磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C光动力效应诱导肿瘤细胞凋亡*
作者：许建华 黄自强 孙建成
单位：福州 350004 福建医科大学药理教研室
关键词：酞菁锌；光动力学治疗；细胞凋亡
中国现代应用药学990104摘要 目的：研究新型光敏剂磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C光动力效应诱导肿瘤细胞凋亡，探索其光动力杀伤机理。方法：用AO/EB荧光染色法、流式细胞仪及电子显微镜观察该光敏剂光动力效应对人白血病K562细胞形态、超微结构及DNA含量的影响。结果：药物作用2h，以红光照射后继续培养3h以上，就可出现明显的细胞凋亡特征性改变。结论：新型光敏剂磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C光动力杀伤作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
Apoptosis of tumor cells induced by photodynamic therapy with sulfonated phthalimidomethyl zinc phthalocyanine C
, 百拇医药
Xu Jianhua(Xu JH),Huang Ziqiang(Huang ZQ),Su Jiancheng(Su JC)(Department of Pharmacology Fujian Medical University,Fuzhou 350004)
ABSTRACT OBJECTIVE：To observe the apoptosis of leukemia K562 cells induced by photodynamic therapy(PDT) with sulfonated phthalimidomethyl zinc phthalocyanine C(ZnPcSP-C).METHODS:Using fluorescence microscope,ransmission electron microscope and flow cytometry,the apoptosis of leukemia K562 cells induced by PDT with ZnPcSP-C was observed.RESULTS:After 2h treatment with ZnPcSP-C at 2.5～10.0μg/ml,the cells irradiated by red light and continuously cultured over 3h,the cells began to undergo typical changes of apoptosis.CONCLUSION:The antitumor effect of PDT with ZnPcSP-C may correlate to apoptosis of tumor cells.
, 百拇医药
KEY WORDS Zinc-phthalocyanine,photodynamic therapy,apoptosis
金属酞菁类光敏剂具有组分确定，性质稳定，主吸收带位于对人体组织透射率较高的红光波段，光敏化活性较血卟啉衍生物类光敏剂强，且皮肤光毒性小等优点，因此颇受重视[1]。前文报道了福州大学化学系首次合成的新型光敏剂磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C对肿瘤具有较强体内外光动力效应[2]，为了进一步探讨该药光动力杀伤的机理，本文报道了该药光动力效应对细胞凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C(Sulfonated phthalimidomethyl zinc phthalocyanine C,ZnPcSP-C,由福州大学化学系黄金陵、陈耐生教授合成、提供)；吖啶橙(AO)及溴乙锭(EB，Fluka公司)。流式细胞仪DNA含量测定试剂盒(Kinesis 50，BIO-RAD产品)。
, 百拇医药
1.2 细胞株及培养条件
人白血病细胞K562为我校肿瘤室保种，培养于含10%新生牛血清,100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液传代、培养。取对数生长期的细胞用于实验。
1.3 体外光动力(PDT)实验[2]
于细胞培养瓶中接种2.5×105/ml的细胞悬液2ml,给药组加入不同浓度的ZnPcSP-C,置5% CO2孵箱内,37℃培养2h后，用碘钨灯以5.4J/cm2红光照射20min,继续培养不同时间，观察细胞凋亡情况，并计算凋亡率。
1.4 细胞凋亡的观察
1.4.1 AO/EB染色法[3]:精确称取AO、EB各1mg,分别溶于10ml pH7.2 PBS中，配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，取细胞悬液100μl,加入AO/EB染料4μl混匀，滴于载玻片上，封片后在荧光显微镜下观察，可见：活细胞核染色质被AO染成绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质着绿色并呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞，膜受损，核染色质被EB染成桔红色并呈固缩或圆珠状；膜受损细胞，包括晚期凋亡细胞及坏死细胞，核染色质均被EB染成桔红色。分类计数200个细胞，计算凋亡率及膜受损细胞率。
, http://www.100md.com
1.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡：取光敏剂PDT作用过的细胞以PBS调细胞浓度为106/ml,取200μl加入Kinesis 50试剂，室温避光孵育30min,用BIO-RAD Bryte-hs型流式细胞仪作DNA分析，以Start VERITY:Mod LT软件分析DNA含量分布直方图，计算各时相细胞及凋亡细胞百分比。
1.4.3 电镜观察：收集细胞沉淀，以2.5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，Hitachi Hu-12A电镜观察。
2 结 果
2.1 荧光染色法观察细胞凋亡
ZnPcSP-C:2.5～10.0μg/ml对K562细胞作用2h,以5.4J/cm2红光照射20min,继续培养3～24h,细胞出现体积缩小，核碎裂、染色质凝集等凋亡的形态改变(图1)。对不同剂量光敏剂PDT后不同时间的细胞进行分类计数，结果见图2，3。从PDT后3h开始，光敏剂10μg/ml处理的细胞出现95%的凋亡率及50%的膜受损率，而同时刻5μg/ml处理的细胞则大多数未出现凋亡及膜损伤，可见5～10μg/ml之间量效关系最显著。以PDT12～～24后随着培养时间延长，同浓度光敏诱导剂诱导凋亡的时效差异已不显著，而膜受损率呈时间依赖性增加，可见PDT后12h诱导凋亡已近坪值。当光敏剂浓度增至10μg/ml，PDT后3h,诱导凋亡就可达坪值。
, 百拇医药
图1 ZnPcSP-C PDT对K562细胞形态的影响
A-正常对照；B-ZnPcSP-C 5μg/ml PDT后12h
图2 ZnPcSP-C PDT对K562细胞凋亡率的影响
1-0.5h;2-3h;3-12h;4-24h
图3 ZnPcSP-C PDT对K562细胞膜损伤的影响
1-0.5h;2-3h;3-12h;4-24h
2.2 流式细胞光度术分析细胞凋亡
ZnPcSP-C 2.5，5μg/ml同上条件PDT后12h,以流式细胞仪分析细胞DNA含量直方图，可见典型的DNA含量小于2倍体的亚G1凋亡峰，将微机软件拟合得出的亚G1及各时相细胞百分比总结于表1，可见ZnPcSP-C 2.5，5μg/ml PDT后12h诱导细胞凋亡的百分比与荧光染色法结果相近。从表1还可发现光敏剂2.5μg/ml PDT主要引起S期细胞比例明显下降，表明S期细胞对此浓度光敏剂PDT诱导凋亡更敏感，而随着光敏剂浓度的提高，在5μg/ml时，则主要引起G0-G1期细胞的丢失。
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表1 ZnPcSP-C PDT对K562细胞周期时相与亚G1期细胞的影响 ZnPcSP-C
(μg/ml)
细胞周期时相(%)
亚G1期细胞
(%)
G0-G1
S
G1-M
0
41.13
, http://www.100md.com 48.28
10.58
0
2.5
46.51
36.05
17.44
16.16
5.0
0
81.47
18.53
47.46
, http://www.100md.com
2.3 PDT诱导凋亡的超微结构观察
透射电镜观察进一步证实ZnPcSP-C 5μg/ml PDT后12h,可诱导多数细胞出现典型的凋亡超微结构变化。由图4可见，对照细胞核大，形状不整，核内染色质均匀，异染色质稀少，核仁明显。PDT后细胞核缩小，核内染色体聚集于核膜周边或呈筛状，核膜部分消失，胞浆细胞器丰富，细胞膜完整。
图4 ZnPcSP-C PDT对K562细胞超微结构的影响
3 讨 论
光敏剂被肿瘤细胞摄取后经光照激活，通过光氧化反应产生抗肿瘤作用，但其确切机理尚无定论。以往认为细胞膜系统是PDT的重要靶点[4]，还有证据表明可引起DNA损伤[5]及诱导细胞凋亡[6]。ZnPcSP-C是由福州大学化学系首次合成的新型酞菁光敏剂，其PDT杀伤机制未见报道。本文结果表明，该药PDT在引起膜损伤之前就可诱导K562细胞凋亡，且呈量效、时效关系，在5.0～10.0μg/ml的狭窄浓度范围内量效关系最为显著,PDT后3h高浓度组就可诱导90%以上细胞凋亡，12h后各浓度诱导凋亡基本达到坪值，此后随时间延长，凋亡率升高不明显，而膜损伤程度加重。从流式细胞仪的检测结果还表明，该药高、低浓度诱导凋亡的敏感细胞时相可能有所不同，低浓度似以诱导S期细胞凋亡为主，高浓度则除可能诱导S期细胞凋亡外，诱导G0-G1期细胞凋亡的比例也可能显著提高，由此导致G0-G1期细胞大量丢失，并使S期细胞比例相对提高。这一现象可能与随着剂量的增加，细胞内PDT的靶点范围扩大有关，值得进一步研究。
, 百拇医药
*福建省科委资助项目第94-2-162号
参考文献
[1] Rosenthal I.Phathalocyanine as photodynamic sensitizers.Photochem Photobil,1991,53∶859.
[2] 许建华，孙建成，黄自强.磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C对肿瘤的光动力学效应的研究.中国现代应用药学，1998，15(5)∶7.
[3] 陈丽娟，盛瑞兰，汪承亚，等.AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡.中华血液病学杂志，1998，19(1)∶41.
[4] 傅乃武，全兰萍，燕利学，等.磺化铝酞菁 对小鼠肿瘤和细胞膜的光动力作用.中国药理学与毒理学杂志，1993，7∶180.
[5] 琦祖和，秦健，赵晓剑，等.血卟啉衍生物光动力作用对DNA分子的损伤.中国医学科学院学报，1995，17(2)∶139.
[6] 周传农，池顺姬，邓津生，等.锌酞菁-LDL复合物光敏作用诱导小鼠肿瘤细胞程序性死亡.中国医学科学院学报，1995，17(1)∶25.
收稿日期：1998-08-28, http://www.100md.com
单位：福州 350004 福建医科大学药理教研室
关键词：酞菁锌；光动力学治疗；细胞凋亡
中国现代应用药学990104摘要 目的：研究新型光敏剂磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C光动力效应诱导肿瘤细胞凋亡，探索其光动力杀伤机理。方法：用AO/EB荧光染色法、流式细胞仪及电子显微镜观察该光敏剂光动力效应对人白血病K562细胞形态、超微结构及DNA含量的影响。结果：药物作用2h，以红光照射后继续培养3h以上，就可出现明显的细胞凋亡特征性改变。结论：新型光敏剂磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C光动力杀伤作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
Apoptosis of tumor cells induced by photodynamic therapy with sulfonated phthalimidomethyl zinc phthalocyanine C
, 百拇医药
Xu Jianhua(Xu JH),Huang Ziqiang(Huang ZQ),Su Jiancheng(Su JC)(Department of Pharmacology Fujian Medical University,Fuzhou 350004)
ABSTRACT OBJECTIVE：To observe the apoptosis of leukemia K562 cells induced by photodynamic therapy(PDT) with sulfonated phthalimidomethyl zinc phthalocyanine C(ZnPcSP-C).METHODS:Using fluorescence microscope,ransmission electron microscope and flow cytometry,the apoptosis of leukemia K562 cells induced by PDT with ZnPcSP-C was observed.RESULTS:After 2h treatment with ZnPcSP-C at 2.5～10.0μg/ml,the cells irradiated by red light and continuously cultured over 3h,the cells began to undergo typical changes of apoptosis.CONCLUSION:The antitumor effect of PDT with ZnPcSP-C may correlate to apoptosis of tumor cells.
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KEY WORDS Zinc-phthalocyanine,photodynamic therapy,apoptosis
金属酞菁类光敏剂具有组分确定，性质稳定，主吸收带位于对人体组织透射率较高的红光波段，光敏化活性较血卟啉衍生物类光敏剂强，且皮肤光毒性小等优点，因此颇受重视[1]。前文报道了福州大学化学系首次合成的新型光敏剂磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C对肿瘤具有较强体内外光动力效应[2]，为了进一步探讨该药光动力杀伤的机理，本文报道了该药光动力效应对细胞凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂
磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C(Sulfonated phthalimidomethyl zinc phthalocyanine C,ZnPcSP-C,由福州大学化学系黄金陵、陈耐生教授合成、提供)；吖啶橙(AO)及溴乙锭(EB，Fluka公司)。流式细胞仪DNA含量测定试剂盒(Kinesis 50，BIO-RAD产品)。
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1.2 细胞株及培养条件
人白血病细胞K562为我校肿瘤室保种，培养于含10%新生牛血清,100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液传代、培养。取对数生长期的细胞用于实验。
1.3 体外光动力(PDT)实验[2]
于细胞培养瓶中接种2.5×105/ml的细胞悬液2ml,给药组加入不同浓度的ZnPcSP-C,置5% CO2孵箱内,37℃培养2h后，用碘钨灯以5.4J/cm2红光照射20min,继续培养不同时间，观察细胞凋亡情况，并计算凋亡率。
1.4 细胞凋亡的观察
1.4.1 AO/EB染色法[3]:精确称取AO、EB各1mg,分别溶于10ml pH7.2 PBS中，配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，取细胞悬液100μl,加入AO/EB染料4μl混匀，滴于载玻片上，封片后在荧光显微镜下观察，可见：活细胞核染色质被AO染成绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质着绿色并呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞，膜受损，核染色质被EB染成桔红色并呈固缩或圆珠状；膜受损细胞，包括晚期凋亡细胞及坏死细胞，核染色质均被EB染成桔红色。分类计数200个细胞，计算凋亡率及膜受损细胞率。
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1.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡：取光敏剂PDT作用过的细胞以PBS调细胞浓度为106/ml,取200μl加入Kinesis 50试剂，室温避光孵育30min,用BIO-RAD Bryte-hs型流式细胞仪作DNA分析，以Start VERITY:Mod LT软件分析DNA含量分布直方图，计算各时相细胞及凋亡细胞百分比。
1.4.3 电镜观察：收集细胞沉淀，以2.5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，Hitachi Hu-12A电镜观察。
2 结 果
2.1 荧光染色法观察细胞凋亡
ZnPcSP-C:2.5～10.0μg/ml对K562细胞作用2h,以5.4J/cm2红光照射20min,继续培养3～24h,细胞出现体积缩小，核碎裂、染色质凝集等凋亡的形态改变(图1)。对不同剂量光敏剂PDT后不同时间的细胞进行分类计数，结果见图2，3。从PDT后3h开始，光敏剂10μg/ml处理的细胞出现95%的凋亡率及50%的膜受损率，而同时刻5μg/ml处理的细胞则大多数未出现凋亡及膜损伤，可见5～10μg/ml之间量效关系最显著。以PDT12～～24后随着培养时间延长，同浓度光敏诱导剂诱导凋亡的时效差异已不显著，而膜受损率呈时间依赖性增加，可见PDT后12h诱导凋亡已近坪值。当光敏剂浓度增至10μg/ml，PDT后3h,诱导凋亡就可达坪值。
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图1 ZnPcSP-C PDT对K562细胞形态的影响
A-正常对照；B-ZnPcSP-C 5μg/ml PDT后12h
图2 ZnPcSP-C PDT对K562细胞凋亡率的影响
1-0.5h;2-3h;3-12h;4-24h
图3 ZnPcSP-C PDT对K562细胞膜损伤的影响
1-0.5h;2-3h;3-12h;4-24h
2.2 流式细胞光度术分析细胞凋亡
ZnPcSP-C 2.5，5μg/ml同上条件PDT后12h,以流式细胞仪分析细胞DNA含量直方图，可见典型的DNA含量小于2倍体的亚G1凋亡峰，将微机软件拟合得出的亚G1及各时相细胞百分比总结于表1，可见ZnPcSP-C 2.5，5μg/ml PDT后12h诱导细胞凋亡的百分比与荧光染色法结果相近。从表1还可发现光敏剂2.5μg/ml PDT主要引起S期细胞比例明显下降，表明S期细胞对此浓度光敏剂PDT诱导凋亡更敏感，而随着光敏剂浓度的提高，在5μg/ml时，则主要引起G0-G1期细胞的丢失。
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表1 ZnPcSP-C PDT对K562细胞周期时相与亚G1期细胞的影响 ZnPcSP-C
(μg/ml)
细胞周期时相(%)
亚G1期细胞
(%)
G0-G1
S
G1-M
0
41.13
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10.58
0
2.5
46.51
36.05
17.44
16.16
5.0
0
81.47
18.53
47.46
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2.3 PDT诱导凋亡的超微结构观察
透射电镜观察进一步证实ZnPcSP-C 5μg/ml PDT后12h,可诱导多数细胞出现典型的凋亡超微结构变化。由图4可见，对照细胞核大，形状不整，核内染色质均匀，异染色质稀少，核仁明显。PDT后细胞核缩小，核内染色体聚集于核膜周边或呈筛状，核膜部分消失，胞浆细胞器丰富，细胞膜完整。
图4 ZnPcSP-C PDT对K562细胞超微结构的影响
3 讨 论
光敏剂被肿瘤细胞摄取后经光照激活，通过光氧化反应产生抗肿瘤作用，但其确切机理尚无定论。以往认为细胞膜系统是PDT的重要靶点[4]，还有证据表明可引起DNA损伤[5]及诱导细胞凋亡[6]。ZnPcSP-C是由福州大学化学系首次合成的新型酞菁光敏剂，其PDT杀伤机制未见报道。本文结果表明，该药PDT在引起膜损伤之前就可诱导K562细胞凋亡，且呈量效、时效关系，在5.0～10.0μg/ml的狭窄浓度范围内量效关系最为显著,PDT后3h高浓度组就可诱导90%以上细胞凋亡，12h后各浓度诱导凋亡基本达到坪值，此后随时间延长，凋亡率升高不明显，而膜损伤程度加重。从流式细胞仪的检测结果还表明，该药高、低浓度诱导凋亡的敏感细胞时相可能有所不同，低浓度似以诱导S期细胞凋亡为主，高浓度则除可能诱导S期细胞凋亡外，诱导G0-G1期细胞凋亡的比例也可能显著提高，由此导致G0-G1期细胞大量丢失，并使S期细胞比例相对提高。这一现象可能与随着剂量的增加，细胞内PDT的靶点范围扩大有关，值得进一步研究。
, 百拇医药
*福建省科委资助项目第94-2-162号
参考文献
[1] Rosenthal I.Phathalocyanine as photodynamic sensitizers.Photochem Photobil,1991,53∶859.
[2] 许建华，孙建成，黄自强.磺酸基邻苯二甲酰亚氨甲基酞菁锌C对肿瘤的光动力学效应的研究.中国现代应用药学，1998，15(5)∶7.
[3] 陈丽娟，盛瑞兰，汪承亚，等.AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL60细胞凋亡.中华血液病学杂志，1998，19(1)∶41.
[4] 傅乃武，全兰萍，燕利学，等.磺化铝酞菁 对小鼠肿瘤和细胞膜的光动力作用.中国药理学与毒理学杂志，1993，7∶180.
[5] 琦祖和，秦健，赵晓剑，等.血卟啉衍生物光动力作用对DNA分子的损伤.中国医学科学院学报，1995，17(2)∶139.
[6] 周传农，池顺姬，邓津生，等.锌酞菁-LDL复合物光敏作用诱导小鼠肿瘤细胞程序性死亡.中国医学科学院学报，1995，17(1)∶25.
收稿日期：1998-08-28, http://www.100md.com