细胞色素P450 2C19单碱基突变位点CYP2C19m1的分析1
作者：赵鲁杭 孙红颖 郑妮娜 李菊花 姚彤炜 陈枢青
单位：赵鲁杭 孙红颖 郑妮娜 李菊花 姚彤炜 陈枢青(杭州 310006 浙江医科大学)
关键词：细胞色素P4502C19(CYP2C19)；CYP2C19m1；基因分型；等位基因特异扩增法(ASA)
980318摘要：目的：CYP2C19m1是引起CYP2C19酶活性缺陷的主要等位基因，有83%左右的慢代谢者含有CYP2C19m1等位基因，本文试图建立一步PCR测定CYP2C19m1等位基因的方法。方法：根据等位基因特异扩增(ASA)原理设计两对分别特异扩增野生型等位基因和突变型等位基因的引物，建立了一步PCR测定CYP2C19m1等位基因的方法。结果：对39位随机受试者进行了基因分型研究，发现3位CYP2C19m1纯合子、18位CYP2C19m1杂合子，其余18位为野生型纯合子。结论：说明该法能够用于测定CYP2C19m1等位基因，并且证明该法具有简便、快速和污染少的优点。
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Analysis of single base mutation of cytochrome
P450 2C19 allele CYP2C19m1
Zhao Luhang(Zhao LH),Sun Hongying(Su HY),Zheng Nina(Zheng NN),et al
(Department of Biochemistry,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310031)
ABSTRACT OBJECTIVE：Cytochrome P450 2C19 enzyme deficiency was mainly caused by CYP2C19m1 allele.It was said more than 83% of poor metabolizers were due to the existence of this allele.This study was aimed to set up an efficient PCR procedure to analyse this allele.METHODS：The principle of allele-specific amplification was used to build up the PCR method of detecting the single base mutation of CYP2C19m1.RESULTS：This method was employed to genotype 39 random Chinese volunteers.3 CYP2C19m1 homozygotes and 18 CYP2C19m1 heterozygotes were found.CONCLUSION：This method was proved to be more fast,easier and less contanimation.
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KEY WORSDS Cytochrome P450 2C19(CYP2C19)；CYP2C19m1；Genotyping；Allele-specific amplification
1984年，Wedlund[1]等报道美芬妥英氧化代谢在人群中存在着遗传多态性。人群中的一些人羟化速度很快被称作快代谢者，另一些人羟化速度很慢被称为慢代谢者。1993年，Wrighton[2]等从人类肝脏中分离出一种酶并命名为CYP2C19，提出CYP2C19即为美芬妥英羟化酶。后来发现CYP2C19 还参与安定、心得安和奥美拉唑等其它十几种药物的代谢。进一步研究证明，快代谢者拥有野生型CYP2C19基因，慢代谢者拥有突变型CYP2C19基因，慢代谢者是由于基因突变造成表达产物酶分子改变从而产生代谢缺陷。1994年，Morais[3]等发现了CYP2C19的一个突变位点CYP2C19m1，该等位基因是由于CYP2C19基因第5外显子681位G→A突变造成酶活性缺陷的，并运用PCR-RFLP原理建立了该等位基因的测定方法，发现83%的慢代谢者是由于CYP2C19m1位点突变造成的。本研究旨在运用等位基因特异扩增原理建立简单经济的基因分型法，以加速CYP2C19基因多态性及其临床意义的研究。
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1 材料和方法
1.1 试剂
Taq DNA聚合酶(Promega)，dNTP(Promega)，PCR缓冲液(Promega)，25mM氯化镁溶液(Promega)，引物(上海Sangon公司)，Igepal(Sigma)，标准分子量DNA样品(华美生物工程公司)，其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器
PCR仪(HYBAID)，电泳仪(Pharmacia)，凝胶成像系统(Stratagene)，高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)，低温高速离心机(Hitachi)，电子天平(Sartoriou)，微量电子天平(Mettle)。
1.3 受试者：39名随机受试者来源于志愿献血者，每位受试者取静脉血5ml,15%的EDTA抗凝，用于提取DNA。
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1.4 方法
1.4.1 DNA的提取按Chen[4]等的方法进行。
1.4.2 等位基因特异扩增法：50μl PCR反应体系含有10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、2.0mM MgCl2、0.2mM各dNTP、0.2μM各引物和50～1000ng的DNA模板，1.0单位的Taq DNA聚合酶。94℃×1min、61℃×1min、72℃×1.5min扩增35循环。最后，72℃延长10min。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的产物。
1.4.3 基因分型结果重复性与质量控制：取已测定结果的DNA样本10份，这些样本中含有野生型、杂合型和突变型CYP2C19m1等位基因，每份样本分成二份。然后，随机编号得到20份DNA样本，进行盲法测定基因分型。将结果与原来的测定结果对照，检测其一致性。
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2 结果与讨论
2.1 ASA-PCR 的基本构思是设计两个引物，使之与另一引物构成PCR反应体系。等位基因的特异性碱基即突变位点位于引物3'端。这种设计是基于耐热Taq DNA 聚合酶缺乏3'→5'核酸外切酶活性。引物3'端的特异性碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相应碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3'、5'磷酸二酯键形成障碍而受阻。根据这个原理，在仔细分析了CYP2C19基因序列后，设计了如下引物(表1)。
表1 CYP2C19m1测定时所使用的引物 基因型
序 列
野生型
正向
5′-AAT TAC AAC CAG AGA GCT TGG C-3′
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反向
5′-GTA ATT TGT TAT GGG TTC CC-3′
突变型
正向
5′-AAT TAC AAC CAG AGA GCT TGG C-3′
反向
5′-GTA ATT TGT TAT GGG TTC CT-3′
利用以上引物对每一份DNA样本，进行野生型等位基因特异的和突变型等位基因特异的PCR扩增，其结果有三种可能性：野生型等位基因特异的引物有扩增，说明检样含野生型等位基因；突变型等位基因特异的引物有扩增，说明检样含突变型等位基因；野生型和突变型等位基因均有扩增，说明检样是杂合子(见附图)。
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附图 CYP2C19m1突变位点测定的典型结果(目标片段139bp)1,8-标准分子量DNA样品；2,4,6-野生型引物；3,5,7-突变型引物；2,3-受试者为野生型纯合子；4,5-受试者为杂合子；6,7-受试者为突变型纯合子
2.2 对39位随机受试者进行了CYP2C19m1突变位点测定，结果见表2。该结果说明利用ASA基本原理设计的方法可区分wt/wt、wt/m1和m1/m1三种基因型。基因分型结果重复性与质量控制试验说明该法重复性好，无污染问题。本法(ASA法)与经PCR扩增后再酶切的方法(酶切法)相比，主要优点在于简便快速。ASA法只需一步PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，即可得到基因分型结果；酶切法在PCR扩增后，还必须用限制性内切酶进行约16小时的酶切反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，观察结果。所以，ASA法简化了测定步骤，缩短了测定时间，为将来应用于临床奠定基础。
表2 39位随机受试者的基因型 基因型
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例数
百分比(%)
wt/wt
18
46.1
wt/m1
18
46.1
m1/m1
3
7.8
作者简介：孙红颖 郑妮娜 李菊花 姚彤炜 陈枢青：浙江省自然科学基金资助课题第396473号
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参考文献
1 Wedlund PJ,Aslanian WS,McAllister CB,et al.Mephenytoin hydroxylation deficiency in Caucasians:Frequency of a new oxidative drug metabolism polymorphism.Clin Pharmacol Ther，1984，36(6)∶773.
2 Wrighton SA,Stevens JC,Becker GW,et al.Isolation and characterization of human liver cytochrome P450 2C19:Correlation between 2C19 and S-mephenytoin 4'-hydroxylation.Archives of Biochemistry and Biophysics，1993，306(1)∶240.
, 百拇医药
3 Morais SMF,Wilkinson GR,Blaisdell J,et al.The major genetic defect responsible for the polymorphism of s-mephenytoin metabolism in humans,Journal of Biological Chemistry，1994，269(22)∶15419.
4 Chen S,Chou WH,Blouin RA,et al.The cytochrome P450-2D6(CYP2D6) enzyme polymorphism:screening costs and influence on clinical outcomes in psychiatry.Clin Pharm Ther,1996，60(5)∶522.
收稿日期：1998-02-24, 百拇医药
单位：赵鲁杭 孙红颖 郑妮娜 李菊花 姚彤炜 陈枢青(杭州 310006 浙江医科大学)
关键词：细胞色素P4502C19(CYP2C19)；CYP2C19m1；基因分型；等位基因特异扩增法(ASA)
980318摘要：目的：CYP2C19m1是引起CYP2C19酶活性缺陷的主要等位基因，有83%左右的慢代谢者含有CYP2C19m1等位基因，本文试图建立一步PCR测定CYP2C19m1等位基因的方法。方法：根据等位基因特异扩增(ASA)原理设计两对分别特异扩增野生型等位基因和突变型等位基因的引物，建立了一步PCR测定CYP2C19m1等位基因的方法。结果：对39位随机受试者进行了基因分型研究，发现3位CYP2C19m1纯合子、18位CYP2C19m1杂合子，其余18位为野生型纯合子。结论：说明该法能够用于测定CYP2C19m1等位基因，并且证明该法具有简便、快速和污染少的优点。
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Analysis of single base mutation of cytochrome
P450 2C19 allele CYP2C19m1
Zhao Luhang(Zhao LH),Sun Hongying(Su HY),Zheng Nina(Zheng NN),et al
(Department of Biochemistry,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310031)
ABSTRACT OBJECTIVE：Cytochrome P450 2C19 enzyme deficiency was mainly caused by CYP2C19m1 allele.It was said more than 83% of poor metabolizers were due to the existence of this allele.This study was aimed to set up an efficient PCR procedure to analyse this allele.METHODS：The principle of allele-specific amplification was used to build up the PCR method of detecting the single base mutation of CYP2C19m1.RESULTS：This method was employed to genotype 39 random Chinese volunteers.3 CYP2C19m1 homozygotes and 18 CYP2C19m1 heterozygotes were found.CONCLUSION：This method was proved to be more fast,easier and less contanimation.
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KEY WORSDS Cytochrome P450 2C19(CYP2C19)；CYP2C19m1；Genotyping；Allele-specific amplification
1984年，Wedlund[1]等报道美芬妥英氧化代谢在人群中存在着遗传多态性。人群中的一些人羟化速度很快被称作快代谢者，另一些人羟化速度很慢被称为慢代谢者。1993年，Wrighton[2]等从人类肝脏中分离出一种酶并命名为CYP2C19，提出CYP2C19即为美芬妥英羟化酶。后来发现CYP2C19 还参与安定、心得安和奥美拉唑等其它十几种药物的代谢。进一步研究证明，快代谢者拥有野生型CYP2C19基因，慢代谢者拥有突变型CYP2C19基因，慢代谢者是由于基因突变造成表达产物酶分子改变从而产生代谢缺陷。1994年，Morais[3]等发现了CYP2C19的一个突变位点CYP2C19m1，该等位基因是由于CYP2C19基因第5外显子681位G→A突变造成酶活性缺陷的，并运用PCR-RFLP原理建立了该等位基因的测定方法，发现83%的慢代谢者是由于CYP2C19m1位点突变造成的。本研究旨在运用等位基因特异扩增原理建立简单经济的基因分型法，以加速CYP2C19基因多态性及其临床意义的研究。
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1 材料和方法
1.1 试剂
Taq DNA聚合酶(Promega)，dNTP(Promega)，PCR缓冲液(Promega)，25mM氯化镁溶液(Promega)，引物(上海Sangon公司)，Igepal(Sigma)，标准分子量DNA样品(华美生物工程公司)，其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 仪器
PCR仪(HYBAID)，电泳仪(Pharmacia)，凝胶成像系统(Stratagene)，高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)，低温高速离心机(Hitachi)，电子天平(Sartoriou)，微量电子天平(Mettle)。
1.3 受试者：39名随机受试者来源于志愿献血者，每位受试者取静脉血5ml,15%的EDTA抗凝，用于提取DNA。
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1.4 方法
1.4.1 DNA的提取按Chen[4]等的方法进行。
1.4.2 等位基因特异扩增法：50μl PCR反应体系含有10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl、2.0mM MgCl2、0.2mM各dNTP、0.2μM各引物和50～1000ng的DNA模板，1.0单位的Taq DNA聚合酶。94℃×1min、61℃×1min、72℃×1.5min扩增35循环。最后，72℃延长10min。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的产物。
1.4.3 基因分型结果重复性与质量控制：取已测定结果的DNA样本10份，这些样本中含有野生型、杂合型和突变型CYP2C19m1等位基因，每份样本分成二份。然后，随机编号得到20份DNA样本，进行盲法测定基因分型。将结果与原来的测定结果对照，检测其一致性。
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2 结果与讨论
2.1 ASA-PCR 的基本构思是设计两个引物，使之与另一引物构成PCR反应体系。等位基因的特异性碱基即突变位点位于引物3'端。这种设计是基于耐热Taq DNA 聚合酶缺乏3'→5'核酸外切酶活性。引物3'端的特异性碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相应碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3'、5'磷酸二酯键形成障碍而受阻。根据这个原理，在仔细分析了CYP2C19基因序列后，设计了如下引物(表1)。
表1 CYP2C19m1测定时所使用的引物 基因型
序 列
野生型
正向
5′-AAT TAC AAC CAG AGA GCT TGG C-3′
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反向
5′-GTA ATT TGT TAT GGG TTC CC-3′
突变型
正向
5′-AAT TAC AAC CAG AGA GCT TGG C-3′
反向
5′-GTA ATT TGT TAT GGG TTC CT-3′
利用以上引物对每一份DNA样本，进行野生型等位基因特异的和突变型等位基因特异的PCR扩增，其结果有三种可能性：野生型等位基因特异的引物有扩增，说明检样含野生型等位基因；突变型等位基因特异的引物有扩增，说明检样含突变型等位基因；野生型和突变型等位基因均有扩增，说明检样是杂合子(见附图)。
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附图 CYP2C19m1突变位点测定的典型结果(目标片段139bp)1,8-标准分子量DNA样品；2,4,6-野生型引物；3,5,7-突变型引物；2,3-受试者为野生型纯合子；4,5-受试者为杂合子；6,7-受试者为突变型纯合子
2.2 对39位随机受试者进行了CYP2C19m1突变位点测定，结果见表2。该结果说明利用ASA基本原理设计的方法可区分wt/wt、wt/m1和m1/m1三种基因型。基因分型结果重复性与质量控制试验说明该法重复性好，无污染问题。本法(ASA法)与经PCR扩增后再酶切的方法(酶切法)相比，主要优点在于简便快速。ASA法只需一步PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，即可得到基因分型结果；酶切法在PCR扩增后，还必须用限制性内切酶进行约16小时的酶切反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，观察结果。所以，ASA法简化了测定步骤，缩短了测定时间，为将来应用于临床奠定基础。
表2 39位随机受试者的基因型 基因型
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例数
百分比(%)
wt/wt
18
46.1
wt/m1
18
46.1
m1/m1
3
7.8
作者简介：孙红颖 郑妮娜 李菊花 姚彤炜 陈枢青：浙江省自然科学基金资助课题第396473号
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参考文献
1 Wedlund PJ,Aslanian WS,McAllister CB,et al.Mephenytoin hydroxylation deficiency in Caucasians:Frequency of a new oxidative drug metabolism polymorphism.Clin Pharmacol Ther，1984，36(6)∶773.
2 Wrighton SA,Stevens JC,Becker GW,et al.Isolation and characterization of human liver cytochrome P450 2C19:Correlation between 2C19 and S-mephenytoin 4'-hydroxylation.Archives of Biochemistry and Biophysics，1993，306(1)∶240.
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3 Morais SMF,Wilkinson GR,Blaisdell J,et al.The major genetic defect responsible for the polymorphism of s-mephenytoin metabolism in humans,Journal of Biological Chemistry，1994，269(22)∶15419.
4 Chen S,Chou WH,Blouin RA,et al.The cytochrome P450-2D6(CYP2D6) enzyme polymorphism:screening costs and influence on clinical outcomes in psychiatry.Clin Pharm Ther,1996，60(5)∶522.
收稿日期：1998-02-24, 百拇医药