米诺地尔对培养鼠触须毛囊生长的影响
作者：傅琳玲 朱文元 范卫新
单位：210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科[傅琳玲(现在南通医学院附属医院皮肤科) 朱文元(导师) 范卫新]
关键词：米诺地尔；毛发；组织培养
中华皮肤科杂志980610 【摘要】 目的 体内米诺地尔临床应用引起多毛，局部外用治疗秃发有效。方法 采用C57BL/6J近交系乳鼠触须毛囊培养、毛囊显微形态观察及3H-TdR同位素标记掺入等技术，研究在体外不同浓度米诺地尔在不同培养时间条件下对毛囊生长的影响。结果 米诺地尔浓度70μg/ml，培养24小时，毛囊生长较快。毛囊形态学改变示毛乳头松散，毛球部扩大，毛母质细胞增生活跃。培养48小时，毛囊生长明显减慢。培养30小时，3H-TdR摄入率明显增高。结论 米诺地尔对体外培养鼠触须毛囊有直接促生长作用，且与米诺地尔浓度及培养时间有一定关系。
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Study on the Effect of Minoxidil on Mouse Vibrissae Follicles in Vitro Fu Linling, Zhu Wenyuan, Fan Weixin. Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To study the effect of minoxidil on the growth of hair follicles. Methods Organ culture of newborn mouse vibrissa follicles in vitro, incorportating of 3H-TdR radioactive thymidine into the cultured follicles and the histopathologic features of the follicles. Results When the follicles were cultured in 70μg/ml of minoxidil for 24h, the follicles had a significant increase in length, the hair dermal papilla loosened, the follicle bulb enlarged, and the matrix cells grew actively. When cultured for 48h, the rate of increase of the length of the follicles reduced. When cultured for 30h, there was a significant increase of 3H-TdR incorporating. Conclusion The results indicate that minoxidil promotes the growth of hair follicles, and is related to its concentration and the duration of culture of the follicles.
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【Key words】 Minoxidil Hair Tissue culture
米诺地尔外用于男性秃发患者，能使秃发区毛发生长，并能增加毛发直径。米诺地尔对毛囊的作用机理有多种学说，但具体作用机理尚不清楚。毛囊生长具有周期性，为了排除体内复杂因素对毛素生长的影响，最好用体外游离毛囊培养。我们用1640无血清培养基培养鼠触须游离毛囊[1]，发现米诺地尔对培养毛囊有促生长作用，研究结果支持米诺地尔促进毛发生长可能是通过直接刺激毛囊的作用。
材料和方法
1.动物来源：C57BL/6J近交系乳鼠由南京医科大学动物研究中心提供。
2.试剂：1640培养基、米诺地尔、Herps液均购于上海华美生物工程公司。3H-胸腺嘧啶购于上海原子能研究所。毛囊培养基由1640培养液加胰岛素5μg/ml、氢化可的松0.4μg/ml、青霉素500U/ml、链霉素500μg/ml、Herps 20mmol/L构成。
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3.实验方法：取毛囊：40只出生1周的近交系C57BL/6J乳鼠，剪去双侧胡须，75%酒精消毒上唇部，无菌条件下剪下双侧胡须垫，置于无菌D-Hanks液中，解剖显微镜下从皮下组织中用微循环手术镊分离并轻取触须垫眼侧毛囊，每鼠触须垫约可取7～9只毛囊，每次实验约可取70个毛囊，选完整的生长期毛囊，用无菌1640培养液冲洗3遍。
常规培养：实验共分4组，第2、第3和第4组为米诺地尔观察组，加入米诺地尔浓度分别为70μg/ml、140μg/ml和280μg/ml，第1组为空白对照组，除不加米诺地尔外，其它培养条件一切与米诺地尔组相同。培养在24孔板中进行，每组6孔，每孔2个毛囊，含1640培养液0.75ml。37℃、5% CO2条件下孵育96小时。
加入3H-TdR培养：同上述分组，各组培养18小时后，加入3H-TdR 2μCi/ml，继续孵育12小时，取出毛囊，PBS冲洗3遍，约30分钟，置于闪烁杯中，每杯置5个毛囊，加入2%乙酸200μl，70℃水浴溶解毛囊，毛囊部全部溶解后加入二氧六环闪烁剂，每杯6ml。
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检测方法：1毛囊生长长度测定：在倒置显微镜中装入目镜测微仪，每24小时测毛囊底部至毛干顶部毛囊长度。2形态观察：普通病理：逐日取毛囊置10%福尔马林液中固定，常规制片后观察。倒置显微镜下每日观察毛球部及其内部结构形态改变。3 3H-TdR摄入率测定。
4.统计学方法：生长长度用t及t′检验。
结 果
1.毛囊生长长度测定：所有毛囊均为第1个24小时生长最快，米诺地尔浓度为70μg/ml时，生长最好，平均生长0.31±0.005mm；浓度为140μg/ml时其次，为0.115±0.004mm；浓度为280μg/ml时，为0.085±0.004mm；空白对照组平均生长0.1±0.003mm。70μg/ml组与空白对照组比较有显著性差异(t′=19.302，P< 0.01)，140μg/ml和280μg/ml组与空白对照组比较均无显著性差异(t=1.618和t=1.683，P均 >0.05)。第2个24小时，生长明显减缓，以70μg/ml时，生长平均仅为0.08±0.004mm。第3个24小时，大部分毛囊靠壁，停止生长。第4个24小时，毛囊部分开始缩短。
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2.毛囊形态改变观察：病理改变：24小时：空白对照组和第2组均表现为毛母质部细胞增生活跃，处于增生状态细胞数量多，细胞核大，核质淡染；黑素细胞密集，毛母质部、毛干下部见均匀多量的细小黑素颗粒；毛乳头部见多量的梭形核细胞，无空泡细胞。48小时：空白对照组：毛母质部处于增生状态细胞数量明显减少，黑素细胞量减少，毛乳头部梭形核细胞明显减少，出现多量的空泡细胞。实验组：毛母质部细胞仍有多量处于增生状态的细胞，黑素细胞略有减少，毛乳头部梭形核细胞量减少，出现部分空泡细胞。72小时后，毛球部、毛根鞘部均出现多量的空泡细胞。黑素颗粒部分凝集成小块状。倒置显微镜观察毛囊形态改变：不管是实验组还是对照组，24小时，毛球部体积变大，毛乳头松散，毛母质细胞所在部稍膨大。48小时后，对照组毛球部渐缩小，毛乳头浓缩，毛母质部缩小，毛干上移。实验组第2组该变化过程慢于对照组。
3.同位素摄入率测定：米诺地尔70μg/ml组摄入率平均每杯为1327.08c/min，140μg/ml组为436.89c/min，280μg/ml浓度组为322.54c/min，空白对照组为287.79c/min，底色为78.39c/min。
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讨 论
米诺地尔对毛囊生长影响作用与其浓度有一定关系。Obana等[2]培养鼠毛囊内外毛根鞘细胞，发现70～140μg/ml浓度时，刺激毛囊上皮细胞的分裂增生。Buhl[3]培养游离鼠触须毛囊发现米诺地尔浓度为0.5～1.0mmol时促进毛囊生长，而浓度为5.0mmol时，抑制毛囊生长作用。我们发现70μg/ml浓度时，有明显促生长作用，而浓度为140μg/ml和280μg/ml时，其促生长作用不明显，米诺地尔对毛囊生长影响作用与其浓度间有一定关系，但其最佳浓度的发现尚需进一步探讨。
不同培养时间，米诺地尔对毛囊促生长作用程度不同。鼠毛囊体积小，操作时易破坏其完整性，且可能培养基中缺乏某种尚未认识到的因子，因此鼠触须毛囊体外培养存活时间较短[4]。本文选完整生长期毛囊培养，米诺地尔70μg/ml浓度时，24小时毛囊生长明显，毛母质细胞增生活跃，48小时毛囊生长明显减慢，与24小时生长长度有显著性差异，毛母质细胞增生活跃程度降低。72小时大部分毛囊停止生长，部分毛囊毛母质细胞、毛根鞘细胞出现坏死。与对照组相比，米诺地尔能促使毛囊保持正常形态，减少坏死，刺激毛母质细胞增生。且在培养24小时时，其促生长作用最为明显。同位素标记技术的应用使实验更为精确和深入。培养18小时后加入3H-TdR孵育12小时，测定毛囊同位素掺入率值，显示米诺地尔在培养毛囊30小时中，浓度70μg/ml时，毛囊同位素掺入率最高。这与毛囊长度测定和毛囊形态观察结果相一致。
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米诺地尔对毛囊促生长作用机理，有人认为与其扩张局部血管平滑肌而引起局部血流量增加有关。也有人认为钾离子通道得以开放有关[5]。本实验结果提示米诺地尔可能对毛囊上皮有直接促生长作用。
参考文献
1 Jindo T, Imai K, Takamori K, et al. Organ culture of mouse vibrissal hair follicles in serum-free medium. J Dermatol, 1993,20∶756-762.
2 Obana NT, Ito M. Effect of cepharanthine and minoxidil on proliferation, differentiation and keratinization of cultured cells from the murine hair apparatus. Arch Dermal Res, 1992,284∶290-296.
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3 Buhl AE, Waldon DJ, Kawake TT, et al. Minoxidil stimulates mouse vibrissae follicles in organ culture. J Invest Dermatol, 1989,92∶315-320.
4 Philpott MP, Green MR, Kealey A. Rat hair follicles growth in vitro. Br J Dermatol, 1992,127∶600-607.
5 Nakaya Y, Hamaoka H, Kato S, et al. Effect of minoxidil sulfate and pinacidil on single potassium channel current in cultured human outer root sheath cells and dermal papilla cells. J Dermatol Sci,1994,7∶s104-s108.
(收稿：1997-12-29 修回：1998-02-29), 百拇医药
单位：210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科[傅琳玲(现在南通医学院附属医院皮肤科) 朱文元(导师) 范卫新]
关键词：米诺地尔；毛发；组织培养
中华皮肤科杂志980610 【摘要】 目的 体内米诺地尔临床应用引起多毛，局部外用治疗秃发有效。方法 采用C57BL/6J近交系乳鼠触须毛囊培养、毛囊显微形态观察及3H-TdR同位素标记掺入等技术，研究在体外不同浓度米诺地尔在不同培养时间条件下对毛囊生长的影响。结果 米诺地尔浓度70μg/ml，培养24小时，毛囊生长较快。毛囊形态学改变示毛乳头松散，毛球部扩大，毛母质细胞增生活跃。培养48小时，毛囊生长明显减慢。培养30小时，3H-TdR摄入率明显增高。结论 米诺地尔对体外培养鼠触须毛囊有直接促生长作用，且与米诺地尔浓度及培养时间有一定关系。
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Study on the Effect of Minoxidil on Mouse Vibrissae Follicles in Vitro Fu Linling, Zhu Wenyuan, Fan Weixin. Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To study the effect of minoxidil on the growth of hair follicles. Methods Organ culture of newborn mouse vibrissa follicles in vitro, incorportating of 3H-TdR radioactive thymidine into the cultured follicles and the histopathologic features of the follicles. Results When the follicles were cultured in 70μg/ml of minoxidil for 24h, the follicles had a significant increase in length, the hair dermal papilla loosened, the follicle bulb enlarged, and the matrix cells grew actively. When cultured for 48h, the rate of increase of the length of the follicles reduced. When cultured for 30h, there was a significant increase of 3H-TdR incorporating. Conclusion The results indicate that minoxidil promotes the growth of hair follicles, and is related to its concentration and the duration of culture of the follicles.
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【Key words】 Minoxidil Hair Tissue culture
米诺地尔外用于男性秃发患者，能使秃发区毛发生长，并能增加毛发直径。米诺地尔对毛囊的作用机理有多种学说，但具体作用机理尚不清楚。毛囊生长具有周期性，为了排除体内复杂因素对毛素生长的影响，最好用体外游离毛囊培养。我们用1640无血清培养基培养鼠触须游离毛囊[1]，发现米诺地尔对培养毛囊有促生长作用，研究结果支持米诺地尔促进毛发生长可能是通过直接刺激毛囊的作用。
材料和方法
1.动物来源：C57BL/6J近交系乳鼠由南京医科大学动物研究中心提供。
2.试剂：1640培养基、米诺地尔、Herps液均购于上海华美生物工程公司。3H-胸腺嘧啶购于上海原子能研究所。毛囊培养基由1640培养液加胰岛素5μg/ml、氢化可的松0.4μg/ml、青霉素500U/ml、链霉素500μg/ml、Herps 20mmol/L构成。
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3.实验方法：取毛囊：40只出生1周的近交系C57BL/6J乳鼠，剪去双侧胡须，75%酒精消毒上唇部，无菌条件下剪下双侧胡须垫，置于无菌D-Hanks液中，解剖显微镜下从皮下组织中用微循环手术镊分离并轻取触须垫眼侧毛囊，每鼠触须垫约可取7～9只毛囊，每次实验约可取70个毛囊，选完整的生长期毛囊，用无菌1640培养液冲洗3遍。
常规培养：实验共分4组，第2、第3和第4组为米诺地尔观察组，加入米诺地尔浓度分别为70μg/ml、140μg/ml和280μg/ml，第1组为空白对照组，除不加米诺地尔外，其它培养条件一切与米诺地尔组相同。培养在24孔板中进行，每组6孔，每孔2个毛囊，含1640培养液0.75ml。37℃、5% CO2条件下孵育96小时。
加入3H-TdR培养：同上述分组，各组培养18小时后，加入3H-TdR 2μCi/ml，继续孵育12小时，取出毛囊，PBS冲洗3遍，约30分钟，置于闪烁杯中，每杯置5个毛囊，加入2%乙酸200μl，70℃水浴溶解毛囊，毛囊部全部溶解后加入二氧六环闪烁剂，每杯6ml。
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检测方法：1毛囊生长长度测定：在倒置显微镜中装入目镜测微仪，每24小时测毛囊底部至毛干顶部毛囊长度。2形态观察：普通病理：逐日取毛囊置10%福尔马林液中固定，常规制片后观察。倒置显微镜下每日观察毛球部及其内部结构形态改变。3 3H-TdR摄入率测定。
4.统计学方法：生长长度用t及t′检验。
结 果
1.毛囊生长长度测定：所有毛囊均为第1个24小时生长最快，米诺地尔浓度为70μg/ml时，生长最好，平均生长0.31±0.005mm；浓度为140μg/ml时其次，为0.115±0.004mm；浓度为280μg/ml时，为0.085±0.004mm；空白对照组平均生长0.1±0.003mm。70μg/ml组与空白对照组比较有显著性差异(t′=19.302，P< 0.01)，140μg/ml和280μg/ml组与空白对照组比较均无显著性差异(t=1.618和t=1.683，P均 >0.05)。第2个24小时，生长明显减缓，以70μg/ml时，生长平均仅为0.08±0.004mm。第3个24小时，大部分毛囊靠壁，停止生长。第4个24小时，毛囊部分开始缩短。
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2.毛囊形态改变观察：病理改变：24小时：空白对照组和第2组均表现为毛母质部细胞增生活跃，处于增生状态细胞数量多，细胞核大，核质淡染；黑素细胞密集，毛母质部、毛干下部见均匀多量的细小黑素颗粒；毛乳头部见多量的梭形核细胞，无空泡细胞。48小时：空白对照组：毛母质部处于增生状态细胞数量明显减少，黑素细胞量减少，毛乳头部梭形核细胞明显减少，出现多量的空泡细胞。实验组：毛母质部细胞仍有多量处于增生状态的细胞，黑素细胞略有减少，毛乳头部梭形核细胞量减少，出现部分空泡细胞。72小时后，毛球部、毛根鞘部均出现多量的空泡细胞。黑素颗粒部分凝集成小块状。倒置显微镜观察毛囊形态改变：不管是实验组还是对照组，24小时，毛球部体积变大，毛乳头松散，毛母质细胞所在部稍膨大。48小时后，对照组毛球部渐缩小，毛乳头浓缩，毛母质部缩小，毛干上移。实验组第2组该变化过程慢于对照组。
3.同位素摄入率测定：米诺地尔70μg/ml组摄入率平均每杯为1327.08c/min，140μg/ml组为436.89c/min，280μg/ml浓度组为322.54c/min，空白对照组为287.79c/min，底色为78.39c/min。
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米诺地尔对毛囊生长影响作用与其浓度有一定关系。Obana等[2]培养鼠毛囊内外毛根鞘细胞，发现70～140μg/ml浓度时，刺激毛囊上皮细胞的分裂增生。Buhl[3]培养游离鼠触须毛囊发现米诺地尔浓度为0.5～1.0mmol时促进毛囊生长，而浓度为5.0mmol时，抑制毛囊生长作用。我们发现70μg/ml浓度时，有明显促生长作用，而浓度为140μg/ml和280μg/ml时，其促生长作用不明显，米诺地尔对毛囊生长影响作用与其浓度间有一定关系，但其最佳浓度的发现尚需进一步探讨。
不同培养时间，米诺地尔对毛囊促生长作用程度不同。鼠毛囊体积小，操作时易破坏其完整性，且可能培养基中缺乏某种尚未认识到的因子，因此鼠触须毛囊体外培养存活时间较短[4]。本文选完整生长期毛囊培养，米诺地尔70μg/ml浓度时，24小时毛囊生长明显，毛母质细胞增生活跃，48小时毛囊生长明显减慢，与24小时生长长度有显著性差异，毛母质细胞增生活跃程度降低。72小时大部分毛囊停止生长，部分毛囊毛母质细胞、毛根鞘细胞出现坏死。与对照组相比，米诺地尔能促使毛囊保持正常形态，减少坏死，刺激毛母质细胞增生。且在培养24小时时，其促生长作用最为明显。同位素标记技术的应用使实验更为精确和深入。培养18小时后加入3H-TdR孵育12小时，测定毛囊同位素掺入率值，显示米诺地尔在培养毛囊30小时中，浓度70μg/ml时，毛囊同位素掺入率最高。这与毛囊长度测定和毛囊形态观察结果相一致。
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米诺地尔对毛囊促生长作用机理，有人认为与其扩张局部血管平滑肌而引起局部血流量增加有关。也有人认为钾离子通道得以开放有关[5]。本实验结果提示米诺地尔可能对毛囊上皮有直接促生长作用。
参考文献
1 Jindo T, Imai K, Takamori K, et al. Organ culture of mouse vibrissal hair follicles in serum-free medium. J Dermatol, 1993,20∶756-762.
2 Obana NT, Ito M. Effect of cepharanthine and minoxidil on proliferation, differentiation and keratinization of cultured cells from the murine hair apparatus. Arch Dermal Res, 1992,284∶290-296.
, http://www.100md.com
3 Buhl AE, Waldon DJ, Kawake TT, et al. Minoxidil stimulates mouse vibrissae follicles in organ culture. J Invest Dermatol, 1989,92∶315-320.
4 Philpott MP, Green MR, Kealey A. Rat hair follicles growth in vitro. Br J Dermatol, 1992,127∶600-607.
5 Nakaya Y, Hamaoka H, Kato S, et al. Effect of minoxidil sulfate and pinacidil on single potassium channel current in cultured human outer root sheath cells and dermal papilla cells. J Dermatol Sci,1994,7∶s104-s108.
(收稿：1997-12-29 修回：1998-02-29), 百拇医药