反相高效液相色谱法测定木属植物中黄酮类和香豆精的含量
作者：许旭东 张曙明 张聿梅 林耕 杨峻山
单位：(中国医学科学院、中国协和医科大学药用植物研究所,北京 100094)
关键词：反相高效液相色谱法；木属；黄酮类化合物；香豆精
药学学报990111.htm 摘要 目的：对
木属植物中草本和木本两个自然群进行化学分类学的研究。方法：应用反相高效液相色谱法测定木属植物中4种化学成分[neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III), 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV)],对本属11种植物中该4种成分进行了定量分析。色谱柱固定相为Supelco SIL-LC-18;流动相为40%甲醇—甲醇梯度洗脱,根据4种成分紫外吸收波长的不同而改变检测波长;流速1.0 ml.min-1;4种成分的线性范围分别为(0.5600～0.0175) μg,(0.3760～0.0118) μg,(0.2875～0.0090) μg和(0.3090～0.0097) μg，回收率分别为98.92%,98.27%,94.78%和97.41%。结果：木本自然群中香豆精成分含量较高。结论：香豆精为木本自然群区别于草本自然群的特征成分之一。
, 百拇医药
DETERMINATION OF FLAVONES AND COUMARIN IN ARALIA BY RP-HPLC
Xu Xudong (Xu XD), Zhang Shuming (Zhang SM), Zhang Yumei (Zhang YM),Lin Geng (Lin G) and Yang Junshan (Yang JS)
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College, Beijing 100094)
ABSTRACT AIM: To reveal the difference between the groups of herbal and woody in Aralia. METHODS: An accurate RP-HPLC method with variable wavelength for the determination of neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III) and 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV) in 11 species of Aralia has been developed. The analytical column used was Supelco SIL-LC-18. The mobile phase was 40% MeOH to absolute MeOH. Gradient elution was employed. The flow rate was 1.0 ml.min-1. From 0.00～8.30 min the elute was detected at 276 nm, 8.30～14.00 min at 343 nm, 14.00～20.00 min at 361 nm and 20.00～30.00 min at 272 nm. During the detection, the wavelength was changed to obtain high sensitivity and precision. The linear ranges of I～IV were 0.0175～0.5600 μg, 0.0118～0.3760 μg, 0.0090～0.2875 μg and 0.0097～0.3090 μg, respectively. The recoveries of I～IV were between 94.78% and 98.92%. RESULTS: The content of coumarin was higher in woody than in herbal. CONCLUSION: Coumarin is the specific constituent in the group of herbal, which is the difference from the woody.
, 百拇医药
KEY WORDS RP-HPLC; Aralia; flavonoids; coumarin木属(Aralia linn.)植物从形态、地理分布上可明显分为两个自然群即木本自然群和草本自然群[1,2]。通过对该属植物特征化学成分的分析找出两个自然群主要化学成分的区别，可进一步将两个自然群划分为两个独立的亚属，即木本亚属和草本亚属提供理论依据。前文[3]我们曾用反相高效液相色谱法测定了木属植物中二萜酸、三萜酸和皂甙的含量，在此基础上本文进一步建立了木属植物中4种化学成分[neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III), 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV)]的反相高效液相色谱测定法。根据这4种成分紫外吸收波长的不同，在测定过程中改变检测波长，既使各成分在最大吸收波长处检测，又避免了相邻色谱峰的干扰，提高了分析的灵敏度和准确度。4种成分在25 min内得到良好的分离，可用于样品分析。
, http://www.100md.com
实验部分
1 仪器、药品和试剂
高效液相色谱仪，包括Waters 510型，Waters 490E检测器，Waters U6K进样器，Waters Baseline 810色谱工作站(均为美国Waters液相色谱公司产品)；CX-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。
Neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III), 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV)均为作者从该属植物中提取、分离并经四谱鉴定，纯度均在95%以上。
植物样品除食用土当归，头序木由谭策铭教授采集外，其余均由本所朱兆仪教授提供并鉴定。
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重蒸馏水，甲醇(分析纯,色谱纯)等。
2 色谱条件
色谱柱:Supelco SIL-LC-18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:A:40%甲醇,B:甲醇，梯度洗脱,0～10 min,A:100%,10～25 min,A:10%,B:90%线性变化;柱温:室温;灵敏度:0.008AUFS;流速:1.0 ml.min-1;检测波长:0.00～8.30 min用276 nm检测,8.30～14.00 min用343 nm检测,14.00～20.00 min用361 nm检测,20.00～30.00 min用272 nm检测。
3 检测波长的选择
根据4种成分的紫外吸收光谱，I在214.8 nm和276 nm处有最大吸收，II在228.9 nm和343 nm处有最大吸收，III在361 nm处有最大吸收，IV在271.5 nm处有最大吸收。由于4种成分的紫外最大吸收差异较大，如只选用某一检测波长检测，将会引起灵敏度下降。因此，根据这4种成分在上述色谱条件下的保留时间(tR)及紫外光谱数据，本法选择0.00～8.30 min用276 nm检测,8.30～14.00 min用343 nm检测,14.00～20.00 min用361 nm检测,20.00～30.00 min用272 nm检测，这样既使各成分在最佳吸收波长处检测，又避免了相邻色谱峰的干扰，提高了分析的灵敏度和准确度。
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4 标准曲线
分别准确称定I～IV标准品2.24,3.76,1.15和2.06 mg,置2,2,1和2 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成标准品储备液;分别准确吸取50,20,25和30 μl置1 ml量瓶中，用甲醇定容，制成混合标准品储备液。分别将上述混合标准品储备液用甲醇稀释成4,8,16及32倍，形成5个浓度梯度的标准溶液。依次吸取10 μl进样，在上述色谱条件下检测，以峰高(X)为横坐标，成分含量(Y)为纵坐标，得回归方程、相关系数及线性范围见表1。
Tab 1 Calibration data of compounds I～IV (n=5) Compound
tR/min
Regression equation
, 百拇医药 γ
Linear range/μg
I
6.62
Y=2.8751×10-7X-1.3622×10-2
0.9991
0.018～0.560
II
8.18
Y=1.6031×10-7X-6.5835×10-3
0.9997
, 百拇医药
0.012～0.376
III
16.68
Y=2.2618×10-7X-1.7228×10-3
0.9991
0.009～0.288
IV
22.14
Y=1.4429×10-7X-4.5736×10-3
0.9994
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0.010～0.309
I. Neoliguiritin; II. 5,8-Dimethoxycoumarin; III. Isoliquritoside; IV. 8-[(2″,3″)-Prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside.
5 提取方法和样品液制备
方法同文献3。
6 方法精密度测定
取同一生药样品5份(n=5)，用上述方法测定，测得I～IV的RSD(%)分别为:1.05,1.26,2.13和2.08。证明该法是可行的。
7 加样回收率试验
, 百拇医药
准确称定头序 木粉末1 g 6份，其中3份作为对照，余3份加入一定量的混合标准品溶液混匀，自然晾干后，依上述方法制备样品液，测定回收率。结果见表2。4种成分的平均回收率为94.78%～98.92%。Tab 2 Recoveries of compounds I～IV (n=3) Compound
Added/μg
Found/μg
Recovery/%
RSD/%
I
1.120
1.108±0.060
98.92±0.01
, 百拇医药
0.48
II
0.752
0.739±0.100
98.27±0.02
0.52
III
0.575
0.545±0.180
94.78±0.02
1.06
IV
, 百拇医药 0.618
0.602±0.080
97.41±0.03
0.98
I～IV cf Tab 1.
8 样品分析
按样品液制备项操作，对各样品进行定量测定，并计算含量，结果见表3，色谱图见图1。Tab 3 Content of compounds I～IV in different species Classification
Group
Species
Content /μg.g-1
, http://www.100md.com
I
II
III
IV
Woody
Sect.Aralia
A.echinocaulis
0.047
0.016
0.022
0.117
A.decaisneana
, 百拇医药 0.019
1.744
0.182
0.051
A.chinensis var. nuda
-
0.028
0.148
0.036
A.chinensis var.dasyphylloides
0.080
0.021
, http://www.100md.com
0.053
+
Sect.Digitipanicula Hoo
A.elata
0.082
0.022
0.028
0.029
A.hupehensis
0.652
0.165
0.310
, http://www.100md.com
+
Sect.Capituli-gerae Harms
A.dasyphylla
0.019
0.022
0.018
0.050
Herbal
Sect.Genuinae Harms
A.cordata
0.085
+
, http://www.100md.com
-
4.257
Sect.Anomalae Harms
A.henryi
5.227
+
0.051
4.051
A.fargesii
-
-
+
-
, http://www.100md.com
A.atropurpurea
0.037
-
3.059
0.039
I～IV cf Tab 1. +: The content is less than 0.015 μg.g-1; -: Not detected.
Fig 1 Chromatogram of standards (A), A.cordatad (B) and A.asyphylla (C)Elute was detected at 276 nm (0.00～8.30 min), 343 nm (8.30～14.00 min), 361 nm (14.00～20.00 min) and 272 nm (20.00～30.00 min). I～IV cf Tab 1.讨论
, 百拇医药
本研究测定了11种(包括两个变种)木属植物的4种化学成分,即黄酮、二氢黄酮、查耳酮和香豆精各一种。由于该属植物从形态、地理分布明显分为两个自然群，通过本分析方法比较两个自然群上述4种化学成分的相对含量后，可清楚地发现，草本自然群中除龙眼、独活外,黄酮类成分含量较高,且不同种之间差异较大,但香豆精成分的含量均较低或检测不出,而在木本自然群中均含有香豆精成分,因而可以认为香豆精类成分是木本自然群区别于草本自然群的特征成分。结合前文[3]的结果可以发现,草本自然群和木本自然群均有各自的特征性成分,即草本自然群中二萜类成分含量较高,而木本自然群中香豆精成分含量相对较高。从而为将木属中草本和木本两个自然群划分为两个独立的亚属提供了化学分类学的依据。
基金项目：自然科学基金资助项目(39470062)
, 百拇医药
联系人 Tel:(010)62899736, Fax:(010)62898425,E-mail:xudong-xu@hotmail.com
参考文献
1 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志.第54卷.北京:科学出版社,1978.150
2 许旭东,杨峻山,朱兆仪.木属植物三萜皂甙研究进展.药学学报,1997,32∶711
3 许旭东,张曙明,杨峻山,等.反相高效液相色谱法测定 木属中二萜酸,三萜酸和三萜皂甙的含量.药学学报,1998,33∶933
收稿日期： 1998-03-23, 百拇医药
单位：(中国医学科学院、中国协和医科大学药用植物研究所,北京 100094)
关键词：反相高效液相色谱法；木属；黄酮类化合物；香豆精
药学学报990111.htm 摘要 目的：对
木属植物中草本和木本两个自然群进行化学分类学的研究。方法：应用反相高效液相色谱法测定木属植物中4种化学成分[neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III), 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV)],对本属11种植物中该4种成分进行了定量分析。色谱柱固定相为Supelco SIL-LC-18;流动相为40%甲醇—甲醇梯度洗脱,根据4种成分紫外吸收波长的不同而改变检测波长;流速1.0 ml.min-1;4种成分的线性范围分别为(0.5600～0.0175) μg,(0.3760～0.0118) μg,(0.2875～0.0090) μg和(0.3090～0.0097) μg，回收率分别为98.92%,98.27%,94.78%和97.41%。结果：木本自然群中香豆精成分含量较高。结论：香豆精为木本自然群区别于草本自然群的特征成分之一。, 百拇医药
DETERMINATION OF FLAVONES AND COUMARIN IN ARALIA BY RP-HPLC
Xu Xudong (Xu XD), Zhang Shuming (Zhang SM), Zhang Yumei (Zhang YM),Lin Geng (Lin G) and Yang Junshan (Yang JS)
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College, Beijing 100094)
ABSTRACT AIM: To reveal the difference between the groups of herbal and woody in Aralia. METHODS: An accurate RP-HPLC method with variable wavelength for the determination of neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III) and 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV) in 11 species of Aralia has been developed. The analytical column used was Supelco SIL-LC-18. The mobile phase was 40% MeOH to absolute MeOH. Gradient elution was employed. The flow rate was 1.0 ml.min-1. From 0.00～8.30 min the elute was detected at 276 nm, 8.30～14.00 min at 343 nm, 14.00～20.00 min at 361 nm and 20.00～30.00 min at 272 nm. During the detection, the wavelength was changed to obtain high sensitivity and precision. The linear ranges of I～IV were 0.0175～0.5600 μg, 0.0118～0.3760 μg, 0.0090～0.2875 μg and 0.0097～0.3090 μg, respectively. The recoveries of I～IV were between 94.78% and 98.92%. RESULTS: The content of coumarin was higher in woody than in herbal. CONCLUSION: Coumarin is the specific constituent in the group of herbal, which is the difference from the woody.
, 百拇医药
KEY WORDS RP-HPLC; Aralia; flavonoids; coumarin
木属(Aralia linn.)植物从形态、地理分布上可明显分为两个自然群即木本自然群和草本自然群[1,2]。通过对该属植物特征化学成分的分析找出两个自然群主要化学成分的区别，可进一步将两个自然群划分为两个独立的亚属，即木本亚属和草本亚属提供理论依据。前文[3]我们曾用反相高效液相色谱法测定了木属植物中二萜酸、三萜酸和皂甙的含量，在此基础上本文进一步建立了木属植物中4种化学成分[neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III), 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV)]的反相高效液相色谱测定法。根据这4种成分紫外吸收波长的不同，在测定过程中改变检测波长，既使各成分在最大吸收波长处检测，又避免了相邻色谱峰的干扰，提高了分析的灵敏度和准确度。4种成分在25 min内得到良好的分离，可用于样品分析。, http://www.100md.com
实验部分
1 仪器、药品和试剂
高效液相色谱仪，包括Waters 510型，Waters 490E检测器，Waters U6K进样器，Waters Baseline 810色谱工作站(均为美国Waters液相色谱公司产品)；CX-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。
Neoliguiritin (I), 5,8-dimethoxycoumarin (II), isoliquritoside (III), 8-[(2″,3″)-prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside (IV)均为作者从该属植物中提取、分离并经四谱鉴定，纯度均在95%以上。
植物样品除食用土当归，头序
木由谭策铭教授采集外，其余均由本所朱兆仪教授提供并鉴定。, http://www.100md.com
重蒸馏水，甲醇(分析纯,色谱纯)等。
2 色谱条件
色谱柱:Supelco SIL-LC-18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:A:40%甲醇,B:甲醇，梯度洗脱,0～10 min,A:100%,10～25 min,A:10%,B:90%线性变化;柱温:室温;灵敏度:0.008AUFS;流速:1.0 ml.min-1;检测波长:0.00～8.30 min用276 nm检测,8.30～14.00 min用343 nm检测,14.00～20.00 min用361 nm检测,20.00～30.00 min用272 nm检测。
3 检测波长的选择
根据4种成分的紫外吸收光谱，I在214.8 nm和276 nm处有最大吸收，II在228.9 nm和343 nm处有最大吸收，III在361 nm处有最大吸收，IV在271.5 nm处有最大吸收。由于4种成分的紫外最大吸收差异较大，如只选用某一检测波长检测，将会引起灵敏度下降。因此，根据这4种成分在上述色谱条件下的保留时间(tR)及紫外光谱数据，本法选择0.00～8.30 min用276 nm检测,8.30～14.00 min用343 nm检测,14.00～20.00 min用361 nm检测,20.00～30.00 min用272 nm检测，这样既使各成分在最佳吸收波长处检测，又避免了相邻色谱峰的干扰，提高了分析的灵敏度和准确度。
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4 标准曲线
分别准确称定I～IV标准品2.24,3.76,1.15和2.06 mg,置2,2,1和2 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成标准品储备液;分别准确吸取50,20,25和30 μl置1 ml量瓶中，用甲醇定容，制成混合标准品储备液。分别将上述混合标准品储备液用甲醇稀释成4,8,16及32倍，形成5个浓度梯度的标准溶液。依次吸取10 μl进样，在上述色谱条件下检测，以峰高(X)为横坐标，成分含量(Y)为纵坐标，得回归方程、相关系数及线性范围见表1。
Tab 1 Calibration data of compounds I～IV (n=5) Compound
tR/min
Regression equation
, 百拇医药 γ
Linear range/μg
I
6.62
Y=2.8751×10-7X-1.3622×10-2
0.9991
0.018～0.560
II
8.18
Y=1.6031×10-7X-6.5835×10-3
0.9997
, 百拇医药
0.012～0.376
III
16.68
Y=2.2618×10-7X-1.7228×10-3
0.9991
0.009～0.288
IV
22.14
Y=1.4429×10-7X-4.5736×10-3
0.9994
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0.010～0.309
I. Neoliguiritin; II. 5,8-Dimethoxycoumarin; III. Isoliquritoside; IV. 8-[(2″,3″)-Prenyl]-4′-methoxy-flavone-7-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranoside.
5 提取方法和样品液制备
方法同文献3。
6 方法精密度测定
取同一生药样品5份(n=5)，用上述方法测定，测得I～IV的RSD(%)分别为:1.05,1.26,2.13和2.08。证明该法是可行的。
7 加样回收率试验
, 百拇医药
准确称定头序 木粉末1 g 6份，其中3份作为对照，余3份加入一定量的混合标准品溶液混匀，自然晾干后，依上述方法制备样品液，测定回收率。结果见表2。4种成分的平均回收率为94.78%～98.92%。Tab 2 Recoveries of compounds I～IV (n=3) Compound
Added/μg
Found/μg
Recovery/%
RSD/%
I
1.120
1.108±0.060
98.92±0.01
, 百拇医药
0.48
II
0.752
0.739±0.100
98.27±0.02
0.52
III
0.575
0.545±0.180
94.78±0.02
1.06
IV
, 百拇医药 0.618
0.602±0.080
97.41±0.03
0.98
I～IV cf Tab 1.
8 样品分析
按样品液制备项操作，对各样品进行定量测定，并计算含量，结果见表3，色谱图见图1。Tab 3 Content of compounds I～IV in different species Classification
Group
Species
Content /μg.g-1
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I
II
III
IV
Woody
Sect.Aralia
A.echinocaulis
0.047
0.016
0.022
0.117
A.decaisneana
, 百拇医药 0.019
1.744
0.182
0.051
A.chinensis var. nuda
-
0.028
0.148
0.036
A.chinensis var.dasyphylloides
0.080
0.021
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0.053
+
Sect.Digitipanicula Hoo
A.elata
0.082
0.022
0.028
0.029
A.hupehensis
0.652
0.165
0.310
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+
Sect.Capituli-gerae Harms
A.dasyphylla
0.019
0.022
0.018
0.050
Herbal
Sect.Genuinae Harms
A.cordata
0.085
+
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-
4.257
Sect.Anomalae Harms
A.henryi
5.227
+
0.051
4.051
A.fargesii
-
-
+
-
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A.atropurpurea
0.037
-
3.059
0.039
I～IV cf Tab 1. +: The content is less than 0.015 μg.g-1; -: Not detected.
Fig 1 Chromatogram of standards (A), A.cordatad (B) and A.asyphylla (C)Elute was detected at 276 nm (0.00～8.30 min), 343 nm (8.30～14.00 min), 361 nm (14.00～20.00 min) and 272 nm (20.00～30.00 min). I～IV cf Tab 1.讨论
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本研究测定了11种(包括两个变种)
木属植物的4种化学成分,即黄酮、二氢黄酮、查耳酮和香豆精各一种。由于该属植物从形态、地理分布明显分为两个自然群，通过本分析方法比较两个自然群上述4种化学成分的相对含量后，可清楚地发现，草本自然群中除龙眼、独活外,黄酮类成分含量较高,且不同种之间差异较大,但香豆精成分的含量均较低或检测不出,而在木本自然群中均含有香豆精成分,因而可以认为香豆精类成分是木本自然群区别于草本自然群的特征成分。结合前文[3]的结果可以发现,草本自然群和木本自然群均有各自的特征性成分,即草本自然群中二萜类成分含量较高,而木本自然群中香豆精成分含量相对较高。从而为将木属中草本和木本两个自然群划分为两个独立的亚属提供了化学分类学的依据。基金项目：自然科学基金资助项目(39470062)
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参考文献
1 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志.第54卷.北京:科学出版社,1978.150
2 许旭东,杨峻山,朱兆仪.
木属植物三萜皂甙研究进展.药学学报,1997,32∶7113 许旭东,张曙明,杨峻山,等.反相高效液相色谱法测定 木属中二萜酸,三萜酸和三萜皂甙的含量.药学学报,1998,33∶933
收稿日期： 1998-03-23, 百拇医药