白细胞介素1β转化酶基因在肾组织中的表达
作者：廖洪军 陈香美 叶一舟 王建中
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院肾科 中国人民解放军肾脏病研究重点实验室
关键词：白细胞介素1；基因表达；肾
中华医学杂志980318 【摘要】 目的 进一步证实白细胞介素1β转化酶(ICE)基因是否在人类肾脏中有表达。方法 利用细胞培养肾单位微分离技术、逆转录-聚合酶链式反应及Northern杂交方法，检测人肾脏组织ICE mRNA表达。结果 正常人肾脏的肾小球、肾小管、肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞及肾小管上皮细胞均有ICE mRNA表达，其表达强度低于外周血单个核白细胞。结论 首次证实了正常人肾脏有ICE基因的表达，为进一步研究ICE基因在肾脏组织细胞凋亡中的作用奠定了基础。
Identification of interleukin-1 βconverting enzyme gene expression in human kidney Liao Hongjun, Chen Xiangmei, Ye Yizhou, et al. Department of Nephrology, General Hospital of PLA, Beijing 100853
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To confirm that Interleukin-1 β-converting enzyme(ICE) is a first identified apoptosis related gene in mammals. Methods The expressions of ICE mRNA in human kidney tissue, different segment of nephron and glomerular resident cells were measured by using the methods of microdissection, reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Northern hybridization.Results Compared with peripheral blood mononuclear lymphocyte weak expressions of ICE mRNA were noted not only in glomeruli and tubule but also in glomerular mesangial cells, glomerular endothelial cells and tubular epithelial cells of the human kidney.Conclusion There is a widely distributed expression of ICE mRNA in the human kidney, which may provide a theoretical basis for the study of ICE gene in apoptosis of kidney.
, 百拇医药
【Key words】 Interleukin-1 Gene expression Kidney
(Natl Med J China 1998,78:218-221)
1992年，Gerretti等[1，2]首先克隆出人和鼠类白细胞介素-1β转化酶(Interlueukin-1β-converting enzyme ICE)cDNA，并证实ICE是IL-1β前体转化成有生物活性、成熟IL-1β过程中必需的酶，IL-1是一种重要的炎症因子，因此，ICE基因在炎症反应中起着重要作用[3]。Yuan等[4]发现ICE cDNA与线虫ced-3自杀基因具有高度的同源性，并证实ICE是哺乳动物细胞凋亡相关基因，现已证明ICE可以介导多种细胞发生凋亡。IL-1β是肾小球肾炎发病机制中的一个重要炎症因子，并且可以由肾小球系膜细胞分泌[5]，迄今为止，脏器组织细胞是否有ICE基因表达仍未见报道，特别是Chaplin等[2]用肾脏组织总RNA进行Northern杂交未检测到肾组织ice基因的表达。我们通过提取正常人肾组织总RNA和分离mRNA，以及利用肾单位微分离技术和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Northern杂交方法，从器官、亚器官和细胞水平对正常成人肾脏组织的ICE mRNA表达进行了检测，以进一步探讨ICE基因在肾脏组织细胞凋亡中的作用。
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材料与方法
一、正常成人肾脏组织的获取及肾单位的微分离
正常成人肾脏组织取自配型不合的移植供肾。切取肾皮质约0.5 g，一步法(TRIzol Reagent，GIBCO BRL)提取总RNA。进一步用OligodT亲和法分离mRNA。肾小球、肾小管的微分离技术是按照文献[6]的方法进行，用含有1 mg/ml V型胶原酶和1 mg/ml BSA的灌注液(135 mmol/L Nacl、1 mmol/L Na2SO4、12 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L葡萄糖)由肾动脉灌洗肾脏后，切取含有皮质-髓质-乳头的薄片组织，厚约2 mm，在纯氧通气条件下，用上述灌洗液37℃消化15分钟，在解剖显微镜下分离肾单位，在皮质可分离出肾小球和近曲小管S1段。用0.4%台酚蓝染色液鉴定细胞活性。
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二、肾脏的肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞分离和培养
按本室方法[5，7]。取正常人静脉血20 ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核白细胞，收集1×106细胞数，用一步法提取总RNA，由于白细胞ICE基因呈丰富表达，因此本研究用外周血单个白细胞作为阳性对照。
三、逆转录PCR
一步法提取RNA，紫外分光光度计定量及电泳确定RNA质量，取10 μg总RNA按逆转录试剂盒说明进行逆转录。微分离肾小球和近曲肾小管S1段逆转录：用细玻璃管吸取0.4%台酚蓝拒染的5个肾小球或2 mm长肾小管，转入含有10 μl的收集液(1.2 μ/μl RNAsin、5 mmol/L DTT的灌洗液)eppendorf管内，10 000 r/min，4℃离心，弃上清，加入10 μl细胞液(2% Triton-X 100、5 mmol/L DTT及1.2 U/μl RNAsin)。然后按逆转录试剂盒说明进行逆转录。ICE基因的PCR引物是参照文献[1]合成，正义5′-CAgAgATTTATCCAATAATg-3′(446-465)；反义：5′TCAAATgAAAATCgAACCT-3(1129-1111)，经PCR扩增后目的片段长度为684 bp。PCR设计用ICE mRNA 表达丰富的外周血单个核细胞作为阳性对照，用未经逆转录的RNA作阴性对照；用GAPDH作内参照。取5 μl逆转录反应液，PCR反应体积为30 μl，按美国Promega公司试剂盒说明进行PCR，加酶之前在PTC-100型PCR仪上75℃预热3分钟，反应条件为94℃30秒，60℃30秒、72℃90秒，反应30循环后72℃延伸3分钟。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪观察结果。计算PCR产物荧光强度峰值，以及ICE cDNA与GAPDH cDNA的峰值比(ICEp/GAPDHp)作为ICE基因的相对表达强度。
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四、Southern杂交
取RT-PCR产物10 μl用1%琼脂糖凝胶电泳，碱变性后用10×SSC转膜15小时。用CL-1 000 ultraviolet crosslinker核酸固定仪紫外线照射4分钟，强度为400 μJ/cm2。含有全长ICE cDNA的质粒由美国Gerretti博士馈赠，质粒的扩增、提取、酶切及探针的纯化是按分子克隆方法进行。探针长为1.325 kb，用随机引物试剂盒(美国Stratagene公司)标记α32PdCTP(美国Dupont公司)。65℃洗膜15分钟1次，在-70℃放射线自显影24小时。
五、Nothern杂交
取10～40 μg肾脏总RNA和2 μg mRNA，65℃水浴15分钟变性后在1%琼脂糖凝胶电泳，20×SSC转膜15小时，紫外线固定4分钟。ICE探针标记、杂交及洗膜方法同Southern杂交，放射线自显影96小时。选用人GAPDH PCR产物，长度为620 bp，经Geneclean后作为看家基因进行Nothern杂交。用凝胶图象分析系统观察结果，计算ICE与GAPDH峰值信号光密度比(ICEp/GAPDHp)作为ICE基因的相对表达强度。
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结果
一、ICE基因的RT-PCR检测结果
人的肾小球、肾小管、肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞的RNA经逆转录后，PCR产物电泳，均可见到约680 bp的特异性电泳条带(图1)，内参照GAPDH的PCR产物电泳，均可见均匀一致、长约620 bp的特异性电泳条带(图1)，RNA产物不经逆转录，直接进行PCR，电泳均未见特异性扩增产物。
1.1 kb ladder Marker；2.外周血单个核白细胞；3.肾小球；4.肾小管；5.肾小球系膜细胞；6.肾小球内皮细 胞；7.肾小管上皮细胞
图1 肾脏细胞和肾单位
ICE和GAPDH基因RT-PCR电泳结果
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在细胞RT-PCR，外周血单个核白细胞ICE mRNA相对表达强度为最高0.805。在RT-PCR起始总RNA量相同的情况下，外周血单个核白细胞ICE mRNA相对表达强度为肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞的1.3～1.8倍。肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞的ICE mRNA相对表达强度分别为0.467、0.458和0.622，以肾小管上皮细胞较高，肾小管上皮细胞ICE mRNA的相对表达强度为肾小球系膜细胞和肾小球内皮细胞的1.3～1.4倍。肾单位微分离的5个肾小球和2 mm肾小管ICE mRNA相对表达强度分别为0.326和0.392(表1)。
表1 肾单位和肾脏细胞
ICE mRNA RT-PCR结果(光密度值) 分类
ICE
峰值
, http://www.100md.com
GAPDH
峰值
ICEP/GAPDHP
比值
外周血白细胞
191.5
237.7
0.805
肾脏细胞
系膜细胞
108.8
233.3
, http://www.100md.com
0.467
内皮细胞
105.7
230.5
0.458
小管上皮细胞
142.8
229.4
0.622
肾单位
肾小球
75.3
230.5
, 百拇医药
0.326
肾小管
90.7
230.9
0.392
二、RT-PCR产物Southern杂交
外周血单个核白细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的杂交鉴定，均出现了特异性的杂交条带(图2)。未见ICE杂交特异性信号，作为阴性对照。表明ICE PCR产物为特异性ICE cDNA。
1.阴性对照(1 kb ladder Marker)；2：外周血单个核白细胞；
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3.肾小球系膜细胞；4.肾小球上皮细胞
图2 ICE基因RT-PCR产物Southern杂交结果
三、肾脏组织ICE基因Northern杂交
肾脏mRNA和总RNA经Northern杂交放射性自显影96小时均出现ICE mRNA杂交特异性信号，ICE mRNA信号较强，但mRNA和总RNA检测ice基因相对表达强度(ICEp/GAPDHp)分别为0.72和0.61～0.70，说明无论是提取肾脏总RNA还是mRNA，其ICE基因表达强度是一致的。随着总RNA上样量的减少，ICE mRNA特异性杂交信号逐渐减弱，总RNA为10 μg时，ICE mRNA的杂交信号非常微弱(图3，表2)。
1.2μg mRNA；2～5.总RNA，分别为40、30、20、10μg
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图3 肾组织mRNA和总RNA基因(上)和GAPDH基因
(下)Northern杂交结果
表2 肾脏组织ICE基因Northern杂交结果(光密度值) 分类
mRNA
(2 μg)
总RNA(μg)
40
30
20
10
ICE峰值
, http://www.100md.com 339
150
76
51
30
GAPDH峰值
471
214
111
75
50
ICEp/GAPDH比值
0.72
, 百拇医药
0.70
0.68
0.69
0.61
讨论
1992年克隆的ICE基因属于胱氨酸蛋白酶家族成员，可以激活IL-1 β前体使之变为成熟的IL-1 β[1]，因此ICE基因在炎症反应中起着十分重要的作用。在ICE基因缺陷的小鼠，其体内IL-1β和IL-6的产生受到明显抑制[3]，并且这种小鼠可以抵抗注射脂多糖引起的细菌内毒素性休克。Yuan等[4]报道了鼠类ICE与ced-3(线虫细胞凋亡基因)同源性达28%，并且具有相同的功能，因而使ICE成为第一个被发现的、也是最重要的哺乳类动物细胞凋亡基因。现已证实ICE基因在神经和肿瘤等多种组织的细胞凋亡中起重要作用。通过ICE基因调节表达可以减轻缺血再灌注神经元损伤和抑制脑肿瘤细胞的生长[8，9]。抑制或调节ICE基因的功能已成为减轻组织损伤和抑制肿瘤生长的潜在治疗途径。Gerretti等[1，2]克隆了鼠类ICE cDNA，并观察了ICE mRNA组织分布，结果发现广泛地分布于正常小鼠脾、心、脑、肾上腺和肝脏，其中在脾脏表达最为丰富，然而，用Northern杂交方法未见到肾脏组织ICE基因表达。并且，到目前为止，未见到研究人类肾脏ICE基因表达的文献。
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文献证实[5]，肾小球系膜细胞可以表达和分泌IL-1β，IL-1β是肾小球肾炎系膜增殖和硬化的最重要的炎症介质之一。此外，肾脏疾病中细胞凋亡的参与已得到公认，我们的前期实验已证实缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞凋亡所起的重要作用[7]，鉴于ICE基因在炎症和细胞凋亡中的重要作用，确认ICE基因在人肾组织和细胞中是否表达具有重要的理论价值。我们通过增加总RNA上样量至40 μg以及提取肾脏mRNA进行Northern杂交证实了肾组织中ICE mRNA的表达，从而比较系统地确认了肾脏有ICE基因的表达。与外周血单个核白细胞相比，肾脏ICE基因的表达较弱。我们用mRNA进行Northern杂交提高了检测的敏感性，使用肾单位微分离和肾脏固有细胞分离和培养技术不仅排除了血细胞中ICE基因对检测的干扰而且可以对肾脏ICE基因的表达进行微定位，实验结果全面、可靠。
本课题为国家自然基金资助项目
参考文献
, 百拇医药
1 Gerretti D, Kozlosky C, Mosley B, et al. Molecular conling of the interleukin-1 β converting enzyme. Science, 1992,256：97-100.
2 Nett M, Cerretti D, Seavitt J, et al. Molecular cloning of the murine IL-1 β-converting enzyme cDNA. J Immunol, 1992,149：3254-3259.
3 Kuida K, Lippke JA, Ku G, et al.Altered cytokine exprot and apoptosis in mice deficient in interleukin-1 β converting enzyme. Sicence, 1995,267：2000-2003.
, 百拇医药
4 Yuan J, Shaham S, Ledoux S, et al. The C elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 β-converting enzyme. Cell, 1993,19：641-645.
5 陈香美，田劲，黎磊石.小鼠肾小球系膜细胞白介素-1β基因表达研究.中华医学杂志，1991，71：11-15.
6 Terada Y, Tomita K, Nonoguchi H, et al. Different localization of two gype of endothelin receptor mRNA in microdissected rat nephron segments using reverse transcription and polymerase chain reaction assay. J Clin Invest, 1992,90：107-112.
, http://www.100md.com
7 陈香美，于力方，陈中华等.肾小球内皮细胞培养及产生细胞外基质的实验研究.中华医学杂志，1995，75：25-28.
8 Friedlander RM, Gagliardin V, Hara H, et al. Expreesion of a dominant negative mutant of interleukin-1 in transgenic mice prevent neuronal cell death induced by trophic factor withdrawal and ischemic brain injury. J Exp Med, 1997,185：933-937.
9 Yu JS, Sena-Esteves M, Panlus W, et al. Retroviral delivery and tetracyclin-dependent expression of IL-1 β converting enzyme(ICE) in a rat glioma model provides controlled induction of apoptosis in tumor cells. Cancer Res, 1996,56：5423-5427.
10 廖洪军，陈香美，崔世雄，等.缺血性肾损伤中细胞凋亡的初步观察.中华医学杂志，1994，10：628-631.
(收稿：1997-09-05 修回：1997-12-02), http://www.100md.com
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院肾科 中国人民解放军肾脏病研究重点实验室
关键词：白细胞介素1；基因表达；肾
中华医学杂志980318 【摘要】 目的 进一步证实白细胞介素1β转化酶(ICE)基因是否在人类肾脏中有表达。方法 利用细胞培养肾单位微分离技术、逆转录-聚合酶链式反应及Northern杂交方法，检测人肾脏组织ICE mRNA表达。结果 正常人肾脏的肾小球、肾小管、肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞及肾小管上皮细胞均有ICE mRNA表达，其表达强度低于外周血单个核白细胞。结论 首次证实了正常人肾脏有ICE基因的表达，为进一步研究ICE基因在肾脏组织细胞凋亡中的作用奠定了基础。
Identification of interleukin-1 βconverting enzyme gene expression in human kidney Liao Hongjun, Chen Xiangmei, Ye Yizhou, et al. Department of Nephrology, General Hospital of PLA, Beijing 100853
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【Abstract】 Objective To confirm that Interleukin-1 β-converting enzyme(ICE) is a first identified apoptosis related gene in mammals. Methods The expressions of ICE mRNA in human kidney tissue, different segment of nephron and glomerular resident cells were measured by using the methods of microdissection, reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Northern hybridization.Results Compared with peripheral blood mononuclear lymphocyte weak expressions of ICE mRNA were noted not only in glomeruli and tubule but also in glomerular mesangial cells, glomerular endothelial cells and tubular epithelial cells of the human kidney.Conclusion There is a widely distributed expression of ICE mRNA in the human kidney, which may provide a theoretical basis for the study of ICE gene in apoptosis of kidney.
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【Key words】 Interleukin-1 Gene expression Kidney
(Natl Med J China 1998,78:218-221)
1992年，Gerretti等[1，2]首先克隆出人和鼠类白细胞介素-1β转化酶(Interlueukin-1β-converting enzyme ICE)cDNA，并证实ICE是IL-1β前体转化成有生物活性、成熟IL-1β过程中必需的酶，IL-1是一种重要的炎症因子，因此，ICE基因在炎症反应中起着重要作用[3]。Yuan等[4]发现ICE cDNA与线虫ced-3自杀基因具有高度的同源性，并证实ICE是哺乳动物细胞凋亡相关基因，现已证明ICE可以介导多种细胞发生凋亡。IL-1β是肾小球肾炎发病机制中的一个重要炎症因子，并且可以由肾小球系膜细胞分泌[5]，迄今为止，脏器组织细胞是否有ICE基因表达仍未见报道，特别是Chaplin等[2]用肾脏组织总RNA进行Northern杂交未检测到肾组织ice基因的表达。我们通过提取正常人肾组织总RNA和分离mRNA，以及利用肾单位微分离技术和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Northern杂交方法，从器官、亚器官和细胞水平对正常成人肾脏组织的ICE mRNA表达进行了检测，以进一步探讨ICE基因在肾脏组织细胞凋亡中的作用。
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材料与方法
一、正常成人肾脏组织的获取及肾单位的微分离
正常成人肾脏组织取自配型不合的移植供肾。切取肾皮质约0.5 g，一步法(TRIzol Reagent，GIBCO BRL)提取总RNA。进一步用OligodT亲和法分离mRNA。肾小球、肾小管的微分离技术是按照文献[6]的方法进行，用含有1 mg/ml V型胶原酶和1 mg/ml BSA的灌注液(135 mmol/L Nacl、1 mmol/L Na2SO4、12 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L葡萄糖)由肾动脉灌洗肾脏后，切取含有皮质-髓质-乳头的薄片组织，厚约2 mm，在纯氧通气条件下，用上述灌洗液37℃消化15分钟，在解剖显微镜下分离肾单位，在皮质可分离出肾小球和近曲小管S1段。用0.4%台酚蓝染色液鉴定细胞活性。
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二、肾脏的肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞分离和培养
按本室方法[5，7]。取正常人静脉血20 ml，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核白细胞，收集1×106细胞数，用一步法提取总RNA，由于白细胞ICE基因呈丰富表达，因此本研究用外周血单个白细胞作为阳性对照。
三、逆转录PCR
一步法提取RNA，紫外分光光度计定量及电泳确定RNA质量，取10 μg总RNA按逆转录试剂盒说明进行逆转录。微分离肾小球和近曲肾小管S1段逆转录：用细玻璃管吸取0.4%台酚蓝拒染的5个肾小球或2 mm长肾小管，转入含有10 μl的收集液(1.2 μ/μl RNAsin、5 mmol/L DTT的灌洗液)eppendorf管内，10 000 r/min，4℃离心，弃上清，加入10 μl细胞液(2% Triton-X 100、5 mmol/L DTT及1.2 U/μl RNAsin)。然后按逆转录试剂盒说明进行逆转录。ICE基因的PCR引物是参照文献[1]合成，正义5′-CAgAgATTTATCCAATAATg-3′(446-465)；反义：5′TCAAATgAAAATCgAACCT-3(1129-1111)，经PCR扩增后目的片段长度为684 bp。PCR设计用ICE mRNA 表达丰富的外周血单个核细胞作为阳性对照，用未经逆转录的RNA作阴性对照；用GAPDH作内参照。取5 μl逆转录反应液，PCR反应体积为30 μl，按美国Promega公司试剂盒说明进行PCR，加酶之前在PTC-100型PCR仪上75℃预热3分钟，反应条件为94℃30秒，60℃30秒、72℃90秒，反应30循环后72℃延伸3分钟。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪观察结果。计算PCR产物荧光强度峰值，以及ICE cDNA与GAPDH cDNA的峰值比(ICEp/GAPDHp)作为ICE基因的相对表达强度。
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四、Southern杂交
取RT-PCR产物10 μl用1%琼脂糖凝胶电泳，碱变性后用10×SSC转膜15小时。用CL-1 000 ultraviolet crosslinker核酸固定仪紫外线照射4分钟，强度为400 μJ/cm2。含有全长ICE cDNA的质粒由美国Gerretti博士馈赠，质粒的扩增、提取、酶切及探针的纯化是按分子克隆方法进行。探针长为1.325 kb，用随机引物试剂盒(美国Stratagene公司)标记α32PdCTP(美国Dupont公司)。65℃洗膜15分钟1次，在-70℃放射线自显影24小时。
五、Nothern杂交
取10～40 μg肾脏总RNA和2 μg mRNA，65℃水浴15分钟变性后在1%琼脂糖凝胶电泳，20×SSC转膜15小时，紫外线固定4分钟。ICE探针标记、杂交及洗膜方法同Southern杂交，放射线自显影96小时。选用人GAPDH PCR产物，长度为620 bp，经Geneclean后作为看家基因进行Nothern杂交。用凝胶图象分析系统观察结果，计算ICE与GAPDH峰值信号光密度比(ICEp/GAPDHp)作为ICE基因的相对表达强度。
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结果
一、ICE基因的RT-PCR检测结果
人的肾小球、肾小管、肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞的RNA经逆转录后，PCR产物电泳，均可见到约680 bp的特异性电泳条带(图1)，内参照GAPDH的PCR产物电泳，均可见均匀一致、长约620 bp的特异性电泳条带(图1)，RNA产物不经逆转录，直接进行PCR，电泳均未见特异性扩增产物。
1.1 kb ladder Marker；2.外周血单个核白细胞；3.肾小球；4.肾小管；5.肾小球系膜细胞；6.肾小球内皮细 胞；7.肾小管上皮细胞
图1 肾脏细胞和肾单位
ICE和GAPDH基因RT-PCR电泳结果
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在细胞RT-PCR，外周血单个核白细胞ICE mRNA相对表达强度为最高0.805。在RT-PCR起始总RNA量相同的情况下，外周血单个核白细胞ICE mRNA相对表达强度为肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞的1.3～1.8倍。肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞的ICE mRNA相对表达强度分别为0.467、0.458和0.622，以肾小管上皮细胞较高，肾小管上皮细胞ICE mRNA的相对表达强度为肾小球系膜细胞和肾小球内皮细胞的1.3～1.4倍。肾单位微分离的5个肾小球和2 mm肾小管ICE mRNA相对表达强度分别为0.326和0.392(表1)。
表1 肾单位和肾脏细胞
ICE mRNA RT-PCR结果(光密度值) 分类
ICE
峰值
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GAPDH
峰值
ICEP/GAPDHP
比值
外周血白细胞
191.5
237.7
0.805
肾脏细胞
系膜细胞
108.8
233.3
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0.467
内皮细胞
105.7
230.5
0.458
小管上皮细胞
142.8
229.4
0.622
肾单位
肾小球
75.3
230.5
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0.326
肾小管
90.7
230.9
0.392
二、RT-PCR产物Southern杂交
外周血单个核白细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的杂交鉴定，均出现了特异性的杂交条带(图2)。未见ICE杂交特异性信号，作为阴性对照。表明ICE PCR产物为特异性ICE cDNA。
1.阴性对照(1 kb ladder Marker)；2：外周血单个核白细胞；
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3.肾小球系膜细胞；4.肾小球上皮细胞
图2 ICE基因RT-PCR产物Southern杂交结果
三、肾脏组织ICE基因Northern杂交
肾脏mRNA和总RNA经Northern杂交放射性自显影96小时均出现ICE mRNA杂交特异性信号，ICE mRNA信号较强，但mRNA和总RNA检测ice基因相对表达强度(ICEp/GAPDHp)分别为0.72和0.61～0.70，说明无论是提取肾脏总RNA还是mRNA，其ICE基因表达强度是一致的。随着总RNA上样量的减少，ICE mRNA特异性杂交信号逐渐减弱，总RNA为10 μg时，ICE mRNA的杂交信号非常微弱(图3，表2)。
1.2μg mRNA；2～5.总RNA，分别为40、30、20、10μg
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图3 肾组织mRNA和总RNA基因(上)和GAPDH基因
(下)Northern杂交结果
表2 肾脏组织ICE基因Northern杂交结果(光密度值) 分类
mRNA
(2 μg)
总RNA(μg)
40
30
20
10
ICE峰值
, http://www.100md.com 339
150
76
51
30
GAPDH峰值
471
214
111
75
50
ICEp/GAPDH比值
0.72
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0.70
0.68
0.69
0.61
讨论
1992年克隆的ICE基因属于胱氨酸蛋白酶家族成员，可以激活IL-1 β前体使之变为成熟的IL-1 β[1]，因此ICE基因在炎症反应中起着十分重要的作用。在ICE基因缺陷的小鼠，其体内IL-1β和IL-6的产生受到明显抑制[3]，并且这种小鼠可以抵抗注射脂多糖引起的细菌内毒素性休克。Yuan等[4]报道了鼠类ICE与ced-3(线虫细胞凋亡基因)同源性达28%，并且具有相同的功能，因而使ICE成为第一个被发现的、也是最重要的哺乳类动物细胞凋亡基因。现已证实ICE基因在神经和肿瘤等多种组织的细胞凋亡中起重要作用。通过ICE基因调节表达可以减轻缺血再灌注神经元损伤和抑制脑肿瘤细胞的生长[8，9]。抑制或调节ICE基因的功能已成为减轻组织损伤和抑制肿瘤生长的潜在治疗途径。Gerretti等[1，2]克隆了鼠类ICE cDNA，并观察了ICE mRNA组织分布，结果发现广泛地分布于正常小鼠脾、心、脑、肾上腺和肝脏，其中在脾脏表达最为丰富，然而，用Northern杂交方法未见到肾脏组织ICE基因表达。并且，到目前为止，未见到研究人类肾脏ICE基因表达的文献。
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文献证实[5]，肾小球系膜细胞可以表达和分泌IL-1β，IL-1β是肾小球肾炎系膜增殖和硬化的最重要的炎症介质之一。此外，肾脏疾病中细胞凋亡的参与已得到公认，我们的前期实验已证实缺血再灌注肾损伤中肾小管上皮细胞凋亡所起的重要作用[7]，鉴于ICE基因在炎症和细胞凋亡中的重要作用，确认ICE基因在人肾组织和细胞中是否表达具有重要的理论价值。我们通过增加总RNA上样量至40 μg以及提取肾脏mRNA进行Northern杂交证实了肾组织中ICE mRNA的表达，从而比较系统地确认了肾脏有ICE基因的表达。与外周血单个核白细胞相比，肾脏ICE基因的表达较弱。我们用mRNA进行Northern杂交提高了检测的敏感性，使用肾单位微分离和肾脏固有细胞分离和培养技术不仅排除了血细胞中ICE基因对检测的干扰而且可以对肾脏ICE基因的表达进行微定位，实验结果全面、可靠。
本课题为国家自然基金资助项目
参考文献
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(收稿：1997-09-05 修回：1997-12-02), http://www.100md.com