阿法D3与补肾健骨胶囊联合使用对大鼠实验性骨质疏松的影响
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中国运动医学杂志 1999年第1期第0卷 科研报道与临床总
作者：尹文哲 王 伟 敖英芳
单位：尹文哲(哈尔滨医科大学第二附属医院骨科 150086)；王伟(内蒙古牙克石林业总医院)；敖英芳(北京医科大学运动医学研究所)
关键词：维甲酸；阿法D3；补肾健骨胶囊；大鼠；骨质疏松；骨量
阿法D3与补肾健骨胶囊联合使用 对大鼠实验性骨质疏松的影响 提要 为探讨阿法D3补肾健骨胶囊联合用药对实验性大鼠骨质疏松的预防作用，选用Wistar大鼠50只，随机分5组，即正常对照组、模型组(骨质疏松)、阿法D3组、补肾健骨胶囊组和联合用药组(阿法D3+补肾健骨胶囊)。除正常组外，其它4组均在给予相应药物同时，给维甲酸口服连续8天(模型组不给其它药)。8周后，结果显示：阿法D3和补肾中药组都有效的提高了维甲酸作用下的大鼠骨密度、骨强度；扫描电镜下，骨小梁排列规则，骨小梁断裂少，小梁密集。联合用药组骨密度、骨强度和电镜骨超微结构略优于阿法D3组和补肾中药组。提示：阿法D3和补健骨胶囊在一定程度上均可预防大鼠骨质疏松；联合用药对预防大鼠骨质疏松效果更好。
, 百拇医药
以雌激素替代疗法作为防治骨质疏松的措施，因其潜在的致癌危险性及其它禁忌症而难以为人们普遍接受[1]。近年来以阿法D3防治骨质疏松，尤其是老年性或肾性骨质疏松已在临床上得到肯定。然而长期服用阿法D3可能带来的维生素D的毒性以及过敏等副作用，使其临床应用又有一定局限性[2]。为此，本实验通过阿法D3与补肾中药合用，观察这种复合制剂对预防骨质疏松的作用，推测调整复合制剂内部药物组成的剂量对骨质疏松的效果，试图为临床用药提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验药物：阿法D3，以色列梯瓦制药工业有限公司制造，批号×930247。补肾健骨胶囊由武汉健民制药厂提供。
1.2 动物：3.5～4月龄Wistar大鼠50只，平均体重250～300克，由白求恩医科大学动物实验中心提供。
, 百拇医药
1.3 仪器：Norland骨密度仪(N2780×3型，力学强度测量仪，代号CNC(济南仪器厂生产)，HITACHI520扫描电子显微镜。
1.4 方法
1.4.1 骨质疏松动物模型制备[3]：将大鼠随机分为5组，每组10只，其中第1组为正常对照组，每日每只灌服1%纤维素溶液1ml/只，连服8天。其余4组每日每只灌服维甲酸75mg/kg体重，维甲酸以1%纤维素溶液配制1.5%浓度，连服8天。
1.4.2 给药方法：如表1。
表1 各组大鼠给药方法
各组代号
组别
数目
, http://www.100md.com
每只隔日灌服
A
正常对照
10
—
B
模型
10
—
C
阿法D
10
阿法D3 0.03μg/kg
, 百拇医药
D
中药
10
中药18g/kg
E
合剂(阿法D3+中药)
10
阿法D30.03μg/kg +中药18g/kg
各用药组连续用药8周，自由饮水，喂标准大鼠饲料，8周后作如下测量。
1.4.3 测量方法 骨密度测量：取大鼠第1椎椎体，剥除附着肌肉，测椎体中段骨密度。
, 百拇医药
骨强度测量：取大鼠右股骨中段中点处(剥离附着肌肉)。
1.4.4 扫描电镜标本制备：取左股骨，剥除肌肉，将骨切成5×5mm3小块，置于4%聚甲醛与2.5%戊二醛溶液中混合固定24小时，经0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗，10%次氯酸钠溶液浸泡8小时，乙醇脱水，乙醚泡30分钟，真空喷金。
统计学处理：对测得值进行正态检验，计算各组X和SD，组间进行t检验。
2 结果
表2、表3显示，模型组骨密度显著低于其它各组，P<0.05，中药组与阿法D3组骨密度差异不明显，P>0.05，但联合用药组骨密度显著高于阿法D3组，而与中药组和阿法D3组骨强度无明显差异，但联合用药骨强度高于中药组，而与阿法D3差异并无显著性。 表2 各组骨密度测量值及统计学结果
, http://www.100md.com
组别
X(g/cm2)
SD
每2组比较后概率
A
0.142
0.008
PAB<0.01
PAC>0.05
B
0.093
0.009
, 百拇医药
PAD>0.05
PAE>0.1
C
0.1362
0.006
PBC<0.05
PBD<0.05
D
0.135
0.005
PBE<0.01
, 百拇医药
PCD>0.05
E
0.141
0.014
PCE<0.05
PDE>0.05
表3 各组骨强度测量值及统计学结果
组别
X(g/cm)
SD
每2组比较后概率
, http://www.100md.com A
5.01
0.83
PAB<0.05
PAC>0.05
B
3.21
0.67
PAD>0.05
PAE>0.05
C
4.72
, 百拇医药
0.64
PBC<0.05
PBD<0.05
D
4.62
0.61
PBD<0.01
PCD>0.05
E
4.93
0.79
PCE>0.05
, http://www.100md.com
PDE<0.05
扫描电镜观察：与正常组相比，模型组骨小梁破坏明显，变细，变尖、断裂，完整性丧失，骨陷窝内纤维松散，内容空荡。中药组与阿法D3组骨小梁部分断裂，变细、变尖也少，较模型组排列规则，但骨小梁破坏不明显，偶有几个陷窝融合，部分胶原纤维充填骨陷窝，促联合用药组骨小梁排列较中药组与阿法D3组更规则、致密，无明显变细变尖，陷窝内纤维较多。
3 讨论
本实验显示，经维甲酸灌服的大鼠骨密度、骨强度明显低于其它各组，且电镜下骨小梁稀疏、变尖、断裂明显，这表明维甲酸可诱发大鼠骨质疏松，由此建立了骨质疏松动物模型，与贾冬、翁世芳等报道相一致[4]。
据报道[5]，骨质疏松患者1，25(OH)2D3水平常为低值，并且通过1，25(OH)2D3治疗，骨量可恢复正常。本研究中阿法D3组的骨密度增加，反映了骨量明显增加，同时本组骨强度也明显增加。近年研究发现骨量减少并不一定发生骨折，骨折危险度取决于骨强度。骨的几何形态决定骨的结构力学特性[6]，骨结构的微小变化就可使骨强度明显下降[7，8]，本组电镜下即可看到骨小梁致密，排列较规则，胶原纤维较多沉于骨陷窝中，以上这些变化可能是骨强度增高的表现。因上认为阿法D3能够预防大鼠骨质疏松。
, 百拇医药
中药组与阿法D3组相比，在骨密度、骨强度和电镜下骨小梁观察情况方面差异不显著，这表明，补肾中药可预防大鼠骨质疏松。中医理论认为肾藏精，主骨，若肾虚，肾的主骨功能衰退，骨细胞表面的成骨细胞破损，生物反馈调节作用丧失，导致骨异常吸收[9]。补肾中药能通过恢复下丘脑—垂体靶腺器官的功能活动，促进骨钙沉积，抑制骨吸收，加快骨形成，延缓骨丢失，甚至可增加骨量[10]。
联合药物组在骨密度方面高于阿法D3组，在骨强度方面高于中药组，但电镜下，联合药物组的骨小梁致密，排列规则性及完整性及胶原纤维的多少都优于阿法D3和中药组，这就表明联合用药能预防大鼠骨质疏松，且在一定程度上优于单一用药。这是因为阿法D3经肝脏迅速转化为1，25(OH)2D3后在体内调节钙和磷的平衡，增加肠钙、磷的吸收，增加成骨细胞活性，促进骨矿化，加速骨形成，降低血浆PTH和减少骨钙消溶。以上过程可能与补肾中药对骨沉积、抑制骨吸收、加速骨形成、增加骨量有协同作用。
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在联合使用药物预防骨质疏松时，我们认为应该调整阿法D3和补肾健骨胶囊的剂量，最大限度地提高骨量，尽可能减少药物的毒副作用，这项工作有待进一步研究。
4.参考文献
[1]Henderson BE.The cancer question An overview of recent epidemiologic and retcospective data.Am J obste Gynecol 1989,161(4):1859.
[2]ORMIMO h SHIRAKIM HAYASHIT.Redued Ouurrence of vertebral crush fractures in senile osteoporosi_s treated with(a_oh)_vitamin D3 Bone Miner 1987,3:47_52.
, 百拇医药
[3]刘忠厚主编.大鼠骨密度测定在骨质疏松模型研制中的应用.化学工业出版社.1994，10：270.
[4]贾冬等.骨疏康冲剂对大鼠实验性骨质疏松的影响.中成药.1996；18(2)：32_33.
[5]刘忠厚主编.骨质疏松病因学.化学工业出版社.1992年4月第1版，p141.
[6]Mazess RB,Fracture risk.A rote for compact bone.Calif Tissue Int 1990,47:191.
[7]Martin RB.Deteminants of the mecanical properties of bone.J Biomech 1991；24(suppl 1):79.
[8]Bagi CM,Miller SC,Bowan BM,et al.Differences in cortical bone in overloaded and under loaded femur from orariectomied rats:Comparison of bone morphomebry with trorsional testing.Bone 1992,13:35.
[9]张菊灵.中华骨科杂志.1990，(4)：300_302.
[10]李炳如等.补肾中药对下丘脑——垂体性腺轴功能的影响.中医杂志.1984，(7)：63_5.
(1998.09.30收稿), http://www.100md.com
单位：尹文哲(哈尔滨医科大学第二附属医院骨科 150086)；王伟(内蒙古牙克石林业总医院)；敖英芳(北京医科大学运动医学研究所)
关键词：维甲酸；阿法D3；补肾健骨胶囊；大鼠；骨质疏松；骨量
阿法D3与补肾健骨胶囊联合使用 对大鼠实验性骨质疏松的影响 提要 为探讨阿法D3补肾健骨胶囊联合用药对实验性大鼠骨质疏松的预防作用，选用Wistar大鼠50只，随机分5组，即正常对照组、模型组(骨质疏松)、阿法D3组、补肾健骨胶囊组和联合用药组(阿法D3+补肾健骨胶囊)。除正常组外，其它4组均在给予相应药物同时，给维甲酸口服连续8天(模型组不给其它药)。8周后，结果显示：阿法D3和补肾中药组都有效的提高了维甲酸作用下的大鼠骨密度、骨强度；扫描电镜下，骨小梁排列规则，骨小梁断裂少，小梁密集。联合用药组骨密度、骨强度和电镜骨超微结构略优于阿法D3组和补肾中药组。提示：阿法D3和补健骨胶囊在一定程度上均可预防大鼠骨质疏松；联合用药对预防大鼠骨质疏松效果更好。
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以雌激素替代疗法作为防治骨质疏松的措施，因其潜在的致癌危险性及其它禁忌症而难以为人们普遍接受[1]。近年来以阿法D3防治骨质疏松，尤其是老年性或肾性骨质疏松已在临床上得到肯定。然而长期服用阿法D3可能带来的维生素D的毒性以及过敏等副作用，使其临床应用又有一定局限性[2]。为此，本实验通过阿法D3与补肾中药合用，观察这种复合制剂对预防骨质疏松的作用，推测调整复合制剂内部药物组成的剂量对骨质疏松的效果，试图为临床用药提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验药物：阿法D3，以色列梯瓦制药工业有限公司制造，批号×930247。补肾健骨胶囊由武汉健民制药厂提供。
1.2 动物：3.5～4月龄Wistar大鼠50只，平均体重250～300克，由白求恩医科大学动物实验中心提供。
, 百拇医药
1.3 仪器：Norland骨密度仪(N2780×3型，力学强度测量仪，代号CNC(济南仪器厂生产)，HITACHI520扫描电子显微镜。
1.4 方法
1.4.1 骨质疏松动物模型制备[3]：将大鼠随机分为5组，每组10只，其中第1组为正常对照组，每日每只灌服1%纤维素溶液1ml/只，连服8天。其余4组每日每只灌服维甲酸75mg/kg体重，维甲酸以1%纤维素溶液配制1.5%浓度，连服8天。
1.4.2 给药方法：如表1。
表1 各组大鼠给药方法
各组代号
组别
数目
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每只隔日灌服
A
正常对照
10
—
B
模型
10
—
C
阿法D
10
阿法D3 0.03μg/kg
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D
中药
10
中药18g/kg
E
合剂(阿法D3+中药)
10
阿法D30.03μg/kg +中药18g/kg
各用药组连续用药8周，自由饮水，喂标准大鼠饲料，8周后作如下测量。
1.4.3 测量方法 骨密度测量：取大鼠第1椎椎体，剥除附着肌肉，测椎体中段骨密度。
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骨强度测量：取大鼠右股骨中段中点处(剥离附着肌肉)。
1.4.4 扫描电镜标本制备：取左股骨，剥除肌肉，将骨切成5×5mm3小块，置于4%聚甲醛与2.5%戊二醛溶液中混合固定24小时，经0.1M二甲砷酸钠缓冲液冲洗，10%次氯酸钠溶液浸泡8小时，乙醇脱水，乙醚泡30分钟，真空喷金。
统计学处理：对测得值进行正态检验，计算各组X和SD，组间进行t检验。
2 结果
表2、表3显示，模型组骨密度显著低于其它各组，P<0.05，中药组与阿法D3组骨密度差异不明显，P>0.05，但联合用药组骨密度显著高于阿法D3组，而与中药组和阿法D3组骨强度无明显差异，但联合用药骨强度高于中药组，而与阿法D3差异并无显著性。 表2 各组骨密度测量值及统计学结果
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组别
X(g/cm2)
SD
每2组比较后概率
A
0.142
0.008
PAB<0.01
PAC>0.05
B
0.093
0.009
, 百拇医药
PAD>0.05
PAE>0.1
C
0.1362
0.006
PBC<0.05
PBD<0.05
D
0.135
0.005
PBE<0.01
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PCD>0.05
E
0.141
0.014
PCE<0.05
PDE>0.05
表3 各组骨强度测量值及统计学结果
组别
X(g/cm)
SD
每2组比较后概率
, http://www.100md.com A
5.01
0.83
PAB<0.05
PAC>0.05
B
3.21
0.67
PAD>0.05
PAE>0.05
C
4.72
, 百拇医药
0.64
PBC<0.05
PBD<0.05
D
4.62
0.61
PBD<0.01
PCD>0.05
E
4.93
0.79
PCE>0.05
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PDE<0.05
扫描电镜观察：与正常组相比，模型组骨小梁破坏明显，变细，变尖、断裂，完整性丧失，骨陷窝内纤维松散，内容空荡。中药组与阿法D3组骨小梁部分断裂，变细、变尖也少，较模型组排列规则，但骨小梁破坏不明显，偶有几个陷窝融合，部分胶原纤维充填骨陷窝，促联合用药组骨小梁排列较中药组与阿法D3组更规则、致密，无明显变细变尖，陷窝内纤维较多。
3 讨论
本实验显示，经维甲酸灌服的大鼠骨密度、骨强度明显低于其它各组，且电镜下骨小梁稀疏、变尖、断裂明显，这表明维甲酸可诱发大鼠骨质疏松，由此建立了骨质疏松动物模型，与贾冬、翁世芳等报道相一致[4]。
据报道[5]，骨质疏松患者1，25(OH)2D3水平常为低值，并且通过1，25(OH)2D3治疗，骨量可恢复正常。本研究中阿法D3组的骨密度增加，反映了骨量明显增加，同时本组骨强度也明显增加。近年研究发现骨量减少并不一定发生骨折，骨折危险度取决于骨强度。骨的几何形态决定骨的结构力学特性[6]，骨结构的微小变化就可使骨强度明显下降[7，8]，本组电镜下即可看到骨小梁致密，排列较规则，胶原纤维较多沉于骨陷窝中，以上这些变化可能是骨强度增高的表现。因上认为阿法D3能够预防大鼠骨质疏松。
, 百拇医药
中药组与阿法D3组相比，在骨密度、骨强度和电镜下骨小梁观察情况方面差异不显著，这表明，补肾中药可预防大鼠骨质疏松。中医理论认为肾藏精，主骨，若肾虚，肾的主骨功能衰退，骨细胞表面的成骨细胞破损，生物反馈调节作用丧失，导致骨异常吸收[9]。补肾中药能通过恢复下丘脑—垂体靶腺器官的功能活动，促进骨钙沉积，抑制骨吸收，加快骨形成，延缓骨丢失，甚至可增加骨量[10]。
联合药物组在骨密度方面高于阿法D3组，在骨强度方面高于中药组，但电镜下，联合药物组的骨小梁致密，排列规则性及完整性及胶原纤维的多少都优于阿法D3和中药组，这就表明联合用药能预防大鼠骨质疏松，且在一定程度上优于单一用药。这是因为阿法D3经肝脏迅速转化为1，25(OH)2D3后在体内调节钙和磷的平衡，增加肠钙、磷的吸收，增加成骨细胞活性，促进骨矿化，加速骨形成，降低血浆PTH和减少骨钙消溶。以上过程可能与补肾中药对骨沉积、抑制骨吸收、加速骨形成、增加骨量有协同作用。
, http://www.100md.com
在联合使用药物预防骨质疏松时，我们认为应该调整阿法D3和补肾健骨胶囊的剂量，最大限度地提高骨量，尽可能减少药物的毒副作用，这项工作有待进一步研究。
4.参考文献
[1]Henderson BE.The cancer question An overview of recent epidemiologic and retcospective data.Am J obste Gynecol 1989,161(4):1859.
[2]ORMIMO h SHIRAKIM HAYASHIT.Redued Ouurrence of vertebral crush fractures in senile osteoporosi_s treated with(a_oh)_vitamin D3 Bone Miner 1987,3:47_52.
, 百拇医药
[3]刘忠厚主编.大鼠骨密度测定在骨质疏松模型研制中的应用.化学工业出版社.1994，10：270.
[4]贾冬等.骨疏康冲剂对大鼠实验性骨质疏松的影响.中成药.1996；18(2)：32_33.
[5]刘忠厚主编.骨质疏松病因学.化学工业出版社.1992年4月第1版，p141.
[6]Mazess RB,Fracture risk.A rote for compact bone.Calif Tissue Int 1990,47:191.
[7]Martin RB.Deteminants of the mecanical properties of bone.J Biomech 1991；24(suppl 1):79.
[8]Bagi CM,Miller SC,Bowan BM,et al.Differences in cortical bone in overloaded and under loaded femur from orariectomied rats:Comparison of bone morphomebry with trorsional testing.Bone 1992,13:35.
[9]张菊灵.中华骨科杂志.1990，(4)：300_302.
[10]李炳如等.补肾中药对下丘脑——垂体性腺轴功能的影响.中医杂志.1984，(7)：63_5.
(1998.09.30收稿), http://www.100md.com