黄芪当归对肾病鼠蛋白质合成代谢影响的研究
作者：陈孟华 阿丽英 潘缉圣 王海燕
单位：陈孟华：宁夏医学院附属医院肾脏内科 750004;阿丽英 潘缉圣 王海燕：北京医科大学第一医院肾病研究所 100000
关键词：肾病综合征；基因表达；中药
宁夏医学院学报990102 摘 要 目的：探讨黄芪当归改善肾病鼠蛋白质代谢紊乱的机制。方法：采用分子杂交的方法观察了肾病综合征大鼠肝白蛋白mRAN的表达。结果：肾病未用药组肝白蛋白mRNA表达(32.09±3.23)较正常对照组(16.67±1.8)显著升高(P<0.01)；在肾病鼠中，与肾病未用药组比，黄芪当归治疗组的肝白蛋白mRNA表达(44.79±0.51)显著升高(P<0.05)，单味黄芪及黄芪的3个单组分治疗的各组大鼠肝白蛋白mRNA表达无显著差异(P>0.05)。结论：黄芪当归合剂可以增加肾病鼠肝白蛋白mRNA的水平，促进肝白蛋白的合成，改善肾病鼠蛋白质代谢紊乱。
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Effect of Chinese Herbs On Anabolism
of Protein in Nephrotic Rats
Chen Menghua，Li Liying，Pan Jisheng，et al.
(Division of Nephrology，the Affiliated Hospital of Ningxia Med.Coll.)
Abstract Objective：To investigate the mechanism of effect of Chinese herbs (Astragali-As and Angelica-An) on anabolism of protein in nephrotic rats.Methods：Liver albumin mRNA was detected by Northern Blot hybridization.Results：(1)Liver albumin mRNA of untreated nephrotic rats was significantly higher than the normal control rats (P<0.01)； (2) Liver albumin mRNA was significantly higher in nephrotic rats treated with As and An than untreated nephrotic rats (P<0.05)；But the level of albumin mRNA in other therapy group rats was of on change compared with untreated nephrotic rats (P>0.05).Conclusion：Herb As and An can increase liver albumin mRNA and protein expression in nephrotic rats.
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Key words nephrotic syndrome；protein anabolism；Chinese herb
黄芪、当归是传统中药，其药理作用已被广泛地研究。据文献报道，对不同病理类型肾病的动物模型给予黄芪当归治疗，虽未减轻肾病鼠的蛋白尿，但可提高其血浆白蛋白水平[1]。此后的研究进一步说明这种治疗在富含蛋白饮食的基础上可促进肾病鼠整体蛋白质的合成[2，3]。基于这些结果我们采用分子生物学方法观察了肾病综合征大鼠肝脏白蛋白mRNA的表达水平，旨在从分子水平上探讨黄芪、当归的治疗机理，从而为临床实践提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 SD雄性大鼠(体重100～150g)，两次尿蛋白定性阴性(加热醋酸比浊法)。采用加速肾毒血清法制成肾病鼠模型。按随机原则分为正常组、肾病组两大组，其中正常组分为①对照组(C)、②黄芪组(CA)、③黄芪当归组(CAA)；肾病组又分为①未用药组(N)、②黄芪组(NA)、③黄芪当归组(NAA)、④黄芪多糖Ⅰ(APⅠ)、⑤黄芪多糖Ⅱ(APⅡ)、⑥黄芪皂甙组(AG)。实验期间，大鼠置代谢笼内自由饮水、取食。用药组大鼠每日灌药3ml(分别含相当于黄芪、当归生药或黄芪单组分各2g)，正常对照组及肾病未用药组同时灌水3ml，开始灌药的同时给予富蛋白饮食(蛋白质摄入量为1.2g/kg.d-1)。每日留取24h尿测蛋白，2周后杀鼠取血及肝脏标本。
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1.2 主要药物及试剂来源：黄芪[Astragalus membranaceus (fisch) Bge]购自内蒙古中草药进出口公司；当归[Angelica Sinensis (Oliv)]购自北医大一院中药房。中药水煎剂的制备采用传统的煮沸法。黄芪多糖Ⅰ、黄芪多糖Ⅱ、黄芪皂甙由上海医科大学药学院提供。[α-32P]dCTP购自美国Dupont公司，Prime-α-gene labelling system购自美国Promega公司；DEPC、异硫氰酸胍购自美国Sigma公司；尼龙膜购自德国BM公司；大鼠GAPDH寡核苷酸探针由Yale大学实验室惠赠；大鼠Albumin cDNA探针由中国科学院微生物所提供，余为国产试剂。
1.3 实验方法 血浆白蛋白测定应用自动生化分析仪，采用溴钾酚氯显色法；肝组织总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法[4]，经电泳、转膜后进行Northern blot测定，所用探针为用随机引物法标记的Albumin cDNA，并用大鼠GAPDH寡核苷酸探针及18s rRNA条带来较正上样量。
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统计学处理采用析因方差分析，统计结果在SPSS/PC统计软件上完成。
2 结果
各组大鼠肝脏白蛋白mRNA的Northern杂交结果分析表明，白蛋白的mRNA条带位于2.1kb处(见图)。经激光密度扫描后各组A值(吸光度)：肾病未用药组(32.09±3.23)较正常对照鼠(16.67±1.8)明显升高达92.5%(P<0.01)；在肾病各用药鼠中，与肾病未用药组比，黄芪当归治疗组(44.79±0.51)显著升高达39.6%(P<0.05)；其它各组均无明显差异，P>0.05。见附图表。表明肾病未用药组肝白蛋白mRNA表达明显高于正常对照组，而黄芪当归治疗组肝白蛋白mRNA表达明显高于肾病未用药组。
附表 各组大鼠肝白蛋白mRNA Northern杂交
和血浆白蛋白测定结果 组 别
, 百拇医药
白蛋白mRNA(A)
血浆白蛋白(g/L)
n
±s
n±s
正常组
对 照
5
16.67±1.80
5
33.59±0.62
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黄 芪
5
17.77±1.87
5
33.75±1.40
黄芪当归
3
20.65±4.30
4
34.19±1.06
肾病组
未用药组
3
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32.09±3.23
5
27.97±2.07
黄 芪
2
30.87±1.15
3
30.43±2.01
黄芪当归
2
44.79±0.51
6
, 百拇医药
35.69±1.00
黄芪多糖Ⅰ
4
30.80±2.85
5
28.80±1.80
黄芪多糖Ⅱ
4
27.45±2.82
4
30.88±1.10
黄芪皂甙
, 百拇医药
3
26.23±2.84
5
29.78±1.53
与正常对照比，*P<0.01；与肾病未用药组比，**P<0.01
C—正常对照 N—肾病未用药组 AG—黄芪皂甙
CA—正常黄芪 NA—肾病黄芪 APⅠ—黄芪多糖1
CAA—正常黄芪当归 NAA—肾病黄芪当归 APⅡ—黄芪多糖2
附图 大鼠肝脏白蛋白mRNA Northern Blot 结果
, 百拇医药
肾病未用药组血浆白蛋白明显低于正常对照组，统计学处理有显著性差异(P<0.01)；
在肾病组中，肾病各用药组与肾病未用药组比，黄芪当归治疗组血浆白蛋白水平显著升高
(P<0.01)。见附表。
3 讨论
低白蛋白血症是肾病综合征的主要临床特征。有研究表明，肾病患者及肾病鼠白蛋白的
合成可以比正常增加2至4倍[5，6]，且在富蛋白饮食的条件下，肾病鼠肝脏白蛋白mRNA的表达
可以增加75%以上[7]，但血浆白蛋白仍可降低到正常水平的25%以下[5]。其主要原因是肝脏白蛋白合成增加的能力，不足以抵消尿中丢失的白蛋白。本实验结果表明，肾病鼠在富蛋白饮食的基础上，其肝脏白蛋白mRNA水平增加了92.5%，与文献报道相符。但有学者认为该白蛋白合成增加是伴有大量蛋白尿的大鼠在富蛋白饮食条件下的病理生理表现，它只能部分缓解机体总白蛋白库的耗竭，对整个机体白蛋白代谢紊乱的调节无明显作用，故实验大鼠仍表现为肾病综合征[7]。
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药理学研究表明黄芪的化学成分以甙类、多糖、氨基酸、微量元素为主。有报道黄芪可促进肝细胞RNA的合成[8]；从黄芪中纯化出的多糖成分可使小鼠肝中RNA的含量增加20%[9]，且有增高RNase抑制因子活力和抑制RNase活力的作用，使RNA降解减少，即增加细胞内rRNA和mRNA的含量[10]。当归对体外培养肝细胞的DNA、RNA和蛋白质合成都有促进作用[11]。本研究结果表明：肾病鼠应用黄芪当归治疗后，肝白蛋白mRNA水平明显升高，较肾病未用药组增加了39.6%，并使肾病鼠的血浆白蛋白达到正常范围，表明黄芪当归作用于核酸代谢的不同部位，最终均促进了蛋白质的合成，改善了肾病鼠蛋白质代谢紊乱，这一结果具有重要的临床实用价值，并提供了可靠的理论依据。
本实验中同时还观察到单味黄芪和黄芪的三个单组分对肾病鼠肝脏白蛋白mRNA水平无明显促进作用，但均在不同程度上增加肾病鼠血浆白蛋白水平的趋势，其中以单味黄芪和黄芪多糖Ⅱ的效果相对较好，其作用环节可能与黄芪多糖对RNase和RNase抑制因子的作用有关。
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本研究结果表明黄芪当归合剂治疗效果最好，可能系两者合用增加了疗效。
参考文献
1 章友康，王海燕，朱世乐，等.黄芪和当归治疗三种不同病理类型肾炎的实验研究.中华内科杂志，1986，25：222
2 谷 进，潘缉圣，曹 红.黄芪、当归及蛋白质入量对肾病综合征大鼠作用的研究.中华肾脏病杂志，1992，8：226
3 陈孟华，李丽美，潘缉圣，等.黄芪当归对肾病综合征大鼠肌肉蛋白质代谢的影响.中华肾脏病杂志，1997，13：153
4 Chromezynski P，Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocynatephenol chloroform extraction.Anal Biochem，1987，162：156
, 百拇医药
5 Kaysen GA，Gambertoglio J，Jiminez I，et al.Effect of dietary protein intake on albumin homeostasis in nephrotic patients.Kidney Int，1986，29：572
6 Kaysen GA，Jones HJr，Mrtin V，et al.A low protein diet restricts albumin synthesis in nephrotic rats.J Clin Invest，1989，83：1623
7 Kaysen GA，Hardin JJ，Hutchison FN.High protein diets stimulate albumin synthesis at the site of albumin mRNA transcription.Kidney Int，1989，36：S168
, 百拇医药
8 徐萃华，李燕娜.黄芪对体外培养肝细胞[5-3H]尿嘧啶核苷掺入的影响.吉林中医药，1987，2：31
9 邱 桐，白 娟，江 瑛，等.红芪多糖对小鼠几种脏器的核糖核酸和脱氧核糖核酸含量的影响.中成药，1992，14：33
10 王道苑，张 卫，许帼英.黄芪多糖对核糖核酸酶及其抑制因子平衡系统的保护作用.中西医结合杂志，1987，7：93
11 徐萃华，王 香.当归对体外培养肝细胞DNA、RNA、蛋白质合成的影响.药学通报，1984，19：53
收稿日期：1998-08-05，任义芳编辑, http://www.100md.com
单位：陈孟华：宁夏医学院附属医院肾脏内科 750004;阿丽英 潘缉圣 王海燕：北京医科大学第一医院肾病研究所 100000
关键词：肾病综合征；基因表达；中药
宁夏医学院学报990102 摘 要 目的：探讨黄芪当归改善肾病鼠蛋白质代谢紊乱的机制。方法：采用分子杂交的方法观察了肾病综合征大鼠肝白蛋白mRAN的表达。结果：肾病未用药组肝白蛋白mRNA表达(32.09±3.23)较正常对照组(16.67±1.8)显著升高(P<0.01)；在肾病鼠中，与肾病未用药组比，黄芪当归治疗组的肝白蛋白mRNA表达(44.79±0.51)显著升高(P<0.05)，单味黄芪及黄芪的3个单组分治疗的各组大鼠肝白蛋白mRNA表达无显著差异(P>0.05)。结论：黄芪当归合剂可以增加肾病鼠肝白蛋白mRNA的水平，促进肝白蛋白的合成，改善肾病鼠蛋白质代谢紊乱。
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Effect of Chinese Herbs On Anabolism
of Protein in Nephrotic Rats
Chen Menghua，Li Liying，Pan Jisheng，et al.
(Division of Nephrology，the Affiliated Hospital of Ningxia Med.Coll.)
Abstract Objective：To investigate the mechanism of effect of Chinese herbs (Astragali-As and Angelica-An) on anabolism of protein in nephrotic rats.Methods：Liver albumin mRNA was detected by Northern Blot hybridization.Results：(1)Liver albumin mRNA of untreated nephrotic rats was significantly higher than the normal control rats (P<0.01)； (2) Liver albumin mRNA was significantly higher in nephrotic rats treated with As and An than untreated nephrotic rats (P<0.05)；But the level of albumin mRNA in other therapy group rats was of on change compared with untreated nephrotic rats (P>0.05).Conclusion：Herb As and An can increase liver albumin mRNA and protein expression in nephrotic rats.
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Key words nephrotic syndrome；protein anabolism；Chinese herb
黄芪、当归是传统中药，其药理作用已被广泛地研究。据文献报道，对不同病理类型肾病的动物模型给予黄芪当归治疗，虽未减轻肾病鼠的蛋白尿，但可提高其血浆白蛋白水平[1]。此后的研究进一步说明这种治疗在富含蛋白饮食的基础上可促进肾病鼠整体蛋白质的合成[2，3]。基于这些结果我们采用分子生物学方法观察了肾病综合征大鼠肝脏白蛋白mRNA的表达水平，旨在从分子水平上探讨黄芪、当归的治疗机理，从而为临床实践提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 SD雄性大鼠(体重100～150g)，两次尿蛋白定性阴性(加热醋酸比浊法)。采用加速肾毒血清法制成肾病鼠模型。按随机原则分为正常组、肾病组两大组，其中正常组分为①对照组(C)、②黄芪组(CA)、③黄芪当归组(CAA)；肾病组又分为①未用药组(N)、②黄芪组(NA)、③黄芪当归组(NAA)、④黄芪多糖Ⅰ(APⅠ)、⑤黄芪多糖Ⅱ(APⅡ)、⑥黄芪皂甙组(AG)。实验期间，大鼠置代谢笼内自由饮水、取食。用药组大鼠每日灌药3ml(分别含相当于黄芪、当归生药或黄芪单组分各2g)，正常对照组及肾病未用药组同时灌水3ml，开始灌药的同时给予富蛋白饮食(蛋白质摄入量为1.2g/kg.d-1)。每日留取24h尿测蛋白，2周后杀鼠取血及肝脏标本。
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1.2 主要药物及试剂来源：黄芪[Astragalus membranaceus (fisch) Bge]购自内蒙古中草药进出口公司；当归[Angelica Sinensis (Oliv)]购自北医大一院中药房。中药水煎剂的制备采用传统的煮沸法。黄芪多糖Ⅰ、黄芪多糖Ⅱ、黄芪皂甙由上海医科大学药学院提供。[α-32P]dCTP购自美国Dupont公司，Prime-α-gene labelling system购自美国Promega公司；DEPC、异硫氰酸胍购自美国Sigma公司；尼龙膜购自德国BM公司；大鼠GAPDH寡核苷酸探针由Yale大学实验室惠赠；大鼠Albumin cDNA探针由中国科学院微生物所提供，余为国产试剂。
1.3 实验方法 血浆白蛋白测定应用自动生化分析仪，采用溴钾酚氯显色法；肝组织总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法[4]，经电泳、转膜后进行Northern blot测定，所用探针为用随机引物法标记的Albumin cDNA，并用大鼠GAPDH寡核苷酸探针及18s rRNA条带来较正上样量。
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统计学处理采用析因方差分析，统计结果在SPSS/PC统计软件上完成。
2 结果
各组大鼠肝脏白蛋白mRNA的Northern杂交结果分析表明，白蛋白的mRNA条带位于2.1kb处(见图)。经激光密度扫描后各组A值(吸光度)：肾病未用药组(32.09±3.23)较正常对照鼠(16.67±1.8)明显升高达92.5%(P<0.01)；在肾病各用药鼠中，与肾病未用药组比，黄芪当归治疗组(44.79±0.51)显著升高达39.6%(P<0.05)；其它各组均无明显差异，P>0.05。见附图表。表明肾病未用药组肝白蛋白mRNA表达明显高于正常对照组，而黄芪当归治疗组肝白蛋白mRNA表达明显高于肾病未用药组。
附表 各组大鼠肝白蛋白mRNA Northern杂交
和血浆白蛋白测定结果 组 别
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白蛋白mRNA(A)
血浆白蛋白(g/L)
n
±sn
±s正常组
对 照
5
16.67±1.80
5
33.59±0.62
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黄 芪
5
17.77±1.87
5
33.75±1.40
黄芪当归
3
20.65±4.30
4
34.19±1.06
肾病组
未用药组
3
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32.09±3.23
5
27.97±2.07
黄 芪
2
30.87±1.15
3
30.43±2.01
黄芪当归
2
44.79±0.51
6
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35.69±1.00
黄芪多糖Ⅰ
4
30.80±2.85
5
28.80±1.80
黄芪多糖Ⅱ
4
27.45±2.82
4
30.88±1.10
黄芪皂甙
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3
26.23±2.84
5
29.78±1.53
与正常对照比，*P<0.01；与肾病未用药组比，**P<0.01
C—正常对照 N—肾病未用药组 AG—黄芪皂甙
CA—正常黄芪 NA—肾病黄芪 APⅠ—黄芪多糖1
CAA—正常黄芪当归 NAA—肾病黄芪当归 APⅡ—黄芪多糖2
附图 大鼠肝脏白蛋白mRNA Northern Blot 结果
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肾病未用药组血浆白蛋白明显低于正常对照组，统计学处理有显著性差异(P<0.01)；
在肾病组中，肾病各用药组与肾病未用药组比，黄芪当归治疗组血浆白蛋白水平显著升高
(P<0.01)。见附表。
3 讨论
低白蛋白血症是肾病综合征的主要临床特征。有研究表明，肾病患者及肾病鼠白蛋白的
合成可以比正常增加2至4倍[5，6]，且在富蛋白饮食的条件下，肾病鼠肝脏白蛋白mRNA的表达
可以增加75%以上[7]，但血浆白蛋白仍可降低到正常水平的25%以下[5]。其主要原因是肝脏白蛋白合成增加的能力，不足以抵消尿中丢失的白蛋白。本实验结果表明，肾病鼠在富蛋白饮食的基础上，其肝脏白蛋白mRNA水平增加了92.5%，与文献报道相符。但有学者认为该白蛋白合成增加是伴有大量蛋白尿的大鼠在富蛋白饮食条件下的病理生理表现，它只能部分缓解机体总白蛋白库的耗竭，对整个机体白蛋白代谢紊乱的调节无明显作用，故实验大鼠仍表现为肾病综合征[7]。
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药理学研究表明黄芪的化学成分以甙类、多糖、氨基酸、微量元素为主。有报道黄芪可促进肝细胞RNA的合成[8]；从黄芪中纯化出的多糖成分可使小鼠肝中RNA的含量增加20%[9]，且有增高RNase抑制因子活力和抑制RNase活力的作用，使RNA降解减少，即增加细胞内rRNA和mRNA的含量[10]。当归对体外培养肝细胞的DNA、RNA和蛋白质合成都有促进作用[11]。本研究结果表明：肾病鼠应用黄芪当归治疗后，肝白蛋白mRNA水平明显升高，较肾病未用药组增加了39.6%，并使肾病鼠的血浆白蛋白达到正常范围，表明黄芪当归作用于核酸代谢的不同部位，最终均促进了蛋白质的合成，改善了肾病鼠蛋白质代谢紊乱，这一结果具有重要的临床实用价值，并提供了可靠的理论依据。
本实验中同时还观察到单味黄芪和黄芪的三个单组分对肾病鼠肝脏白蛋白mRNA水平无明显促进作用，但均在不同程度上增加肾病鼠血浆白蛋白水平的趋势，其中以单味黄芪和黄芪多糖Ⅱ的效果相对较好，其作用环节可能与黄芪多糖对RNase和RNase抑制因子的作用有关。
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本研究结果表明黄芪当归合剂治疗效果最好，可能系两者合用增加了疗效。
参考文献
1 章友康，王海燕，朱世乐，等.黄芪和当归治疗三种不同病理类型肾炎的实验研究.中华内科杂志，1986，25：222
2 谷 进，潘缉圣，曹 红.黄芪、当归及蛋白质入量对肾病综合征大鼠作用的研究.中华肾脏病杂志，1992，8：226
3 陈孟华，李丽美，潘缉圣，等.黄芪当归对肾病综合征大鼠肌肉蛋白质代谢的影响.中华肾脏病杂志，1997，13：153
4 Chromezynski P，Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocynatephenol chloroform extraction.Anal Biochem，1987，162：156
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5 Kaysen GA，Gambertoglio J，Jiminez I，et al.Effect of dietary protein intake on albumin homeostasis in nephrotic patients.Kidney Int，1986，29：572
6 Kaysen GA，Jones HJr，Mrtin V，et al.A low protein diet restricts albumin synthesis in nephrotic rats.J Clin Invest，1989，83：1623
7 Kaysen GA，Hardin JJ，Hutchison FN.High protein diets stimulate albumin synthesis at the site of albumin mRNA transcription.Kidney Int，1989，36：S168
, 百拇医药
8 徐萃华，李燕娜.黄芪对体外培养肝细胞[5-3H]尿嘧啶核苷掺入的影响.吉林中医药，1987，2：31
9 邱 桐，白 娟，江 瑛，等.红芪多糖对小鼠几种脏器的核糖核酸和脱氧核糖核酸含量的影响.中成药，1992，14：33
10 王道苑，张 卫，许帼英.黄芪多糖对核糖核酸酶及其抑制因子平衡系统的保护作用.中西医结合杂志，1987，7：93
11 徐萃华，王 香.当归对体外培养肝细胞DNA、RNA、蛋白质合成的影响.药学通报，1984，19：53
收稿日期：1998-08-05，任义芳编辑, http://www.100md.com