子宫颈刮片中人乳头瘤病毒的基因分型
作者：王金花 Judith Bakkers Willem J G Melchers
单位：750004 银川 宁夏医学院附属医院(王金花)；荷兰奈梅亨大学医院医学微生物病毒分子生物学研究室(Judith Bakkers Willem J G Melchers)
关键词：人乳头瘤病毒；聚合酶链反应；线样探针分析；基因分型
中华实验和临床病毒学杂志990102 【摘要】 目的 确定不同型人乳头瘤病毒(HPV)感染的自然历程以及其持续感染在子宫颈癌发展过程中的作用。方法 应用聚合酶链反应检测荷兰155名妇女子宫刮颈片中的HPV DNA，应用线样探针分析法(LiPA)进行，包括HPV6，11，16，18，31，33，35，40，42，43，44，45，51，52，56和58的基因分型。结果 155例妇女子宫颈刮片中HPV DNA检出率为60%，其中在宫颈细胞学检查正常或仅有炎症病变的妇女中HPV DNA阳性率为43%，而在宫颈细胞增生不良或宫颈细胞癌的妇女其阳性率为81.2%。93例HPV阳性的标本中，89例利用LiPA成功地作出了基因分型，其中单独一型HPV感染为49例，涉及11种不同基因型HPV，最常见的型别为HPV 16，占单独感染的51%(25/49)；另40例为不同型别HPV重叠感染，涉及所有16种HPV基因型别，二重感染占主导地位(n=25)，同时也检测出其它多重感染。4例HPV阳性的标本应用LiPA未能作出基因分型，DNA序列分析显示这4例为HPV 66感染，此型别不包括在LiPA所标记的探针内。12例随诊资料显示了LiPA的物异性及高度的重复性。结论 线样探针分析法可以用于子宫颈癌普查计划及随诊病例的研究。
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Genotyping of human papillomavirus genotyps in cervic al scrapes by line probe assay WANG Jinhua, Judith Bakkers, Willem J G Melchers. Affiliated Hospital of Ningxia Medical College, Yinchuan 750004
【Abstract】 Objective To pursue the further development of a practical HPV genotyping system applicable for mass screening. Methods Cervical scrapes from 155 women were tested for the presence of HPV using a general-primer based PCR. A reverse hybridization assayor, the line probe assay (LiPA) was used for genotyping 16 different HPV types(HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 56, 58)simultaneously. Results 93(60%) out of 155 specimens tested were positive for HPV DNA by PCR. The HPV positivity amongst the group of women with no cervical abnormality was 43%, while that in women with cervical dysplasia and cervical cancer was 81.2% PCR products from 89 HPV positive cases were genotyped by LiPA, of which 49 cases were single HPV infected concerning 11 different HPV types and the commonest type was HPV-16, occurring in 25(51%) of all single HPV infected cases. The other 40 specimens contained multiple HPV types comprising 16 different HPV types. Although double infections(n=25) prevailed, triple(n=9),quadruple(n=3) and quintuple(n=3) infections were also found. PCR products of four HPV positive cases failed to be classified by LiPA. Sequencing analysis revealed that these 4 cases were HPV-66 which was not included in LiPA probes. Follow-up data of 12 cases confirmed the HPV genotyping results. Conclusion The LiPA for HPV genotyping is easy to perform. It allows accurate and rapid identification of 16 different HPV types in cervical scrapes and will facilitate HPVdetection as well as genotyping in cervical cancer screening programs.
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【Key words】 Human papillomavirus Polymerase chain reaction Line probe assay Genotyping
过去近二十年的研究证实了一定基因型的人乳头瘤病毒(HPV)与子宫颈癌的发病密切相关[1-3]。迄今为止，已经有85种以上不同型别的HPV被发现，其中30种HPV可以感染生殖器粘膜[4]。根据系统发育关系以及其在良性或恶性子宫颈病变的表现，这些HPV可以分成低危险型和高危险型。
已有研究显示，在子宫颈癌普查计划中和对轻度细胞学异常病人的追踪过程中，HPV的检测有着潜在的应用价值[5，6]。细胞和组织学的检查可以确定有无 HPV感染，但不能确定HPV的基因型别。由于HPV体外增殖的困难，至今为止尚无可靠的血清学分型方法。现在用于HPV基因分型的方法有[7]：①HPV型特异性探针使用在原位杂交，点印迹法，Southern印迹法和滤膜原位杂交；②用型物异性引物扩增病毒DNA；③杂交(DNA-RNA)捕捉法；④DNA序列分析。另外，对于新近发现的HPV型别尚没有特异的引物。因此，为了子宫颈癌人群普查的需要，建立一种实用的HPV基因分型方法有着十分重要的意义。
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线样探针(LiPA)已被应用在丙型肝炎病毒的基因分型[8]、人白细胞抗原的分型[9]以及临床标本中某些细菌病原体的基因分型[10，11]。我们使用敏感的PCR方法扩增高度保守的HPV病毒的L1区，在长条形尼龙膜上水平固定16种HPV L1区型特异性的寡核苷酸探针，然后使扩增产物与探针杂交。使用这一新的方法，可以同时检测子宫颈刮片的16种不同的HPV基因型别。
1 材料和方法
1.1 研究对象及标本采集 子宫颈刮片取自155名参加荷兰奈梅亨地区子宫颈癌普查的妇女，连续出现两次不正常宫颈刮片后转至荷兰奈梅亨大学医院妇科门诊，在进行阴道镜检查时作两份子宫颈刮片。首先进行细胞学检查分型，分型标淮采用荷兰通用的KOPAC标淮[12]：PapⅠ正常细胞，PapⅡ炎症， Pap Ⅲa轻度或中度增生不良，PapⅣ原位癌，PapⅤ侵袭性癌。其余的宫颈刮片组织用作准备石蜡切片标本。
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1.2 HPV DNA的提取 将一份3 μm厚的石蜡切片放置于反应管中，另入200 μl 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，内含1 mmol/L乙二胺四乙酸及0.2%吐温-20，然后加入蛋白酶K60 μg，56℃温育过夜。次日煮沸灭活蛋白酶K，离心10 min(11 000 r/min)。10 μl上清液直接用作PCR检测。 1.3 PCR扩增和产物测定 一组PCR引物混合物与保守的L1区的多型HPV互补, 在其5′端用生物素标记, 40 μl PCR反应液(200 mmol/L氯化钾, 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸, 1.5 mmol/L氯化镁, dNTP各200 mmol/L, 1U Taq DNA聚合酶以及100 pmol/L的引物)中加入10 μl HPV DNA提取液。反应条件： 94℃变性30 s, 45℃退火45 s, 72℃延伸45 s，共40个循环。
1.4 线样探针分析 16种HPV型特异性寡核苷酸探针是基于65bp扩增片段内的型特异性差异而设计的，包括HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 56和HPV58。用酶促法在此寡核苷酸的3'端加上多聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸尾巴, 将此探针平行线样加入尼龙膜, 在其上端作一偶联对照, 置于80℃烤箱中12 h, 使其探针固定于膜上。然后切割成4 mm宽的长条。线样探针分析的操作过程与其应用在丙型肝炎病毒基因分型方法相同[13]。
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1.5 DNA序列分析 应用Original TA CloningR ○试剂盒(Invitrogen corporation)，将新鲜的HPV DNA PCR扩增片段连接至pCRR ○2.1质粒载体中，使用Ampli CyclingTM序列分析盒测定插入片段的DNA序列。
2 结果
使用高度保守的HPV L1区的一组引物扩增多种型别的HPV DNA, 经40个扩增循环后, 用3%琼脂糖凝胶电泳检测HPV扩增产物。图1 显示HPV DNA扩增片段长度为65bp。155份子宫颈刮片标本中93例HPV DNA阳性, 阳性率为60%。其中在宫颈细胞学检查正常或仅有炎症病变(Pap I 和PapII组)和妇女中, HPV DNA阳性率为43%(37/86), 而在宫颈细胞增生不良或宫颈细胞癌(Pap III/IV/V组)的妇女中, 其阳性率为81.2%(56/69)。
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图1 子宫颈刮片中HPV DNA的PCR扩增结果
9：低梯度核酸标准参照物；6：空白对照；7：阴性对照；8：阳性对照。第1-5列为检测标本
Fig.1 Analysis of HPV DNAs in cervical scrpes with PCR
9: Molecular weight standard. 6: Mock. 7: Negative control.
8: Positive control. 1-5: tested samples
用线样探针分析法93例HPV阳性的PCR扩增产物进一步检测，在89例标本鉴定出HPV的基因型别，涉及LiPA条上所标记的所有16种HPV型(图2)。另外，4例仅显示了偶联对照线，而与16种不同型的HPV探针无特异性结合，说明这4例可能是此16种HPV型以外的型别，称之为HPV X。 对这4例的PCR克隆序列分析证明为HPV 66。HPV基因分型结果见表1，其中单独一型HPV感染为49例，涉及11种不同型HPV，最常见的型别为HPV 16，占单独感染的51%(25/49)。另40例为不同型别HPV重叠感染，涉及所有16种HPV型别，二重感染占主导(n=25)，同时也检测出其它多重感染，如三重(n=9)，四重(n=3)，五重(n=3)。
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图2 HPV基因的线样探针分析结果
右侧平等线条显示LiPA 条上16种型特异性探针所固定的位置, A至K 显示11种HPV基因型单独感染在LiPA条上的带形, 由左列示L为HPV16/31 双重感染, M列为HPV16/33/45三重感染, N列为HPV6/11/16/18四重感染, O列为HPV18/31/35/40/44五重感染
Fig. 2 Analysis of HPV genotypes with LiPA.
The horizontal lines on the right indicate the positions of 16 different specific HPV probes fixed in the membranes. A to K show the patterns of single infection of 11 various HPVs in LiPA assays, from left to right they are HPV6,11, 16, 18, 31, 33, 35, 44, 52, 56 and 58, L shows a double infection of HPV16/31.M is a triple infection of HPV16/33/45. N is Quadruple infection with HPV 6/11/16/18. O is quintuple infection with HPV 18/31/35/40/44
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为了观测HPV感染状态与宫颈上皮细胞病 变程度(Pap分类)的关系, 我们将本组研究涉及的17种HPV型别分为两组, HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 66属于高危组, 而HPV6, 11, 40, 42, 43, 44属于低危险组。图3显示, 随着宫颈上皮细胞病 变程度的加重, 高危险组HPV感染比例逐渐升高, 在PapI, PapII, PapIIIa组中其感染率分别为22.5%, 47.8%, 75.5%；而在Pap IIIb/VI/V组中, 其感染率达85.0%, 相反, 低危组HPV感染及无HPV感染的比例随着宫颈上皮细胞病变程度的加重却逐渐下降, 其差异有统计学意义。由此进一步证实了子宫颈癌的发生与高危险组HPV感染有密切的关系。
为了研究HPV感染对宫颈上皮细胞病变的短期及长期的影响，所有的病人3个月后重复宫颈刮片细胞学检查及HPV检测。至目前为止，此155例病例中有12例有随诊资料。表2显示 11例(11/12)的HPV感染状况及基因分型在两次检测中完全一致，另一例在第2次检查中由单独HPV31感染变成HPV18及HPV31重叠感染。
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表1 子宫颈刮片中HPV感染及其基因分型与细胞学Pap分类的结果
Tab.1 HPVoccurrence in cervical scrapes from women, the genotyping and Pap classification Pap 分类
Pap classification
HPV 阴性
HPV negative
HPV 阳性及其基因分型
HPV positive and genotypes
6
11
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16
18
31
33
35
40
42
43
44
45
51
52
56
58
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X
D
T
>T
Ⅰ
40
27
1
1
3
1
4
2
1
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Ⅱ
46
22
2
1
4
1
1
2
1
2
5
3
Ⅲa
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49
10
2
11
2
1
4
1
12
3
Ⅲb
12
1
2
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2
1
1
4
1
3
Ⅳ
6
1
4
1
Ⅴ
2
1
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1
合计
Total
155
62
5
2
25
3
2
3
1
1
4
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2
1
4
25
9
6
注：X：LiPA未能分型的HPV DNA；D：HPV双重感染；T：HPV三重感染；>T：多于三重感染
Notes: X:can not be genotyped by LiPA. D:HPV double infection. T:HPV triple infection. >T:more than triple infection
3 讨论
, http://www.100md.com 子宫颈刮片普查有效地减少了子宫颈癌和死亡率，但这一普查计划花费太大，组织复杂，因此常被认为是低效率的普查[14，15]。而宫颈细胞的HPV DNA的检测提供了一种可能是自动的和廉价的论断方法，而且此检查排除了宫颈细胞学检查的主观性和样本采集中的问题以及阴道镜检查的费用，更重要的是，HPV DNA的基因分型对确定不同型的HPV感染的自然历程以及其持续感染在子宫颈癌发展过程中的作用有着十分重要的意义[16～18]。 表2 12例随诊病例的资料
Tab.2 Data of 12 follow-up cases 第一次采样
First smple collection
第二次采样
Second sample collection
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Pap
HPV-基因型
HPV-genotypes
Pap
HPV-基因型
HPV-genotypes
Ⅲa
16
Ⅱ
16
0
31
Ⅲa
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18，31
Ⅲa
52
Ⅲa
52
Ⅲb
18
Ⅲb
18
Ⅱ
-
Ⅱ
-
0
, 百拇医药
-
Ⅱ
-
Ⅱ
-
0
-
Ⅲb
18
Ⅲb
18
Ⅱ
16
Ⅲa
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16
Ⅲa
52
Ⅲa
52
Ⅲa
6，16，31
Ⅲa
6，16，31
Ⅱ
-
Ⅱ
-
, http://www.100md.com 在以往的研究中，HPV基因分型多局限于六种常见的HPV型别，即HPV6, 11, 16, 18, 31和HPV33，因而在这些研究中存在着相当大比例的不能明确型别的HPV感染，称之为HPVX。而LiPA可以作出16种不同的HPV基因分型，所以尽可能减少了HPVX的发生。本研究中93例HPV感染，89例使用LiPA作出了基因分型，成功率为95.7%。4例HPV X经序列测定确定是探针条上标记的26种HPV以外的型别，因而更证实了探针的型特异性。随诊资料中两次采集的样本以PCR及LiPA检查，得到了完全一致的HPV阳性率及一致的基因型别，显示了LiPA的特异性和高度的重复性。
另外，有研究表明HPV多重感染是子宫颈上皮细胞癌发生的一个危险因素[19]，因此能否确定重叠感染是判定一实验方法优劣的一项指标。LiPA最大的优点是在一个条型尼龙膜上固定了16种不同探针，可以同时检测此16种不同HPV型别，这极大的便利了重叠感染的检测本组病例重叠感染多达44.9%，且有3个病例为五种不同型别的HPV感染。 参考文献
, 百拇医药
1 World Health Organization. Cervical cancer vaccine prospects. World Health Forum, 1994,15:417.
2 Bosch F X. Mumoa N, de Sanjose S, et al. Risk factors for cervical cancer in Columbia and Spain. Int J Cancer, 1992,52:750-758.
3 Schiffman M H. Recent progress in defining the eplidemiology of human papillomavirus infetion and cervical neoplasia. J Natl cancer Inst, 1992,84:394-398.
4 Van Ranst M, Tacheay R, Burk R D. Human papillomaviruses: a never ending story?In: Papillomavirus reviews: Current research on papillomaviruses. Lacey C, ed. Leeds, United Kingdom, Leeds Univetsity Press, 1996:1-20.
, 百拇医药
5 Cuzick J, Szarewski A, Terry G, et al. Human papillomavirus testing in primary cervical screening. Lancet, 1995, 345:1533-1536.
6 Jenkins D, Shetlaw Johnaon C, Gallivan S. Can papillomavirus testing be used to improve cervical cancer screening? Int J Cancet, 1996, 65:768-773.
7 Rroman A, Fife K H. Human papillomaviruses: are we ready to type? Clin Microbiol Rew, 1989,2:166-190.
8 Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, et al . Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J Gen Virol, 1993,74:1093-1102.
, 百拇医药
9 Thonnard J, Deldime F, Heuterspreute M, et al. HLA class Ⅱ genotyping:two assay systems compared.Clin Chem, 1995,41:553-556.
10 De Beenhouwet H, Lhiang Z, Jannes G, et al . Rapid detection of rifampicin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tubet Lung Dis, 1995,76:425-430.
11 Rijpens N P, Jannes G, Van Asbroeck M, et al. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse bybridization with 16S-23S rRNA spacer probes. Appl Environ Microbiol, 1996,62:1683-1688.
, 百拇医药
12 De Roda H, Walboometrs A M J M, Meije C J, et al. Analysis of cytomorphologically abnormal cetvical scrapes for the presence of 27 mucosotropic human papillomavirus genotypes, using polymerase chain reaction. Int J Cancet, 1994,56:802-806.
13 Stuyvet L, Wyseur A, van Arnhem W, et al.Second-generation line probe assay for hepatitis C virus genotyping. J Clin. Microbiol. 1996,34:2259-2266.
14 Benedet J L, Anderson G H, Matisic J P. A comprehensive program for cervical cancer detection and management. Am J Obstet Gynecol 1992,166:1254-1259.
, 百拇医药
15 Smith A, Elkind A, Eardley A. Making cervical screening work. BMJ, 1989,298:1662-1664.
16 Hildesheim A, Schiffnan M H, Gravitt P E, et al. Petsistence of type-specific human papillomavirus infection among cytologically normal women. J Infect Dis, 1994,169:235-240.
17 Ho G Y, Burk R D, Klein S, et al. Persistent genital human papillomavirus infection as a risk factor for persistent cervical dysplasia. J Natl Cancer Inst, 1995,87:1365-1371.
, 百拇医药
18 Remmink A J, Walboonets J M, Helmmethorst T J, et al. The pressence of persistent high-risk HPV genotypes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: natural history up to 36 months. Int J Cancer, 1995,61:306-311.
19 Liaw K L, Hsing A W, Chen C J, et al. Human papillomavirus and cervical neoplasia a case-control study in Taiwan. Int J Cancer 1995,565-571.
(收稿：1998-06-06 修回：1998-10-04), 百拇医药
单位：750004 银川 宁夏医学院附属医院(王金花)；荷兰奈梅亨大学医院医学微生物病毒分子生物学研究室(Judith Bakkers Willem J G Melchers)
关键词：人乳头瘤病毒；聚合酶链反应；线样探针分析；基因分型
中华实验和临床病毒学杂志990102 【摘要】 目的 确定不同型人乳头瘤病毒(HPV)感染的自然历程以及其持续感染在子宫颈癌发展过程中的作用。方法 应用聚合酶链反应检测荷兰155名妇女子宫刮颈片中的HPV DNA，应用线样探针分析法(LiPA)进行，包括HPV6，11，16，18，31，33，35，40，42，43，44，45，51，52，56和58的基因分型。结果 155例妇女子宫颈刮片中HPV DNA检出率为60%，其中在宫颈细胞学检查正常或仅有炎症病变的妇女中HPV DNA阳性率为43%，而在宫颈细胞增生不良或宫颈细胞癌的妇女其阳性率为81.2%。93例HPV阳性的标本中，89例利用LiPA成功地作出了基因分型，其中单独一型HPV感染为49例，涉及11种不同基因型HPV，最常见的型别为HPV 16，占单独感染的51%(25/49)；另40例为不同型别HPV重叠感染，涉及所有16种HPV基因型别，二重感染占主导地位(n=25)，同时也检测出其它多重感染。4例HPV阳性的标本应用LiPA未能作出基因分型，DNA序列分析显示这4例为HPV 66感染，此型别不包括在LiPA所标记的探针内。12例随诊资料显示了LiPA的物异性及高度的重复性。结论 线样探针分析法可以用于子宫颈癌普查计划及随诊病例的研究。
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Genotyping of human papillomavirus genotyps in cervic al scrapes by line probe assay WANG Jinhua, Judith Bakkers, Willem J G Melchers. Affiliated Hospital of Ningxia Medical College, Yinchuan 750004
【Abstract】 Objective To pursue the further development of a practical HPV genotyping system applicable for mass screening. Methods Cervical scrapes from 155 women were tested for the presence of HPV using a general-primer based PCR. A reverse hybridization assayor, the line probe assay (LiPA) was used for genotyping 16 different HPV types(HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 56, 58)simultaneously. Results 93(60%) out of 155 specimens tested were positive for HPV DNA by PCR. The HPV positivity amongst the group of women with no cervical abnormality was 43%, while that in women with cervical dysplasia and cervical cancer was 81.2% PCR products from 89 HPV positive cases were genotyped by LiPA, of which 49 cases were single HPV infected concerning 11 different HPV types and the commonest type was HPV-16, occurring in 25(51%) of all single HPV infected cases. The other 40 specimens contained multiple HPV types comprising 16 different HPV types. Although double infections(n=25) prevailed, triple(n=9),quadruple(n=3) and quintuple(n=3) infections were also found. PCR products of four HPV positive cases failed to be classified by LiPA. Sequencing analysis revealed that these 4 cases were HPV-66 which was not included in LiPA probes. Follow-up data of 12 cases confirmed the HPV genotyping results. Conclusion The LiPA for HPV genotyping is easy to perform. It allows accurate and rapid identification of 16 different HPV types in cervical scrapes and will facilitate HPVdetection as well as genotyping in cervical cancer screening programs.
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【Key words】 Human papillomavirus Polymerase chain reaction Line probe assay Genotyping
过去近二十年的研究证实了一定基因型的人乳头瘤病毒(HPV)与子宫颈癌的发病密切相关[1-3]。迄今为止，已经有85种以上不同型别的HPV被发现，其中30种HPV可以感染生殖器粘膜[4]。根据系统发育关系以及其在良性或恶性子宫颈病变的表现，这些HPV可以分成低危险型和高危险型。
已有研究显示，在子宫颈癌普查计划中和对轻度细胞学异常病人的追踪过程中，HPV的检测有着潜在的应用价值[5，6]。细胞和组织学的检查可以确定有无 HPV感染，但不能确定HPV的基因型别。由于HPV体外增殖的困难，至今为止尚无可靠的血清学分型方法。现在用于HPV基因分型的方法有[7]：①HPV型特异性探针使用在原位杂交，点印迹法，Southern印迹法和滤膜原位杂交；②用型物异性引物扩增病毒DNA；③杂交(DNA-RNA)捕捉法；④DNA序列分析。另外，对于新近发现的HPV型别尚没有特异的引物。因此，为了子宫颈癌人群普查的需要，建立一种实用的HPV基因分型方法有着十分重要的意义。
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线样探针(LiPA)已被应用在丙型肝炎病毒的基因分型[8]、人白细胞抗原的分型[9]以及临床标本中某些细菌病原体的基因分型[10，11]。我们使用敏感的PCR方法扩增高度保守的HPV病毒的L1区，在长条形尼龙膜上水平固定16种HPV L1区型特异性的寡核苷酸探针，然后使扩增产物与探针杂交。使用这一新的方法，可以同时检测子宫颈刮片的16种不同的HPV基因型别。
1 材料和方法
1.1 研究对象及标本采集 子宫颈刮片取自155名参加荷兰奈梅亨地区子宫颈癌普查的妇女，连续出现两次不正常宫颈刮片后转至荷兰奈梅亨大学医院妇科门诊，在进行阴道镜检查时作两份子宫颈刮片。首先进行细胞学检查分型，分型标淮采用荷兰通用的KOPAC标淮[12]：PapⅠ正常细胞，PapⅡ炎症， Pap Ⅲa轻度或中度增生不良，PapⅣ原位癌，PapⅤ侵袭性癌。其余的宫颈刮片组织用作准备石蜡切片标本。
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1.2 HPV DNA的提取 将一份3 μm厚的石蜡切片放置于反应管中，另入200 μl 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液，内含1 mmol/L乙二胺四乙酸及0.2%吐温-20，然后加入蛋白酶K60 μg，56℃温育过夜。次日煮沸灭活蛋白酶K，离心10 min(11 000 r/min)。10 μl上清液直接用作PCR检测。 1.3 PCR扩增和产物测定 一组PCR引物混合物与保守的L1区的多型HPV互补, 在其5′端用生物素标记, 40 μl PCR反应液(200 mmol/L氯化钾, 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸, 1.5 mmol/L氯化镁, dNTP各200 mmol/L, 1U Taq DNA聚合酶以及100 pmol/L的引物)中加入10 μl HPV DNA提取液。反应条件： 94℃变性30 s, 45℃退火45 s, 72℃延伸45 s，共40个循环。
1.4 线样探针分析 16种HPV型特异性寡核苷酸探针是基于65bp扩增片段内的型特异性差异而设计的，包括HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 56和HPV58。用酶促法在此寡核苷酸的3'端加上多聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸尾巴, 将此探针平行线样加入尼龙膜, 在其上端作一偶联对照, 置于80℃烤箱中12 h, 使其探针固定于膜上。然后切割成4 mm宽的长条。线样探针分析的操作过程与其应用在丙型肝炎病毒基因分型方法相同[13]。
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1.5 DNA序列分析 应用Original TA CloningR ○试剂盒(Invitrogen corporation)，将新鲜的HPV DNA PCR扩增片段连接至pCRR ○2.1质粒载体中，使用Ampli CyclingTM序列分析盒测定插入片段的DNA序列。
2 结果
使用高度保守的HPV L1区的一组引物扩增多种型别的HPV DNA, 经40个扩增循环后, 用3%琼脂糖凝胶电泳检测HPV扩增产物。图1 显示HPV DNA扩增片段长度为65bp。155份子宫颈刮片标本中93例HPV DNA阳性, 阳性率为60%。其中在宫颈细胞学检查正常或仅有炎症病变(Pap I 和PapII组)和妇女中, HPV DNA阳性率为43%(37/86), 而在宫颈细胞增生不良或宫颈细胞癌(Pap III/IV/V组)的妇女中, 其阳性率为81.2%(56/69)。
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图1 子宫颈刮片中HPV DNA的PCR扩增结果
9：低梯度核酸标准参照物；6：空白对照；7：阴性对照；8：阳性对照。第1-5列为检测标本
Fig.1 Analysis of HPV DNAs in cervical scrpes with PCR
9: Molecular weight standard. 6: Mock. 7: Negative control.
8: Positive control. 1-5: tested samples
用线样探针分析法93例HPV阳性的PCR扩增产物进一步检测，在89例标本鉴定出HPV的基因型别，涉及LiPA条上所标记的所有16种HPV型(图2)。另外，4例仅显示了偶联对照线，而与16种不同型的HPV探针无特异性结合，说明这4例可能是此16种HPV型以外的型别，称之为HPV X。 对这4例的PCR克隆序列分析证明为HPV 66。HPV基因分型结果见表1，其中单独一型HPV感染为49例，涉及11种不同型HPV，最常见的型别为HPV 16，占单独感染的51%(25/49)。另40例为不同型别HPV重叠感染，涉及所有16种HPV型别，二重感染占主导(n=25)，同时也检测出其它多重感染，如三重(n=9)，四重(n=3)，五重(n=3)。
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图2 HPV基因的线样探针分析结果
右侧平等线条显示LiPA 条上16种型特异性探针所固定的位置, A至K 显示11种HPV基因型单独感染在LiPA条上的带形, 由左列示L为HPV16/31 双重感染, M列为HPV16/33/45三重感染, N列为HPV6/11/16/18四重感染, O列为HPV18/31/35/40/44五重感染
Fig. 2 Analysis of HPV genotypes with LiPA.
The horizontal lines on the right indicate the positions of 16 different specific HPV probes fixed in the membranes. A to K show the patterns of single infection of 11 various HPVs in LiPA assays, from left to right they are HPV6,11, 16, 18, 31, 33, 35, 44, 52, 56 and 58, L shows a double infection of HPV16/31.M is a triple infection of HPV16/33/45. N is Quadruple infection with HPV 6/11/16/18. O is quintuple infection with HPV 18/31/35/40/44
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为了观测HPV感染状态与宫颈上皮细胞病 变程度(Pap分类)的关系, 我们将本组研究涉及的17种HPV型别分为两组, HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 66属于高危组, 而HPV6, 11, 40, 42, 43, 44属于低危险组。图3显示, 随着宫颈上皮细胞病 变程度的加重, 高危险组HPV感染比例逐渐升高, 在PapI, PapII, PapIIIa组中其感染率分别为22.5%, 47.8%, 75.5%；而在Pap IIIb/VI/V组中, 其感染率达85.0%, 相反, 低危组HPV感染及无HPV感染的比例随着宫颈上皮细胞病变程度的加重却逐渐下降, 其差异有统计学意义。由此进一步证实了子宫颈癌的发生与高危险组HPV感染有密切的关系。
为了研究HPV感染对宫颈上皮细胞病变的短期及长期的影响，所有的病人3个月后重复宫颈刮片细胞学检查及HPV检测。至目前为止，此155例病例中有12例有随诊资料。表2显示 11例(11/12)的HPV感染状况及基因分型在两次检测中完全一致，另一例在第2次检查中由单独HPV31感染变成HPV18及HPV31重叠感染。
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表1 子宫颈刮片中HPV感染及其基因分型与细胞学Pap分类的结果
Tab.1 HPVoccurrence in cervical scrapes from women, the genotyping and Pap classification Pap 分类
Pap classification
HPV 阴性
HPV negative
HPV 阳性及其基因分型
HPV positive and genotypes
6
11
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16
18
31
33
35
40
42
43
44
45
51
52
56
58
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X
D
T
>T
Ⅰ
40
27
1
1
3
1
4
2
1
, 百拇医药
Ⅱ
46
22
2
1
4
1
1
2
1
2
5
3
Ⅲa
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49
10
2
11
2
1
4
1
12
3
Ⅲb
12
1
2
, 百拇医药
2
1
1
4
1
3
Ⅳ
6
1
4
1
Ⅴ
2
1
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1
合计
Total
155
62
5
2
25
3
2
3
1
1
4
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2
1
4
25
9
6
注：X：LiPA未能分型的HPV DNA；D：HPV双重感染；T：HPV三重感染；>T：多于三重感染
Notes: X:can not be genotyped by LiPA. D:HPV double infection. T:HPV triple infection. >T:more than triple infection
3 讨论
, http://www.100md.com 子宫颈刮片普查有效地减少了子宫颈癌和死亡率，但这一普查计划花费太大，组织复杂，因此常被认为是低效率的普查[14，15]。而宫颈细胞的HPV DNA的检测提供了一种可能是自动的和廉价的论断方法，而且此检查排除了宫颈细胞学检查的主观性和样本采集中的问题以及阴道镜检查的费用，更重要的是，HPV DNA的基因分型对确定不同型的HPV感染的自然历程以及其持续感染在子宫颈癌发展过程中的作用有着十分重要的意义[16～18]。 表2 12例随诊病例的资料
Tab.2 Data of 12 follow-up cases 第一次采样
First smple collection
第二次采样
Second sample collection
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Pap
HPV-基因型
HPV-genotypes
Pap
HPV-基因型
HPV-genotypes
Ⅲa
16
Ⅱ
16
0
31
Ⅲa
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18，31
Ⅲa
52
Ⅲa
52
Ⅲb
18
Ⅲb
18
Ⅱ
-
Ⅱ
-
0
, 百拇医药
-
Ⅱ
-
Ⅱ
-
0
-
Ⅲb
18
Ⅲb
18
Ⅱ
16
Ⅲa
, 百拇医药
16
Ⅲa
52
Ⅲa
52
Ⅲa
6，16，31
Ⅲa
6，16，31
Ⅱ
-
Ⅱ
-
, http://www.100md.com 在以往的研究中，HPV基因分型多局限于六种常见的HPV型别，即HPV6, 11, 16, 18, 31和HPV33，因而在这些研究中存在着相当大比例的不能明确型别的HPV感染，称之为HPVX。而LiPA可以作出16种不同的HPV基因分型，所以尽可能减少了HPVX的发生。本研究中93例HPV感染，89例使用LiPA作出了基因分型，成功率为95.7%。4例HPV X经序列测定确定是探针条上标记的26种HPV以外的型别，因而更证实了探针的型特异性。随诊资料中两次采集的样本以PCR及LiPA检查，得到了完全一致的HPV阳性率及一致的基因型别，显示了LiPA的特异性和高度的重复性。
另外，有研究表明HPV多重感染是子宫颈上皮细胞癌发生的一个危险因素[19]，因此能否确定重叠感染是判定一实验方法优劣的一项指标。LiPA最大的优点是在一个条型尼龙膜上固定了16种不同探针，可以同时检测此16种不同HPV型别，这极大的便利了重叠感染的检测本组病例重叠感染多达44.9%，且有3个病例为五种不同型别的HPV感染。 参考文献
, 百拇医药
1 World Health Organization. Cervical cancer vaccine prospects. World Health Forum, 1994,15:417.
2 Bosch F X. Mumoa N, de Sanjose S, et al. Risk factors for cervical cancer in Columbia and Spain. Int J Cancer, 1992,52:750-758.
3 Schiffman M H. Recent progress in defining the eplidemiology of human papillomavirus infetion and cervical neoplasia. J Natl cancer Inst, 1992,84:394-398.
4 Van Ranst M, Tacheay R, Burk R D. Human papillomaviruses: a never ending story?In: Papillomavirus reviews: Current research on papillomaviruses. Lacey C, ed. Leeds, United Kingdom, Leeds Univetsity Press, 1996:1-20.
, 百拇医药
5 Cuzick J, Szarewski A, Terry G, et al. Human papillomavirus testing in primary cervical screening. Lancet, 1995, 345:1533-1536.
6 Jenkins D, Shetlaw Johnaon C, Gallivan S. Can papillomavirus testing be used to improve cervical cancer screening? Int J Cancet, 1996, 65:768-773.
7 Rroman A, Fife K H. Human papillomaviruses: are we ready to type? Clin Microbiol Rew, 1989,2:166-190.
8 Stuyver L, Rossau R, Wyseur A, et al . Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J Gen Virol, 1993,74:1093-1102.
, 百拇医药
9 Thonnard J, Deldime F, Heuterspreute M, et al. HLA class Ⅱ genotyping:two assay systems compared.Clin Chem, 1995,41:553-556.
10 De Beenhouwet H, Lhiang Z, Jannes G, et al . Rapid detection of rifampicin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tubet Lung Dis, 1995,76:425-430.
11 Rijpens N P, Jannes G, Van Asbroeck M, et al. Direct detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse bybridization with 16S-23S rRNA spacer probes. Appl Environ Microbiol, 1996,62:1683-1688.
, 百拇医药
12 De Roda H, Walboometrs A M J M, Meije C J, et al. Analysis of cytomorphologically abnormal cetvical scrapes for the presence of 27 mucosotropic human papillomavirus genotypes, using polymerase chain reaction. Int J Cancet, 1994,56:802-806.
13 Stuyvet L, Wyseur A, van Arnhem W, et al.Second-generation line probe assay for hepatitis C virus genotyping. J Clin. Microbiol. 1996,34:2259-2266.
14 Benedet J L, Anderson G H, Matisic J P. A comprehensive program for cervical cancer detection and management. Am J Obstet Gynecol 1992,166:1254-1259.
, 百拇医药
15 Smith A, Elkind A, Eardley A. Making cervical screening work. BMJ, 1989,298:1662-1664.
16 Hildesheim A, Schiffnan M H, Gravitt P E, et al. Petsistence of type-specific human papillomavirus infection among cytologically normal women. J Infect Dis, 1994,169:235-240.
17 Ho G Y, Burk R D, Klein S, et al. Persistent genital human papillomavirus infection as a risk factor for persistent cervical dysplasia. J Natl Cancer Inst, 1995,87:1365-1371.
, 百拇医药
18 Remmink A J, Walboonets J M, Helmmethorst T J, et al. The pressence of persistent high-risk HPV genotypes in dysplastic cervical lesions is associated with progressive disease: natural history up to 36 months. Int J Cancer, 1995,61:306-311.
19 Liaw K L, Hsing A W, Chen C J, et al. Human papillomavirus and cervical neoplasia a case-control study in Taiwan. Int J Cancer 1995,565-571.
(收稿：1998-06-06 修回：1998-10-04), 百拇医药