表
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明1，25(OH)2D3对ROS17/2.8细胞分化有明显作用。使ROS17/2.8细胞具有成骨细胞的
表型特征。用1，25(OH)2D3处理后17/2.8细胞微丝应力纤维减少并解聚。应力显微的数
量与细胞贴壁及运动状态有关，静止时明显，运动时解聚。这一结果与D3处理时细胞
的状态及对细胞状态的影响有关。OS-732细胞中的c-myc和met D)基因都处于活跃表达
状态。c-myc基因一般来说是与增殖、分化有关的基因，它作用于核内DNA结合蛋白。
而met D(或MNNG-HOS转化基因)是具有一种用于分子克隆得到的新的转化基因，来自
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化学致癌的人成骨样细胞系[9]。定位于7号染色体(7P11.4～7qter)。尽管1，25(OH)2D3抑制OS-732细胞增殖和诱导分化的作用已得到证实[1,2]，但本实验观察到1，25(OH)2D3
对OS-732细胞骨架和c-myc及met D基因表达无明显作用，这是否表明这两种基因与OS-
732细胞增殖与分化无关，还是与其他基因有关以及与基因表达细胞类型及细胞发育分
化不同阶段有关，都有待于进一步探讨。
收稿1997-01 修回 1997-06
本文图1～8见插图第12页
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.3860069)
图 版 说 明
图1对照组大鼠ROS17/2.8细胞微管蛋白免疫荧光在核周围呈网状分布，细胞边缘荧光
弥散 ×1 000
图2 用10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理后第4dROS17/2.8细胞微管束加长，荧光增强×1 000
图3 对照组ROS17/2.8细胞微丝束荧光清晰，较粗，扩展至整个细胞×1 000
图4 10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理ROS17/2.8细胞后第4d，微丝荧光明显减少 ×1 000
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图5 对照组ROS17/2.8细胞波形纤维蛋白免疫荧光显示网状分布×1 000
图6 经10-8mol/L 1,25(OH)2D3处理后，ROS17/2.8细胞波形纤维丝扩展、加长、荧光明显
增强 ×1 000
图7 对照组ROS17/2.8细胞表面FN免疫荧光呈弱阳性反应×800
图8 经10-7mol/L 1,25(OH)2D3处理后，ROS17/2.8细胞表面FN荧光增强 ×800
Explanationof figures
Fig.1 Theimmunofluorescence of microtubule network in the perinulearregion in ROS17/2.8
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cells. ×1 000
Fig.2 The immumofluorescence of microtubules enhanced andspreaded in ROS17/2.8 cells
on day 4 after 10-8mol/L1,25(OH)2D3 treatment. ×1 000
Fig.3 The immunofluorescence of microfilament bundles was clear,thick and spreaded all
over the cell in ROS17/2.8 cells. ×1 000
Fig.4 The immunofluorescence of microfilament bundles inROS17/2.8 cell decreased on day
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4 after 10-8mol/L 1,25(OH)2D3treatment. ×800
Fig.5 The immunofluorescence of vimentin in ROS 17/2.8 cells. ×1 000
Fig.6 The immunofluorescence of vimentin in ROS 17/2.8 cellssignficantly increased and
spreaded after 10-8mol/L1,25(OH)2D3 treatment. ×1 000
Fig.7 The immunofluorescence of fibronectins in the surface ofROS 17/2.8 cells exhibited
, 百拇医药
slightly positive reaction. ×800
Fig.8 The immunofluorescence of fibronectins in the surface ofROS 17/2.8 cells increased
after 10-8mol/L1,25(OH)2D3treatment. ×800
参 考 文 献
[1] 薛 延，王红霞，袁润英等.1α25双羟维生素D3对成骨细胞增殖与分化的影响.中国骨
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osteoblasts medulation by 1,25dihydroxyvitamin D3. J Bone Miner Res, 1995; 10(6):874
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[6] 李希斌，刘正梅，邵文剑.人脑胶质瘤细胞系BT325细胞的免疫荧光研究.解剖学报，1990；21(3)：269
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, 百拇医药 EFFECTOF 1,25 DIHYDROXYVITAMIN D3 ON CYTOSKELTAL
STRUCTURE AND GENE EXPRESSION IN
OSTEOBLAST-LIKE CELLS
Xue Yan△,Yuan Runying, Xiang Dong, Wang Hongxia,Li Xibin*, Liu Zhengmei*, Wu Kebin**,Fan Muzhen**
(Deaprtment of Biochemistry, Beijing Ji Shui Tan Hospital,Beijing;
*Beijing Neurosurgical Institute; **China-JapanFrendship Hospital)
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The study was carried out to investigatethe effects of 1,25 dihydroxyvitamin D3 [1，25
(OH)2D3] on cytoskeleton in ratosteoblast-like cells (ROS 17/2.8) by immunofluorescent
staining methods and on gene expression in human osteoblast-likecells (OS-732) by a dot
blot techique.
The results showed that the microtubulesand vimentins improved and the immunoflurore-
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scence of fibronectins increased in ROS 17/2.8 cells after 4 daysusing 10-7 mol/L 1,25(OH)2D3
treatment. However c-myc and met D highly expressed in OS-732cells after and before 1,25
(OH)2D3 treatment. Also the relationshipsof cell differentiation and cytoskeletal structure and
gene expression were discussed. KEY WORDS 1,25 Dihydroxyvitamin D3;Osteoblast-like cell; Cytoskeleton; Fibronectin;
Gene expression
______________________
△Department of Biochemistry, Beijing JiShui Tan Hospital, Beijing 100035, China, 百拇医药(作者：薛 延 袁润英 相 东 王红霞李希斌** 刘正梅** 吴克斌*** 范慕贞***)