周期蛋白依赖激酶抑制因子p21WAF1/CIP1在银屑病表皮中高表达
作者：张晓艳 马圣清 柳惠图
单位：100034 北京医科大学第一临床学院皮肤科[张晓燕(现在北京中日友好医院皮肤科，100029) 马圣清]；北京师范大学生物系(柳惠图)
关键词：银屑病；p21WAF1/CIP1
中华皮肤科杂志980607 【摘要】 目的 探讨p21WAF1/CIP1与银屑病发病的关系。方法 通过核酸杂交和免疫组织化学的方法检测了12例斑块型银屑病和5例正常人表皮中p21WAF1/CIP1的表达。结果 银屑病表皮中p21WAF1/CIP1的表达位于表皮全层，较正常表皮明显增强，正常人表皮中其表达位于表皮上部。结论 p21WAF1/CIP1可能与正常表皮细胞的分化关系更密切，在银屑病表皮细胞的异常分化调节中可能发挥作用。
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Overexpression of p21WAF1/CIP1——Inhibitor of CyclinDependent Kinase in Psoriatic Epidermis Zhang Xiaoyan, Ma Shengqing, Liu Huitu. Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing Medical University, 100034
【Abstract】 Objective To observe the relationship between p21WAF1/CIP1 and development of psoriasis. Methods The expression of p21WAF1/CIP1 in twelve psoriatic and five normal epidermis was studied by dot hybridization, in situ hybridization and immunohistochemistry. Results In psoriatic epidermis, the expression of p21WAF1/CIP1 was in whole layers of epidermis, and was significantly increased compared with that of normal skin. In normal epidermis, its expression was in upper layer of epidermis. Conclusion These results indicate that p21WAF1/CIP1 might be associated with differentiation of normal keratinocytes and might play a role in abnormal differentiation of psoriatic keratonocytes.
, 百拇医药
【Key words】 Psoriasis p21WAF1/CIP1
生化与遗传学研究表明，周期蛋白和周期蛋白依赖激酶相互作用，在细胞周期的G1/S转变中起重要的推动作用[1]。p21WAF1/CIP1是一种核蛋白，因可通过抑制周期蛋白依赖激酶的功能对细胞周期的正常运行起重要的阻抑作用[2]。细胞周期加速是银屑病病理生理学的重要特征，银屑病表皮细胞的过度增殖与细胞周期加速密切相关[3]， 但是p21WAF1/CIP1与银屑病发病的关系目前尚不清楚，我们运用特异性的核酸分子杂交和免疫组化的方法观察了12例银屑病患者和5例正常人表皮中p21WAF1/CIP1基因与蛋白的表达，以探讨p21WAF1/CIP1与银屑病发病的关系，为研究银屑病的病因和发病机制提供实验依据。
材料与方法
(一)材料:
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1.标本：斑块型银屑病12例， 取材前3个月均未用过免疫抑制剂和皮质类固醇制剂，正常人对照5例。取材后，用OCT包埋，液氮中速冻，冰冻切片或-80℃保存备用。
2.试剂：质粒PXJ41p21WAF1/CIP1、PcDNA3分别由北京师范大学生物系和北京医科大学生化系惠赠，RNA提取试剂、α-32P-dCTP、随机引物标记试剂盒、地高辛RNA标记与检测试剂分别购于Gibco、亚辉、Promega和Boehringer Mannhein公司；免疫组化试剂盒、p21WAF1/CIP1多抗分别为Zymed、Santa Cruz公司产品。
(二)方法:
1.点杂交：按Trizal试剂盒(Gibco公司生产的一种快速提取RNA试剂)说明提取表皮组织RNA，点样于多孔过滤加样器中，抽滤后取出膜于室温晾干，80℃烤膜2小时，42℃水浴预杂交过夜，cDNA探针的标记按试剂盒说明进行，变性后置预杂交袋中，42℃杂交24小时，洗膜、压片，-70℃曝光3～7天，常规显影、定影。
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2.原位杂交：
(1)RNA探针的制备：以KpnⅠ从质粒PXJ41p21WAF1/CIP1上切下目的基因p21WAF1/CIP1，并切开质粒PcDNA3，使二者在DNA连接酶作用下进行基因重组，构建载体PcDNA3p21WAF1/CIP1，线性化后合成地高辛标记的RNA探针。
(2)非同位素原位杂交：载玻片经防RNase处理后，涂布多聚L赖氨酸，冰冻切片干燥后以4%多聚甲醛固定30分钟，0.2N HCl酸化，0.3% Triton X-100处理各15分钟， 以上各步骤之间均以 0.1mol/L DE PC-PBS洗2次。0.1mol/L三乙醇胺+0.25%醋酐乙酰化15分钟，42℃杂交16小时，1%阻滞剂封闭半小时，抗地高辛抗体1∶500稀释，42℃孵育过夜，NBT、BCIP显色，脱水、封片。
3.免疫组织化学：冰冻切片干燥，0.3% H2O2、10%正常羊血清各孵育15分钟，加一抗(1∶100稀释)，4℃过夜，加二抗及三抗分别于37℃孵育10分钟，以上各步骤之间均以PBS洗2次。DAB显色，自来水洗，复染、封片。
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4.统计学处理：对点杂交图象进行灰度扫描，结果采用t检验。
结 果
1.提取表皮组织的核酸， 采用同位素标记的 cDNA探针进行点杂交，结果发现，12例银屑病皮损表皮中p21WAF1/CIP1的mRNA水平均明显高于正常人表皮(灰度扫描结果均值为银屑病表皮9.0，正常表皮4.1，P< 0.01)。
2.经酶切电泳鉴定证实本文构建了载体PcDNA3-p21WAF1/CIP1(图1)，以此为模板通过体外转录的方法合成了地高辛标记的RNA探针。
1.p21WAF1/CIP1cDNA 2.PcDNA3/KnpI 3.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/KpnI
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4.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/XhoI 5.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/BamHⅠ
6.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/HindⅢ 7.λDNA/HindⅢ
图1 PcDNA3-p21WAF1/CIP1质粒的酶切电泳鉴定
3.采用地高辛标记的RNA探针进行原位杂交，检测p21WAF1/CIP1基因的表达。结果显示：银屑病表皮中，p21WAF1/CIP1的表达分布于表皮全层，较正常表皮的表达明显增强，正常人表皮中，其表达主要分布于表皮上部。(图2a、b)
, http://www.100md.com 图2 PcDNA3-p21WAF1/CIP1基因的表达
4.免疫组化结果：银屑病表皮中p21WAF1/CIP1的表达分布于表皮全层，并较正常人表皮的表达增强[图3(a)]；正常人表皮中其表达以表皮上部较明显[图3(b)]。
图3 PcDNA3-p21WAF1/CIP1蛋白的免疫组化研究
讨 论
初发现p21WAF1/CIP1时，因其可通过抑制周期蛋白依赖激酶的功能阻抑细胞周期的正常运行而被称为周期蛋白依赖激酶抑制因子[4]。近年来逐渐增多的报道证实p21WAF1/CIP1也具有调节细胞分化的作用。例如，维A酸或维生素D3诱导白血病细胞分化的同时也诱导p21WAF1/CIP1的表达升高[5，6]，表明p21WAF1/CIP1也与细胞分化密切相关。因此p21WAF1/CIP1并非只是单纯地对细胞周期的运行起负调节作用，本文的研究结果也证实了这一点。
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本研究首先通过基因重组构建了载体PcDNA-p21WAF1/CIP1，即能通过该载体进行体外转录合成RNA探针，检测p21WAF1/CIP1在表皮组织中的表达与分布；同时又可利用其转染真核细胞，为深入研究p21WAF1/CIP1在表皮增殖调控中的作用提供了有效的工具。RNA探针虽然制备起来比较复杂，需要较高的分子生物学技术，但是含RNA的杂交子较稳定，杂交过程中可耐受高严格条件下的洗涤，而且杂交后可用弱RNA酶去除多余的探针，所以利用RNA探针进行原位杂交，背景低、特异性强、敏感性高，而且可以定位。我们通过原位杂交及免疫组化研究发现，与正常表皮相比，银屑病皮损中p21WAF1/CIP1基因与蛋白的表达明显升高；正常表皮中，p21WAF1/CIP1的表达主要位于表皮上部，基底层有很少或几乎检测不到p21WAF1/CIP1的表达。点杂交结果同原位杂交结果一致。p21WAF1/CIP1在银屑病及正常人表皮中的表达近年来国外已有文献报道[6]，虽然所采用的方法同本文不一致，但实验结果与我们的相同。
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正常表皮中，p21WAF1/CIP1在基底层的表达基本是阴性，而基底层角朊细胞有丝分裂旺盛，基底层上部的角朊细胞则已基本脱离增殖周期并进入不同的分化阶段，表明p21WAF1/CIP1与角朊细胞的分化关系更密切。银屑病表皮细胞过度增殖、并伴有分化异常，p21WAF1/CIP1的表达却明显升高，表明：在该病理过程中，p21WAF1/CIP1未发挥对细胞增殖的阻抑作用，有可能参与了表皮细胞异常分化状态的调节或者是伴随表皮增殖后的一种非特异性改变。Healy[7]将SDS等细胞增殖刺激剂应用于志愿者的皮肤后发现，与正常未受试表皮相比，SDS刺激后引起表皮细胞过度增殖，同时也导致p21WAF1/CIP1基因与蛋白的表达明显升高。由此可见，银屑病表皮中p21WAF1/CIP1高表达不是特异性的，可能是伴随银屑病角朊细胞过度增殖后的一种继发性改变；但又有研究报道[8]，用SDS等刺激正常人皮肤后4小时，受试表皮也出现p21WAF1/CIP1的高表达，而4小时还未能引起表皮细胞的增殖，这说明p21WAF1/CIP1的高表达并非是表皮细胞高度增殖状态的一种简单的伴随，可能与表皮细胞的分化关系密切。
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以上分析表明：正常表皮中，p21WAF1/CIP1可能与细胞分化有关；银屑病表皮中p21WAF1/CIP1可能参与了角朊细胞异常分化状态的调节，即参与了银屑病的发病，至于p21WAF1/CIP1如何调节表皮细胞的分化还有待于进一步的研究证实。
国家自然科学基金资助项目(39388002， 39200024)
参考文献
1 Harper JW, Adami GR, Wei N, et al. The p21 cdk-interacting protein cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 1993,75∶ 805-816.
2 Xiong Y, Hannon GJ, Zhang H, et al. p21WAF1/CIP1 is an universal inhibitor of cyclin dependent kinases. Nature, 1993,366∶70.
, http://www.100md.com
3 Weinstein GD, McCullough JL, Ross PA. Cell kinetic basis for pathophysiology of psoriasis. J Invest Dermatol, 1985,85∶579-583.
4 Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer Ⅱ: cyclin D and CDK inhibitor come of age. Cell, 1994,79∶573.
5 Steinman RA, Hoffman B, Iro A, et al. Induction of p21 during differentiation. Oncogene, 1994,9∶3389.
6 Jiang H, Lin J, Su ZZ, et al. Induction of differentiation in human promyelocytic HL-60 leukemia cells activates p21WAF1/CIP1. Oncogene,1994,9∶3387.
, 百拇医药
7 Healy E, Smith MD， et al. Up-regulation of p21WAF1/CIP1 in psoriasis and after the application of irritants and tape stripping. J Invest Dermatol,1995,105∶274.
8 Rijzewijk JJ, Boezeman JBM， Bauer FW. Synchronized growth in human epidermis following tape-stripping: its implication for cell kinetic studies. Cell, 1988,21∶227-229.
(收稿：1997-09-23 修回：1998-02-16), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一临床学院皮肤科[张晓燕(现在北京中日友好医院皮肤科，100029) 马圣清]；北京师范大学生物系(柳惠图)
关键词：银屑病；p21WAF1/CIP1
中华皮肤科杂志980607 【摘要】 目的 探讨p21WAF1/CIP1与银屑病发病的关系。方法 通过核酸杂交和免疫组织化学的方法检测了12例斑块型银屑病和5例正常人表皮中p21WAF1/CIP1的表达。结果 银屑病表皮中p21WAF1/CIP1的表达位于表皮全层，较正常表皮明显增强，正常人表皮中其表达位于表皮上部。结论 p21WAF1/CIP1可能与正常表皮细胞的分化关系更密切，在银屑病表皮细胞的异常分化调节中可能发挥作用。
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Overexpression of p21WAF1/CIP1——Inhibitor of CyclinDependent Kinase in Psoriatic Epidermis Zhang Xiaoyan, Ma Shengqing, Liu Huitu. Department of Dermatology, The First Hospital of Beijing Medical University, 100034
【Abstract】 Objective To observe the relationship between p21WAF1/CIP1 and development of psoriasis. Methods The expression of p21WAF1/CIP1 in twelve psoriatic and five normal epidermis was studied by dot hybridization, in situ hybridization and immunohistochemistry. Results In psoriatic epidermis, the expression of p21WAF1/CIP1 was in whole layers of epidermis, and was significantly increased compared with that of normal skin. In normal epidermis, its expression was in upper layer of epidermis. Conclusion These results indicate that p21WAF1/CIP1 might be associated with differentiation of normal keratinocytes and might play a role in abnormal differentiation of psoriatic keratonocytes.
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【Key words】 Psoriasis p21WAF1/CIP1
生化与遗传学研究表明，周期蛋白和周期蛋白依赖激酶相互作用，在细胞周期的G1/S转变中起重要的推动作用[1]。p21WAF1/CIP1是一种核蛋白，因可通过抑制周期蛋白依赖激酶的功能对细胞周期的正常运行起重要的阻抑作用[2]。细胞周期加速是银屑病病理生理学的重要特征，银屑病表皮细胞的过度增殖与细胞周期加速密切相关[3]， 但是p21WAF1/CIP1与银屑病发病的关系目前尚不清楚，我们运用特异性的核酸分子杂交和免疫组化的方法观察了12例银屑病患者和5例正常人表皮中p21WAF1/CIP1基因与蛋白的表达，以探讨p21WAF1/CIP1与银屑病发病的关系，为研究银屑病的病因和发病机制提供实验依据。
材料与方法
(一)材料:
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1.标本：斑块型银屑病12例， 取材前3个月均未用过免疫抑制剂和皮质类固醇制剂，正常人对照5例。取材后，用OCT包埋，液氮中速冻，冰冻切片或-80℃保存备用。
2.试剂：质粒PXJ41p21WAF1/CIP1、PcDNA3分别由北京师范大学生物系和北京医科大学生化系惠赠，RNA提取试剂、α-32P-dCTP、随机引物标记试剂盒、地高辛RNA标记与检测试剂分别购于Gibco、亚辉、Promega和Boehringer Mannhein公司；免疫组化试剂盒、p21WAF1/CIP1多抗分别为Zymed、Santa Cruz公司产品。
(二)方法:
1.点杂交：按Trizal试剂盒(Gibco公司生产的一种快速提取RNA试剂)说明提取表皮组织RNA，点样于多孔过滤加样器中，抽滤后取出膜于室温晾干，80℃烤膜2小时，42℃水浴预杂交过夜，cDNA探针的标记按试剂盒说明进行，变性后置预杂交袋中，42℃杂交24小时，洗膜、压片，-70℃曝光3～7天，常规显影、定影。
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2.原位杂交：
(1)RNA探针的制备：以KpnⅠ从质粒PXJ41p21WAF1/CIP1上切下目的基因p21WAF1/CIP1，并切开质粒PcDNA3，使二者在DNA连接酶作用下进行基因重组，构建载体PcDNA3p21WAF1/CIP1，线性化后合成地高辛标记的RNA探针。
(2)非同位素原位杂交：载玻片经防RNase处理后，涂布多聚L赖氨酸，冰冻切片干燥后以4%多聚甲醛固定30分钟，0.2N HCl酸化，0.3% Triton X-100处理各15分钟， 以上各步骤之间均以 0.1mol/L DE PC-PBS洗2次。0.1mol/L三乙醇胺+0.25%醋酐乙酰化15分钟，42℃杂交16小时，1%阻滞剂封闭半小时，抗地高辛抗体1∶500稀释，42℃孵育过夜，NBT、BCIP显色，脱水、封片。
3.免疫组织化学：冰冻切片干燥，0.3% H2O2、10%正常羊血清各孵育15分钟，加一抗(1∶100稀释)，4℃过夜，加二抗及三抗分别于37℃孵育10分钟，以上各步骤之间均以PBS洗2次。DAB显色，自来水洗，复染、封片。
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4.统计学处理：对点杂交图象进行灰度扫描，结果采用t检验。
结 果
1.提取表皮组织的核酸， 采用同位素标记的 cDNA探针进行点杂交，结果发现，12例银屑病皮损表皮中p21WAF1/CIP1的mRNA水平均明显高于正常人表皮(灰度扫描结果均值为银屑病表皮9.0，正常表皮4.1，P< 0.01)。
2.经酶切电泳鉴定证实本文构建了载体PcDNA3-p21WAF1/CIP1(图1)，以此为模板通过体外转录的方法合成了地高辛标记的RNA探针。
1.p21WAF1/CIP1cDNA 2.PcDNA3/KnpI 3.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/KpnI
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4.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/XhoI 5.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/BamHⅠ
6.PcDNA3-p21WAF1/CIP1/HindⅢ 7.λDNA/HindⅢ
图1 PcDNA3-p21WAF1/CIP1质粒的酶切电泳鉴定
3.采用地高辛标记的RNA探针进行原位杂交，检测p21WAF1/CIP1基因的表达。结果显示：银屑病表皮中，p21WAF1/CIP1的表达分布于表皮全层，较正常表皮的表达明显增强，正常人表皮中，其表达主要分布于表皮上部。(图2a、b)
, http://www.100md.com 图2 PcDNA3-p21WAF1/CIP1基因的表达
4.免疫组化结果：银屑病表皮中p21WAF1/CIP1的表达分布于表皮全层，并较正常人表皮的表达增强[图3(a)]；正常人表皮中其表达以表皮上部较明显[图3(b)]。
图3 PcDNA3-p21WAF1/CIP1蛋白的免疫组化研究
讨 论
初发现p21WAF1/CIP1时，因其可通过抑制周期蛋白依赖激酶的功能阻抑细胞周期的正常运行而被称为周期蛋白依赖激酶抑制因子[4]。近年来逐渐增多的报道证实p21WAF1/CIP1也具有调节细胞分化的作用。例如，维A酸或维生素D3诱导白血病细胞分化的同时也诱导p21WAF1/CIP1的表达升高[5，6]，表明p21WAF1/CIP1也与细胞分化密切相关。因此p21WAF1/CIP1并非只是单纯地对细胞周期的运行起负调节作用，本文的研究结果也证实了这一点。
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本研究首先通过基因重组构建了载体PcDNA-p21WAF1/CIP1，即能通过该载体进行体外转录合成RNA探针，检测p21WAF1/CIP1在表皮组织中的表达与分布；同时又可利用其转染真核细胞，为深入研究p21WAF1/CIP1在表皮增殖调控中的作用提供了有效的工具。RNA探针虽然制备起来比较复杂，需要较高的分子生物学技术，但是含RNA的杂交子较稳定，杂交过程中可耐受高严格条件下的洗涤，而且杂交后可用弱RNA酶去除多余的探针，所以利用RNA探针进行原位杂交，背景低、特异性强、敏感性高，而且可以定位。我们通过原位杂交及免疫组化研究发现，与正常表皮相比，银屑病皮损中p21WAF1/CIP1基因与蛋白的表达明显升高；正常表皮中，p21WAF1/CIP1的表达主要位于表皮上部，基底层有很少或几乎检测不到p21WAF1/CIP1的表达。点杂交结果同原位杂交结果一致。p21WAF1/CIP1在银屑病及正常人表皮中的表达近年来国外已有文献报道[6]，虽然所采用的方法同本文不一致，但实验结果与我们的相同。
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正常表皮中，p21WAF1/CIP1在基底层的表达基本是阴性，而基底层角朊细胞有丝分裂旺盛，基底层上部的角朊细胞则已基本脱离增殖周期并进入不同的分化阶段，表明p21WAF1/CIP1与角朊细胞的分化关系更密切。银屑病表皮细胞过度增殖、并伴有分化异常，p21WAF1/CIP1的表达却明显升高，表明：在该病理过程中，p21WAF1/CIP1未发挥对细胞增殖的阻抑作用，有可能参与了表皮细胞异常分化状态的调节或者是伴随表皮增殖后的一种非特异性改变。Healy[7]将SDS等细胞增殖刺激剂应用于志愿者的皮肤后发现，与正常未受试表皮相比，SDS刺激后引起表皮细胞过度增殖，同时也导致p21WAF1/CIP1基因与蛋白的表达明显升高。由此可见，银屑病表皮中p21WAF1/CIP1高表达不是特异性的，可能是伴随银屑病角朊细胞过度增殖后的一种继发性改变；但又有研究报道[8]，用SDS等刺激正常人皮肤后4小时，受试表皮也出现p21WAF1/CIP1的高表达，而4小时还未能引起表皮细胞的增殖，这说明p21WAF1/CIP1的高表达并非是表皮细胞高度增殖状态的一种简单的伴随，可能与表皮细胞的分化关系密切。
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以上分析表明：正常表皮中，p21WAF1/CIP1可能与细胞分化有关；银屑病表皮中p21WAF1/CIP1可能参与了角朊细胞异常分化状态的调节，即参与了银屑病的发病，至于p21WAF1/CIP1如何调节表皮细胞的分化还有待于进一步的研究证实。
国家自然科学基金资助项目(39388002， 39200024)
参考文献
1 Harper JW, Adami GR, Wei N, et al. The p21 cdk-interacting protein cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell, 1993,75∶ 805-816.
2 Xiong Y, Hannon GJ, Zhang H, et al. p21WAF1/CIP1 is an universal inhibitor of cyclin dependent kinases. Nature, 1993,366∶70.
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3 Weinstein GD, McCullough JL, Ross PA. Cell kinetic basis for pathophysiology of psoriasis. J Invest Dermatol, 1985,85∶579-583.
4 Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer Ⅱ: cyclin D and CDK inhibitor come of age. Cell, 1994,79∶573.
5 Steinman RA, Hoffman B, Iro A, et al. Induction of p21 during differentiation. Oncogene, 1994,9∶3389.
6 Jiang H, Lin J, Su ZZ, et al. Induction of differentiation in human promyelocytic HL-60 leukemia cells activates p21WAF1/CIP1. Oncogene,1994,9∶3387.
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7 Healy E, Smith MD， et al. Up-regulation of p21WAF1/CIP1 in psoriasis and after the application of irritants and tape stripping. J Invest Dermatol,1995,105∶274.
8 Rijzewijk JJ, Boezeman JBM， Bauer FW. Synchronized growth in human epidermis following tape-stripping: its implication for cell kinetic studies. Cell, 1988,21∶227-229.
(收稿：1997-09-23 修回：1998-02-16), 百拇医药