利用电泳滴定曲线选择多核苷酸磷酸化酶快速离子交换层析的最佳条件
作者：陈枢青 韩晓旭
单位：杭州 310006 浙江大学医学院生物化学教研室
关键词：电泳滴定曲线；多核苷酸磷酸化酶；快速离子交换层析；纯化
中国现代应用药学990114摘要 目的：选择多核苷酸磷酸化酶快速离子交换层析的最佳条件。方法：制备大肠杆菌提取物的电泳滴定曲线，根据该曲线选择快速离子交换层析Mono SI柱的洗脱缓冲液的pH。结果：根据该滴定曲线选择pH 8.0作为快速离子交换层析Mono SI柱的洗脱缓冲液的pH，在该条件下只一步层析，得到的多核苷酸磷酸化酶的比活性提高2500倍。结论：电泳滴定曲线法能够用于离子交换层析的最佳条件的选择。
Use of electrophoretic titration curve for predicting optimal chromatographic conditions for purification of polynucleotide phosphorylase by fast ion-exchange chromatography
, 百拇医药
Chen Shuqing(Chen SQ),Han Xiaoxu(Han XX)(Department of Biochemistry,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310006)
ABSTRACT OBJECTIVE：Selection of optimal chromatographic conditions for purification of polynucleotide phosphorylase in fast ion-exchange chromatography.METHODS:Preparation of electrophoretic titration curve of E. coli extract and prediction of optimal conditions for fast ion-exchange chromatography.RESULTS:According to the electrophoretic titration curve of E. coli extract,the buffer with pH 8.0 was chosen as eluent for the fast ion-exchange chromatography on Mono SI column.Polynucleotide phosphorylase with a specific activity of 2500-fold higher than that of the original extract was obtained in one step.CONCLUSION:Electrophoretic titration curve could be used to predict optimal chromatographic conditions for ion-exchange chromatography.
, 百拇医药
KEY WORDS Electrophoretic titration curve,polynucleotide phosphorylase,fastion-exchange chromatography,puritication
电泳滴定曲线法[1]实际上是带等电聚焦的双相电泳法，第一相不加样本的等电聚焦以形成pH梯度，第二相沿pH梯度全长加样，电泳的结果是以pH为横坐标，电性强度为纵坐标的两维图谱，称为电泳滴定曲线。对电泳滴定曲线的分析，可了解混合物的带电情况，从而理论性地指导离子交换层析和电泳等依赖电性进行分离的方法的最佳条件的选择[2]。多核苷酸磷酸化酶[3](EC.2.7.7.8)对核酸研究作出过巨大的贡献，近年来该酶被用来催化合成抗病毒药物聚肌胞[4]，又引起了人们的重视。本文利用电泳滴定曲线法来选择快速蛋白液相层析时的最佳条件，建立了一种快速、高效的纯化方法，成功地分离到纯化倍数为2500倍的多核苷酸磷酸化酶。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂
丙烯酰胺和SDS是Sigma(St.Louis,USA)的产品；甲叉双丙烯酰胺是比利时UCB的产品；Pharmalyte(pH3-10)是瑞典Pharmacia Fine Chemicals的产品；TEMED是英国Koch-Light实验室的产品。
1.2 仪器
快速蛋白液相层析仪(FPLC)和电泳装置是瑞典Pharmacia公司的产品，快速蛋白液相层析仪装备有两只P-500输液泵、GP-250梯度程序仪、UV-1单波长检测器和Mono SI HR 5/5(50×5mm ID)柱；电泳装置由FBE-3000水平电泳槽、ECPS 3000/150电泳仪、VH-1伏特小时积分仪和微制胶模子组成。
1.3 方法
, 百拇医药
1.3.1 粗品多核苷酸磷酸化酶的制备按韩晓旭等[5]的方法进行。
1.3.2 电泳滴定曲线的制备：凝胶含有5%丙烯酰胺、0.13%甲叉双丙烯酰胺、6.3% Pharmalyte(pH 3～10)、9%甘油、0.05%TEMED和0.04%过硫酸铵，在微制胶模子中制成110×110×1mm的凝胶，凝胶当中有一80×1×0.8mm的样品槽。电泳在水平电泳槽上进行，冷却温度12℃。第一相电泳不加样品，电场方向垂直于样品槽，阳极条吸胀0.04M天冬氨酸，阴极条吸胀1M氢氧化钠，电压15W，电泳750V*h以形成pH梯度。第二相电泳时，首先将凝胶转90°角，电极条重新浸泡一次，向样品槽加50μl浓度约为2.5mg/ml的样品，15W再电泳500V*h。电泳后，凝胶在10%三氯醋酸-5%磺酰水杨酸中固定30min，脱色液(35%乙醇-10%醋酸)洗二次，然后在0.2%考马氏亮兰(脱色液为溶剂)中染色15h，再用脱色液洗至背境无色。
1.3.3 多核苷酸磷酸化酶活性的测定按Fuwa[6]法进行。
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1.3.4 杂酶活性的测定：RNA酶活性按Spahr[7]的方法进行；磷酸单酯酶和5′-核苷酸酶活性按下述方法进行：反应体系与多核苷酸磷酸化酶活性测定时相同，只是反应的底物对磷酸单酯酶是0.01M的β-磷酸甘油，对5′-核苷酸酶是0.005M的5′-AMP。37℃保温20min后，利用Fiske[8]的方法测定游离磷酸。上述条件下，每释放1μM磷酸定义为一个酶活性单位。
1.3.5 蛋白质定量：按Warburg & Christian[9]的方法进行。
1.3.6 SDS-PAGE按Laemmli[10]法进行。
2 结 果
在粗品多核苷酸磷酸化酶的电泳滴定曲线中。当pH 8.0时，各曲线之间有最大间隙，说明在该pH条件下，离子交换层析和电泳等利用电性差异进行的分离方法可获得最大限度的分离。从而，pH 8.0被选择为离子交换层析缓冲液的pH条件。又由于在pH 8时多数蛋白质带负电荷，所以选择了阴离子交换柱Mono SI。经实际上样洗脱得到如图1的洗脱曲线，对各组分进行多核苷酸磷酸化酶活性测定，发现峰Ⅰ多核苷酸磷酸化酶的活性较高。收集该组分经冷冻干燥得到白色粉状物质，对其进行多核苷酸磷酸化酶、磷酸单酯酶、5′-核苷酸酶和RNA酶比活性测定，发现多核苷酸磷酸化酶的比活性比纯化前提高2500倍，磷酸单酯酶、5′-核苷酸酶和RNA酶的活性未检出(表1)，SDS-PAGE电泳为单一条带。
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图1 离子交换层析的洗脱曲线
表1 多核苷酸磷酸化酶、磷酸单酯酶和5′-核苷酸酶的比活性比较(unit/mg)
多核苷酸磷酸化酶
磷酸单酯酶
5′-核苷酸酶
RNA酶
大肠杆菌提取物
0.47(1倍)---------
粗品多核苷酸磷酸化酶
46.4(100倍)
1.0
, 百拇医药
0.1
0.6
精品多核苷酸磷酸化酶
1170(2500倍)
0
0
0
3 讨 论
在FPLC纯化条件的选择中，我们引入了电泳滴定曲线法，该法自1977年首次报道以来，已成功地为多种蛋白质的纯化选择了条件，电泳滴定曲线法使离子交换层析、电泳等最佳条件的选择理论化、程序化。粗品多核苷酸磷酸化酶的电泳滴定曲线显示在pH 8时，其几条曲线之间距离最远，也就是说，采用pH 8的缓冲液作为层析时的流动相，可使粗品多核苷酸磷酸化酶中几种蛋白质组分得到最大限度的分离。该电泳滴定曲线上pH 8时大部分蛋白质带负电荷， 从而选择阴离子交换柱Mono SI用于纯化多核苷酸磷酸化酶。由于正确理论的指导，多核苷酸磷酸化酶的纯化得以一次成功，FPLC Mono SI洗脱曲线(图1)证实了这一点。
, 百拇医药
本法提纯时发现FPLC Mono SI柱洗脱曲线有两个活性峰，峰Ⅰ比活性高，纯度也高；峰Ⅱ比活性低，纯度低，说明在该条件下，该组分没有达到分离。据文献报道[11]大肠杆菌以及大多数细菌，其多核苷酸磷酸化酶具有A型和B型两种形式，A型由三个相同的α亚基组成；B型由αnβm多亚基组成，n和m不定。α亚基的分子量为85000，β亚基的分子量为4800。SDS-PAGE电泳时A 型多核苷酸磷酸化酶表现一条主带，B型多核苷酸磷酸化酶表现为二条主带。根据以上情况，峰I和峰II可能是大肠杆菌中的A型和B型多核苷酸磷酸化酶。但要证实这一点尚需进一步的研究资料。
参考文献
[1] Bosisio AB,Loeherlein C,Snyder RS,et al.Titration curves of proteins by combined isoelectric focusing-electrophoresis in highly porous polyacrylamide matrices.J Chromatogr，1980，189∶317.
, http://www.100md.com
[2] Fgerstam L, Sderberg L,Wahlstrm L,et al.Basic principles used in the selection of monobeads ion exchangers for the separation of biopolymers.Protides Biol Fluids 1983，30∶621.
[3] Grunberg-Manago M,Ochoa S.Enzymatic synthesis and breakdown of polynucleotides;Polynucleotide phosphorylase.J Am Chem Soc，1955，77∶3165.
[4] Field AK,Tytell AA,Lampson GP,et al.Induces of interferon and host resistance.Ⅱ.Multistranded synthetic polynucleotide complexes.Proc Natl Acad Sci，1967，58∶1004.
, http://www.100md.com
[5] 韩晓旭，诸玲玲.抗病毒新药聚肌胞(Poly I:C)的实验研究.浙江药学，1984，创刊号∶4.
[6] Fuwa I,Okuda J.Inhibitory action of tetracyclines on polynucleotide phosphorylase.J Biochem，1966，59∶95.
[7] Spahr PF,Hollingworth BR.Purification and mechanism of action of ribonuclease from Escherichia coli ribosomes.J Biol Chem，1961，236∶823.
[8] Fiske CH,Subbarow Y.The colorimetric determination of phosphorus.J Biol Chem，1925，66∶375.
, http://www.100md.com
[9] Warburg O,Christian W.Isolierung und kristallisation des proteins des oxydierenden grungsferments.Biochem Z，1939，40∶303.
[10] Laemmli UK.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature，1970，227∶680.
[11] Porter C.Quaternary structure of Escherichia coli polynucleotide phosphorylase.New evidence for a trimeric structure.FEBS Letter，1975，50∶79.
收稿日期：1997-09-12, 百拇医药
单位：杭州 310006 浙江大学医学院生物化学教研室
关键词：电泳滴定曲线；多核苷酸磷酸化酶；快速离子交换层析；纯化
中国现代应用药学990114摘要 目的：选择多核苷酸磷酸化酶快速离子交换层析的最佳条件。方法：制备大肠杆菌提取物的电泳滴定曲线，根据该曲线选择快速离子交换层析Mono SI柱的洗脱缓冲液的pH。结果：根据该滴定曲线选择pH 8.0作为快速离子交换层析Mono SI柱的洗脱缓冲液的pH，在该条件下只一步层析，得到的多核苷酸磷酸化酶的比活性提高2500倍。结论：电泳滴定曲线法能够用于离子交换层析的最佳条件的选择。
Use of electrophoretic titration curve for predicting optimal chromatographic conditions for purification of polynucleotide phosphorylase by fast ion-exchange chromatography
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Chen Shuqing(Chen SQ),Han Xiaoxu(Han XX)(Department of Biochemistry,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310006)
ABSTRACT OBJECTIVE：Selection of optimal chromatographic conditions for purification of polynucleotide phosphorylase in fast ion-exchange chromatography.METHODS:Preparation of electrophoretic titration curve of E. coli extract and prediction of optimal conditions for fast ion-exchange chromatography.RESULTS:According to the electrophoretic titration curve of E. coli extract,the buffer with pH 8.0 was chosen as eluent for the fast ion-exchange chromatography on Mono SI column.Polynucleotide phosphorylase with a specific activity of 2500-fold higher than that of the original extract was obtained in one step.CONCLUSION:Electrophoretic titration curve could be used to predict optimal chromatographic conditions for ion-exchange chromatography.
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KEY WORDS Electrophoretic titration curve,polynucleotide phosphorylase,fastion-exchange chromatography,puritication
电泳滴定曲线法[1]实际上是带等电聚焦的双相电泳法，第一相不加样本的等电聚焦以形成pH梯度，第二相沿pH梯度全长加样，电泳的结果是以pH为横坐标，电性强度为纵坐标的两维图谱，称为电泳滴定曲线。对电泳滴定曲线的分析，可了解混合物的带电情况，从而理论性地指导离子交换层析和电泳等依赖电性进行分离的方法的最佳条件的选择[2]。多核苷酸磷酸化酶[3](EC.2.7.7.8)对核酸研究作出过巨大的贡献，近年来该酶被用来催化合成抗病毒药物聚肌胞[4]，又引起了人们的重视。本文利用电泳滴定曲线法来选择快速蛋白液相层析时的最佳条件，建立了一种快速、高效的纯化方法，成功地分离到纯化倍数为2500倍的多核苷酸磷酸化酶。
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1 材料与方法
1.1 试剂
丙烯酰胺和SDS是Sigma(St.Louis,USA)的产品；甲叉双丙烯酰胺是比利时UCB的产品；Pharmalyte(pH3-10)是瑞典Pharmacia Fine Chemicals的产品；TEMED是英国Koch-Light实验室的产品。
1.2 仪器
快速蛋白液相层析仪(FPLC)和电泳装置是瑞典Pharmacia公司的产品，快速蛋白液相层析仪装备有两只P-500输液泵、GP-250梯度程序仪、UV-1单波长检测器和Mono SI HR 5/5(50×5mm ID)柱；电泳装置由FBE-3000水平电泳槽、ECPS 3000/150电泳仪、VH-1伏特小时积分仪和微制胶模子组成。
1.3 方法
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1.3.1 粗品多核苷酸磷酸化酶的制备按韩晓旭等[5]的方法进行。
1.3.2 电泳滴定曲线的制备：凝胶含有5%丙烯酰胺、0.13%甲叉双丙烯酰胺、6.3% Pharmalyte(pH 3～10)、9%甘油、0.05%TEMED和0.04%过硫酸铵，在微制胶模子中制成110×110×1mm的凝胶，凝胶当中有一80×1×0.8mm的样品槽。电泳在水平电泳槽上进行，冷却温度12℃。第一相电泳不加样品，电场方向垂直于样品槽，阳极条吸胀0.04M天冬氨酸，阴极条吸胀1M氢氧化钠，电压15W，电泳750V*h以形成pH梯度。第二相电泳时，首先将凝胶转90°角，电极条重新浸泡一次，向样品槽加50μl浓度约为2.5mg/ml的样品，15W再电泳500V*h。电泳后，凝胶在10%三氯醋酸-5%磺酰水杨酸中固定30min，脱色液(35%乙醇-10%醋酸)洗二次，然后在0.2%考马氏亮兰(脱色液为溶剂)中染色15h，再用脱色液洗至背境无色。
1.3.3 多核苷酸磷酸化酶活性的测定按Fuwa[6]法进行。
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1.3.4 杂酶活性的测定：RNA酶活性按Spahr[7]的方法进行；磷酸单酯酶和5′-核苷酸酶活性按下述方法进行：反应体系与多核苷酸磷酸化酶活性测定时相同，只是反应的底物对磷酸单酯酶是0.01M的β-磷酸甘油，对5′-核苷酸酶是0.005M的5′-AMP。37℃保温20min后，利用Fiske[8]的方法测定游离磷酸。上述条件下，每释放1μM磷酸定义为一个酶活性单位。
1.3.5 蛋白质定量：按Warburg & Christian[9]的方法进行。
1.3.6 SDS-PAGE按Laemmli[10]法进行。
2 结 果
在粗品多核苷酸磷酸化酶的电泳滴定曲线中。当pH 8.0时，各曲线之间有最大间隙，说明在该pH条件下，离子交换层析和电泳等利用电性差异进行的分离方法可获得最大限度的分离。从而，pH 8.0被选择为离子交换层析缓冲液的pH条件。又由于在pH 8时多数蛋白质带负电荷，所以选择了阴离子交换柱Mono SI。经实际上样洗脱得到如图1的洗脱曲线，对各组分进行多核苷酸磷酸化酶活性测定，发现峰Ⅰ多核苷酸磷酸化酶的活性较高。收集该组分经冷冻干燥得到白色粉状物质，对其进行多核苷酸磷酸化酶、磷酸单酯酶、5′-核苷酸酶和RNA酶比活性测定，发现多核苷酸磷酸化酶的比活性比纯化前提高2500倍，磷酸单酯酶、5′-核苷酸酶和RNA酶的活性未检出(表1)，SDS-PAGE电泳为单一条带。
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图1 离子交换层析的洗脱曲线
表1 多核苷酸磷酸化酶、磷酸单酯酶和5′-核苷酸酶的比活性比较(unit/mg)
多核苷酸磷酸化酶
磷酸单酯酶
5′-核苷酸酶
RNA酶
大肠杆菌提取物
0.47(1倍)---------
粗品多核苷酸磷酸化酶
46.4(100倍)
1.0
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0.1
0.6
精品多核苷酸磷酸化酶
1170(2500倍)
0
0
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3 讨 论
在FPLC纯化条件的选择中，我们引入了电泳滴定曲线法，该法自1977年首次报道以来，已成功地为多种蛋白质的纯化选择了条件，电泳滴定曲线法使离子交换层析、电泳等最佳条件的选择理论化、程序化。粗品多核苷酸磷酸化酶的电泳滴定曲线显示在pH 8时，其几条曲线之间距离最远，也就是说，采用pH 8的缓冲液作为层析时的流动相，可使粗品多核苷酸磷酸化酶中几种蛋白质组分得到最大限度的分离。该电泳滴定曲线上pH 8时大部分蛋白质带负电荷， 从而选择阴离子交换柱Mono SI用于纯化多核苷酸磷酸化酶。由于正确理论的指导，多核苷酸磷酸化酶的纯化得以一次成功，FPLC Mono SI洗脱曲线(图1)证实了这一点。
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本法提纯时发现FPLC Mono SI柱洗脱曲线有两个活性峰，峰Ⅰ比活性高，纯度也高；峰Ⅱ比活性低，纯度低，说明在该条件下，该组分没有达到分离。据文献报道[11]大肠杆菌以及大多数细菌，其多核苷酸磷酸化酶具有A型和B型两种形式，A型由三个相同的α亚基组成；B型由αnβm多亚基组成，n和m不定。α亚基的分子量为85000，β亚基的分子量为4800。SDS-PAGE电泳时A 型多核苷酸磷酸化酶表现一条主带，B型多核苷酸磷酸化酶表现为二条主带。根据以上情况，峰I和峰II可能是大肠杆菌中的A型和B型多核苷酸磷酸化酶。但要证实这一点尚需进一步的研究资料。
参考文献
[1] Bosisio AB,Loeherlein C,Snyder RS,et al.Titration curves of proteins by combined isoelectric focusing-electrophoresis in highly porous polyacrylamide matrices.J Chromatogr，1980，189∶317.
, http://www.100md.com
[2] Fgerstam L, Sderberg L,Wahlstrm L,et al.Basic principles used in the selection of monobeads ion exchangers for the separation of biopolymers.Protides Biol Fluids 1983，30∶621.
[3] Grunberg-Manago M,Ochoa S.Enzymatic synthesis and breakdown of polynucleotides;Polynucleotide phosphorylase.J Am Chem Soc，1955，77∶3165.
[4] Field AK,Tytell AA,Lampson GP,et al.Induces of interferon and host resistance.Ⅱ.Multistranded synthetic polynucleotide complexes.Proc Natl Acad Sci，1967，58∶1004.
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[5] 韩晓旭，诸玲玲.抗病毒新药聚肌胞(Poly I:C)的实验研究.浙江药学，1984，创刊号∶4.
[6] Fuwa I,Okuda J.Inhibitory action of tetracyclines on polynucleotide phosphorylase.J Biochem，1966，59∶95.
[7] Spahr PF,Hollingworth BR.Purification and mechanism of action of ribonuclease from Escherichia coli ribosomes.J Biol Chem，1961，236∶823.
[8] Fiske CH,Subbarow Y.The colorimetric determination of phosphorus.J Biol Chem，1925，66∶375.
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[9] Warburg O,Christian W.Isolierung und kristallisation des proteins des oxydierenden grungsferments.Biochem Z，1939，40∶303.
[10] Laemmli UK.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature，1970，227∶680.
[11] Porter C.Quaternary structure of Escherichia coli polynucleotide phosphorylase.New evidence for a trimeric structure.FEBS Letter，1975，50∶79.
收稿日期：1997-09-12, 百拇医药