从胚胎干细胞诱导发育为浆细胞的体外实验研究*
作者：乔春平 李树浓 黄绍良 徐 令 梁晓燕 张秀明
单位：
乔春平 李树浓 梁晓燕 张秀明 中山医科大学病理生理教研室(广州 510089)；黄绍良 徐 令 孙逸仙纪念医院儿科
关键词：胚胎；干细胞；细胞活素类；造血干细胞；浆细胞
中国病理生理杂志990108 摘 要 目的：建立胚胎干细胞体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为研究造血发生的基因调控及B淋巴细胞发育过程奠定基础。方法：分阶段培养，第一、二阶段使用半固体培养，分组加入细胞因子、2-巯基乙醇和胚胎细胞条件培养液，用流式细胞仪、免疫组化及Wright's染色鉴定细胞，第三阶段移入骨髓基质细胞滋养层。结果：第一阶段：加入SCF、TPO、IL-6、IL-3、Epo、和G-CSF，4 d后细胞大片坏死，仅加入2-巯基乙醇可形成胚胎体。第二阶段：加入SCF和TPO，细胞增殖缓慢，再加入条件培养液，发育3～4 d可形成CD34+的细胞集落。第三阶段：移至骨髓基质细胞饲养层后，发育为浆细胞。结论：胚胎干细胞在体外可定向分化为浆细胞。胚胎干细胞在早期发育不需要细胞因子，胚胎细胞的条件培养液可促使其向造血细胞发育，骨髓基质细胞饲养层可使其向浆细胞分化。
, 百拇医药
Induction of plasma cells from embryonic stem cells in vitro culture
QIAO Chun-Ping, LI Shu-Nong,HUANG Shao-Liang, XU Ling, LIANG Xiao-Yan, ZHANG Xiu-Ming
Department of Pathophysiology, Sun-Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510089)
Abstract AIM：To find a suitable microenviroment for improved induction of plasma cells from murine embryonic stem(ES)cells,we explored the roles of cytokines and primary bone marrow stromal cells in the development of ES-D3 cells.METHOD and RESULTS：The process was divided into three stages.First stage(0-4 day):adding SCF(stem cell-factor) ，TPO(thrombopoietin)，IL-6，IL-3，erythropoietin，G-CSF into methycellulose culture,ES-D3 cells died four days later,ES-D3 cells developed into embryoid bodies and they grew well in the presence of 2-Mercaptoethanol (2-ME) only.Second stage(4-7 dyas)：the embryoid bodies were trypsined,then transferred into secondary methylcellulose culture,cells grew slowly when adding SCF and TPO, but they(86%)developed quickly into the colonies of CD34+ cells in the presence of conditional medium(first stage of liquid culture,adding 2ME only).Third stage:CD34+ cells developed into CD34- CD38+ cells when transferred onto prepared bone marrow stromal cells in the presence of IL-6 and SCF,they looked like plasma cells by cell morphology,and immunoglobulin test was positive .CONCLUSIONS：Cultured in a suitable microenviroment,ES-D3 cells can developed into plasma cells.cytokines were not needed in the early development of ES-D3 cells,conditional medium of the first stage of liquid culture could accelerate them to develop into hematopoietic cells,and the primary bone marrow stromal cells play a main role in the induction of plasma cells.
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MeSH Embryo;Stem cells;Cytokines;Hematopoietic stem cells;Plasma cells
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)是从早期胚胎细胞分离的，能在体外长期培养的，高度未分化的细胞。胚胎干细胞的建立，为人们在体内外研究胚胎及器官发育带来方便。体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体[1]，造血岛内主要是原始红细胞，可检测到克隆形成细胞(colony forming cells，CFC)。有关ES细胞向B淋巴细胞发育的研究较少，Nisitani等将发育7 d的胚胎体的细胞移至ST2成纤维细胞上，可检测到有重组激活基因(RAG)的转录及D-J基因的重排[2]，Potocnik等在低氧的环境中使ES细胞发育，15～20 d后也可检测到V-D-J基因重排及B220+的B淋巴祖细胞[3]，但以上两种方法均未检测到成熟B淋巴细胞和浆细胞。本实验采用分阶段诱导胚胎干细胞发育的方法，探讨骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对胚胎干细胞发育的影响，建立ES-D3细胞在体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为体外研究造血细胞发育奠定基础。
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材料与方法
一、材料：
1.ES-D3[5]由上海细胞生物学研究所丛笑倩教授提供。
2.免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。
3.FITC-conjugated rat anti-mouse CD34和PE-conjugated rat anti-mouse CD38均购自美国Pharmingen公司。
4.干细胞因子(stem cell factor,SCF)、白细胞介素3(interleukin 3,IL-3)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、红细胞生成素(erythropoietin,Epo)等造血刺激因子由麒麟医药公司提供。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)由杭州九源基因工程有限公司提供。
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5.胎牛血清购自美国Hyclone公司。
6.昆明鼠由本校动物中心提供。
二、方法：
(一)细胞培养：
1.ES-D3细胞培养及原代胚胎成纤维细胞的制备见参考文献[9]。
2.骨髓基质细胞饲养层的制备：取6～8周的昆明鼠，取其股骨，用1 mL注射器冲出骨髓，DMEM液离心洗涤2次，接种于50 cm2的塑料培养瓶内。使用前用丝裂霉素C处理1 h，传入24孔塑料培养板内，加培养液备用。
3.胚胎细胞条件培养液(conditional medium)的制备：使5×107/L ES-D3细胞在IMDM(Iscove' modified dulbecco's medium)液中培养，加入15%FCS，2-ME(10-5 mol/L)，3 d收集培养液，离心取上清，0.22 μm滤膜过滤后备用。
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(二)分阶段诱导ES-D3细胞发育为浆细胞：
1.第一阶段：将1×107/L ES-D3细胞培养于含15%FCS，0.9%甲基纤维素的IMDM液内(6孔板)，分5组(表1)，每组设3个孔，分别加入β-巯基乙醇(10-5mol/L)、SCF(50 μg/L)、Epo(4×103 U/L)、TPO(100 μg/L)、IL-3(50 μg/L)、IL-6(50 μg/L)和胚胎细胞条件培养液(25%)，4 d在倒置显微镜下观察。实验重复3次。
2.第二阶段：用PBS液吸打第一阶段培养形成的胚胎体(见表1第4组)，离心沉淀，胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞，分为3组(表2)，分别加入SCF(50 μg/L)、TPO(50 μg/L)，条件培养液(25%)及2-ME(10-5mol/L),以不同的细胞密度培养于六孔培养板中，发育3～4 d。
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3.第三阶段：离心沉淀上述细胞，以5×107/L密度种植于骨髓基质细胞饲养层上，加入SCF(50 μg//L)，IL-6(50 μg/L)，发育6 d后，收集细胞，分别做Wright's染色，流式细胞仪检测及免疫组化。
免疫组化用DAB染色试剂盒，仅在标本上加入二抗(抗小鼠的多克隆抗体)孵育，余按试剂盒说明操作。
结 果
一、胚胎体形成(见表1)：
第1组出现大片细胞坏死，因坏死细胞过多，使培养液变得浑浊。本实验排除了细胞污染及因细胞密度过大，缺乏营养而死亡的可能性(细胞密度均为1×104/孔)。
第2、第3组细胞生长缓慢，无胚胎体出现。
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第4组大部分细胞形成了胚胎体(图1)。
第5组条件培养液并不能促进ES-D3细胞向胚胎体的发育，且细胞状态不佳。
表1 细胞因子对ES-D3细胞第一阶段发育的影响
Tab 1 Influence of cytokines on the development
of ES-D3 cells in the first stage Group
Cytokines
Result(4 d of culture)
1
SCF，TPO，IL-6，IL-3，Epo，G-CSF
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cells died
2
SCF
grew slowly,no formed embryoid body
3
IL-6
grew slowly,no formed embryoid body
4
2-ME
formed embryoid bodies
5
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2-ME，CM*
no formed embryoid body
*CM：conditional medium；2-ME：2-mercaptoethanol表2 细胞因子对第二阶段发育的影响
Tab 2 influence of cytokines on the development
of ES-D3 cells in the secondary stage Cytokines
Result(4 d of secondary culture)
SCF，TPO
grew slowly
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SCF，TPO，2-ME
most cells adherented
SCF，TPO，CM
non-adherented,formed colonies
以下实验第一阶段均采用第4组体系。
二、胚胎细胞向造血细胞分化：
第二阶段(表2)，仅加入SCF和TPO，细胞增殖缓慢；2-ME可使其增殖速度加快，但大部分细胞贴壁，
Fig 1 Embryoid body for 3 day of differentiation(×200)
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图1 发育3 d的胚胎体
Fig 2 Wright's stained plasma cell(×1000)
图2 浆细胞
Fig 3 Flow cytometry analysis of CD34 expression on cells for developing 6 days
图3 流式细胞仪检测发育6 d的细胞的CD34抗原
呈内皮细胞样细胞生长；若加入条件培养液，大部分细胞可形成细胞集落，收集此组发育至第6 d的细胞，流式细胞仪结果显示：86%的细胞呈CD34+(图3)。
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三、发育为浆细胞：
将第3组发育至第7 d的细胞种植于骨髓基质细胞饲养层上，细胞由小变大，增殖形成集落，收集发育至14 d的细胞，流式细胞仪检测，大部分细胞呈现CD34-CD38+(图4)，Wright's染色后油镜下观察，80%细胞呈现浆细胞形态，核偏离一边，跑浆丰富，核浆比例较小(图2)。免疫球蛋白免疫组化实验结果显示胞浆呈现棕色，说明其胞浆内含有免疫球蛋白。
Fig 4 Flow cytometry analysis of CD34 and CD38
expression on cells for developing 14 dyas
图4 流式细胞仪检测发育14 d的细胞的CD34抗原和CD38抗原
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讨 论
文献报道直接将ES细胞置于骨髓成纤维细胞系，可发育为造血细胞[5]；或直接在含有甲基纤维素的培养基里培养，初始即加入细胞因子[4]，也可诱导ES细胞向造血系细胞分化。我们探讨了原代骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对ES-D3发育的影响，在ES-D3细胞发育早期阶段，加入细胞因子反而不利于其发育。ES细胞发育为造血细胞的不同阶段，需不同的微环境，因而本实验采取分阶段诱导ES-D3细胞发育的方法，在ES细胞发育至一定阶段后，才加入细胞因子及移入骨髓基质细胞饲养层上，能高效、定向地诱导B淋巴细胞的发生。
胚胎干细胞在早期发育不依赖细胞因子 体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体，Doetschman等[4]证明了人脐带血(含IL-6等)和Epo可显著增加造血岛形成。在ES细胞体外发育为造血细胞的体系中，何时及加入何种因子，使其向造血细胞发育的效率最高，值得探讨。本实验结果表明，早期胚胎体的形成并不依赖细胞因子。胚胎体细胞表面不表达各种细胞因子(SCF除外)受体，可能是胚胎体形成不需要细胞因子的原因之一。Nakano等[6]在研究骨髓硬化症小鼠基质细胞对ES-D3细胞分化的影响时，发现M-CSF可抑制ES-D3细胞向造血细胞分化，其机制不清楚。2-ME可与培养液中的半胱氨酸以二硫键结合形成复合物，使半胱氨酸更易进入胞浆，形成充足的谷胱甘肽，因而可促进胚胎体的形成[6]。
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胚胎细胞的条件培养液可促使胚胎体细胞向造血细胞分化 SCF和TPO均可促进骨髓造血干细胞的增殖和存活，然而仅在这两种因子作用下，胚胎体细胞发育缓慢。条件培养液可促使胚胎体细胞增殖形成CD34+非贴壁生长的集落，细胞形态较小，类似早期造血细胞，表明条件培养液可促使胚胎体细胞向造血细胞分化。Kennedy[7]等认为ES细胞来源的内皮细胞系的条件培养液(D4T CM，medium conditioned by an EB-derived endothelial cell line)可促进此阶段细胞的生长，此报道与本实验结果相符。
骨髓基质细胞饲养层的作用 骨髓内的造血微环境对造血细胞尤其是B淋巴细胞发育起重要作用。原代骨髓基质细胞饲养层接近体内的骨髓造血微环境，它对ES-D3细胞分化的影响未见文献报道。本实验先使ES-D3细胞在体外发育至CD34+的细胞，再移至骨髓基质细胞饲养层，其可向CD34-CD38+的浆细胞分化。骨髓基质细胞饲养层分泌IL-7、SCF等造血调节因子，另外其细胞表面的粘附因子VCAM-1(vascular cell adhesion molecular-1)与造血细胞表面的极晚期抗原-4(very late activation antigen,VLA-4)相互作用，均对B淋巴细胞的发育起重要作用[8]。
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诱导浆细胞现出的因素 经抗原刺激后，成熟的B淋巴细胞才能转变为抗体分泌细胞即浆细胞。在本实验内，ES-D3细胞来源于129品系的小鼠，骨髓基质细胞饲养层来源于昆明鼠，存在着抗原差异，可能是刺激B淋巴细胞向浆细胞分化的因素之一，在第三阶段的发育过程中，使用IL-6因子，它是诱导B淋巴细胞向浆细胞分化的主要因子。
*国家自然科学基金资助；博士点基金资助；CMB基金资助
参考文献
1 Mcclanahan T,Dalrymple S,Barkett,et al.Hematopoietic growth factor receptor genes as markers of lineage commitment during in vitro development of hematopoietic cells.Blood,1993,6:909.
, 百拇医药
2 Nisitani S,Tsubata T,Honjo T.Lineage marker-negative lymphocyte precursors derived from embryonic stem cells in vitro differentiate into mature lymphocytes in vivo. Int Immunol,1993,6:909.
3 Potocnik AT,Nidlsen PJ,Eichman K.In vitro generation of lymphoid precursors from embryonic stem cells.EMBO J, 1994,13:5274.
4 Doetschman TC,Eistetter H,Kemler R,et al.The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines:formation of visceral yolk sac,blood islands and myocardium.J Embryol Exp Morph,1985,87:27.
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5 Nakano T,Kodama H,Honjo T.Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.Science,1994,265:1098.
6 Kavanagh TJ,Grossman A,Jeacks EP,et al.Proliferative capacity of human peripheral blood lymphocytes sorted on the basis of glutathione content.J Cell Physiol,1990,145:472.
7 Kennedy M,Firpo M,Choi K,et al.A common precursor for primitive erythropoiesis and definitive haematopoiesis.Nature,1997,386(3):488.
, 百拇医药
8 Masahito koguma,Ken-ichi Matsuda,et al.Selective proliferation of lymphoid cells from linage-c-kits+sca-1+cells by a clonal bone marrow stroman cell line.Exp Hematol 1998,26:280.
9 胡新立，尚克刚.6个小鼠ES细胞系的建立和鉴定.北京大学学报(自然科学版)，1996，32：248.
收稿日期：1998年8月5日
修稿日期：1998年11月3日
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单位：
乔春平 李树浓 梁晓燕 张秀明 中山医科大学病理生理教研室(广州 510089)；黄绍良 徐 令 孙逸仙纪念医院儿科
关键词：胚胎；干细胞；细胞活素类；造血干细胞；浆细胞
中国病理生理杂志990108 摘 要 目的：建立胚胎干细胞体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为研究造血发生的基因调控及B淋巴细胞发育过程奠定基础。方法：分阶段培养，第一、二阶段使用半固体培养，分组加入细胞因子、2-巯基乙醇和胚胎细胞条件培养液，用流式细胞仪、免疫组化及Wright's染色鉴定细胞，第三阶段移入骨髓基质细胞滋养层。结果：第一阶段：加入SCF、TPO、IL-6、IL-3、Epo、和G-CSF，4 d后细胞大片坏死，仅加入2-巯基乙醇可形成胚胎体。第二阶段：加入SCF和TPO，细胞增殖缓慢，再加入条件培养液，发育3～4 d可形成CD34+的细胞集落。第三阶段：移至骨髓基质细胞饲养层后，发育为浆细胞。结论：胚胎干细胞在体外可定向分化为浆细胞。胚胎干细胞在早期发育不需要细胞因子，胚胎细胞的条件培养液可促使其向造血细胞发育，骨髓基质细胞饲养层可使其向浆细胞分化。
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Induction of plasma cells from embryonic stem cells in vitro culture
QIAO Chun-Ping, LI Shu-Nong,HUANG Shao-Liang, XU Ling, LIANG Xiao-Yan, ZHANG Xiu-Ming
Department of Pathophysiology, Sun-Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510089)
Abstract AIM：To find a suitable microenviroment for improved induction of plasma cells from murine embryonic stem(ES)cells,we explored the roles of cytokines and primary bone marrow stromal cells in the development of ES-D3 cells.METHOD and RESULTS：The process was divided into three stages.First stage(0-4 day):adding SCF(stem cell-factor) ，TPO(thrombopoietin)，IL-6，IL-3，erythropoietin，G-CSF into methycellulose culture,ES-D3 cells died four days later,ES-D3 cells developed into embryoid bodies and they grew well in the presence of 2-Mercaptoethanol (2-ME) only.Second stage(4-7 dyas)：the embryoid bodies were trypsined,then transferred into secondary methylcellulose culture,cells grew slowly when adding SCF and TPO, but they(86%)developed quickly into the colonies of CD34+ cells in the presence of conditional medium(first stage of liquid culture,adding 2ME only).Third stage:CD34+ cells developed into CD34- CD38+ cells when transferred onto prepared bone marrow stromal cells in the presence of IL-6 and SCF,they looked like plasma cells by cell morphology,and immunoglobulin test was positive .CONCLUSIONS：Cultured in a suitable microenviroment,ES-D3 cells can developed into plasma cells.cytokines were not needed in the early development of ES-D3 cells,conditional medium of the first stage of liquid culture could accelerate them to develop into hematopoietic cells,and the primary bone marrow stromal cells play a main role in the induction of plasma cells.
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MeSH Embryo;Stem cells;Cytokines;Hematopoietic stem cells;Plasma cells
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)是从早期胚胎细胞分离的，能在体外长期培养的，高度未分化的细胞。胚胎干细胞的建立，为人们在体内外研究胚胎及器官发育带来方便。体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体[1]，造血岛内主要是原始红细胞，可检测到克隆形成细胞(colony forming cells，CFC)。有关ES细胞向B淋巴细胞发育的研究较少，Nisitani等将发育7 d的胚胎体的细胞移至ST2成纤维细胞上，可检测到有重组激活基因(RAG)的转录及D-J基因的重排[2]，Potocnik等在低氧的环境中使ES细胞发育，15～20 d后也可检测到V-D-J基因重排及B220+的B淋巴祖细胞[3]，但以上两种方法均未检测到成熟B淋巴细胞和浆细胞。本实验采用分阶段诱导胚胎干细胞发育的方法，探讨骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对胚胎干细胞发育的影响，建立ES-D3细胞在体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为体外研究造血细胞发育奠定基础。
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材料与方法
一、材料：
1.ES-D3[5]由上海细胞生物学研究所丛笑倩教授提供。
2.免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。
3.FITC-conjugated rat anti-mouse CD34和PE-conjugated rat anti-mouse CD38均购自美国Pharmingen公司。
4.干细胞因子(stem cell factor,SCF)、白细胞介素3(interleukin 3,IL-3)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、红细胞生成素(erythropoietin,Epo)等造血刺激因子由麒麟医药公司提供。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)由杭州九源基因工程有限公司提供。
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5.胎牛血清购自美国Hyclone公司。
6.昆明鼠由本校动物中心提供。
二、方法：
(一)细胞培养：
1.ES-D3细胞培养及原代胚胎成纤维细胞的制备见参考文献[9]。
2.骨髓基质细胞饲养层的制备：取6～8周的昆明鼠，取其股骨，用1 mL注射器冲出骨髓，DMEM液离心洗涤2次，接种于50 cm2的塑料培养瓶内。使用前用丝裂霉素C处理1 h，传入24孔塑料培养板内，加培养液备用。
3.胚胎细胞条件培养液(conditional medium)的制备：使5×107/L ES-D3细胞在IMDM(Iscove' modified dulbecco's medium)液中培养，加入15%FCS，2-ME(10-5 mol/L)，3 d收集培养液，离心取上清，0.22 μm滤膜过滤后备用。
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(二)分阶段诱导ES-D3细胞发育为浆细胞：
1.第一阶段：将1×107/L ES-D3细胞培养于含15%FCS，0.9%甲基纤维素的IMDM液内(6孔板)，分5组(表1)，每组设3个孔，分别加入β-巯基乙醇(10-5mol/L)、SCF(50 μg/L)、Epo(4×103 U/L)、TPO(100 μg/L)、IL-3(50 μg/L)、IL-6(50 μg/L)和胚胎细胞条件培养液(25%)，4 d在倒置显微镜下观察。实验重复3次。
2.第二阶段：用PBS液吸打第一阶段培养形成的胚胎体(见表1第4组)，离心沉淀，胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞，分为3组(表2)，分别加入SCF(50 μg/L)、TPO(50 μg/L)，条件培养液(25%)及2-ME(10-5mol/L),以不同的细胞密度培养于六孔培养板中，发育3～4 d。
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3.第三阶段：离心沉淀上述细胞，以5×107/L密度种植于骨髓基质细胞饲养层上，加入SCF(50 μg//L)，IL-6(50 μg/L)，发育6 d后，收集细胞，分别做Wright's染色，流式细胞仪检测及免疫组化。
免疫组化用DAB染色试剂盒，仅在标本上加入二抗(抗小鼠的多克隆抗体)孵育，余按试剂盒说明操作。
结 果
一、胚胎体形成(见表1)：
第1组出现大片细胞坏死，因坏死细胞过多，使培养液变得浑浊。本实验排除了细胞污染及因细胞密度过大，缺乏营养而死亡的可能性(细胞密度均为1×104/孔)。
第2、第3组细胞生长缓慢，无胚胎体出现。
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第4组大部分细胞形成了胚胎体(图1)。
第5组条件培养液并不能促进ES-D3细胞向胚胎体的发育，且细胞状态不佳。
表1 细胞因子对ES-D3细胞第一阶段发育的影响
Tab 1 Influence of cytokines on the development
of ES-D3 cells in the first stage Group
Cytokines
Result(4 d of culture)
1
SCF，TPO，IL-6，IL-3，Epo，G-CSF
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cells died
2
SCF
grew slowly,no formed embryoid body
3
IL-6
grew slowly,no formed embryoid body
4
2-ME
formed embryoid bodies
5
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2-ME，CM*
no formed embryoid body
*CM：conditional medium；2-ME：2-mercaptoethanol表2 细胞因子对第二阶段发育的影响
Tab 2 influence of cytokines on the development
of ES-D3 cells in the secondary stage Cytokines
Result(4 d of secondary culture)
SCF，TPO
grew slowly
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SCF，TPO，2-ME
most cells adherented
SCF，TPO，CM
non-adherented,formed colonies
以下实验第一阶段均采用第4组体系。
二、胚胎细胞向造血细胞分化：
第二阶段(表2)，仅加入SCF和TPO，细胞增殖缓慢；2-ME可使其增殖速度加快，但大部分细胞贴壁，
Fig 1 Embryoid body for 3 day of differentiation(×200)
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图1 发育3 d的胚胎体
Fig 2 Wright's stained plasma cell(×1000)
图2 浆细胞
Fig 3 Flow cytometry analysis of CD34 expression on cells for developing 6 days
图3 流式细胞仪检测发育6 d的细胞的CD34抗原
呈内皮细胞样细胞生长；若加入条件培养液，大部分细胞可形成细胞集落，收集此组发育至第6 d的细胞，流式细胞仪结果显示：86%的细胞呈CD34+(图3)。
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三、发育为浆细胞：
将第3组发育至第7 d的细胞种植于骨髓基质细胞饲养层上，细胞由小变大，增殖形成集落，收集发育至14 d的细胞，流式细胞仪检测，大部分细胞呈现CD34-CD38+(图4)，Wright's染色后油镜下观察，80%细胞呈现浆细胞形态，核偏离一边，跑浆丰富，核浆比例较小(图2)。免疫球蛋白免疫组化实验结果显示胞浆呈现棕色，说明其胞浆内含有免疫球蛋白。
Fig 4 Flow cytometry analysis of CD34 and CD38
expression on cells for developing 14 dyas
图4 流式细胞仪检测发育14 d的细胞的CD34抗原和CD38抗原
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文献报道直接将ES细胞置于骨髓成纤维细胞系，可发育为造血细胞[5]；或直接在含有甲基纤维素的培养基里培养，初始即加入细胞因子[4]，也可诱导ES细胞向造血系细胞分化。我们探讨了原代骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对ES-D3发育的影响，在ES-D3细胞发育早期阶段，加入细胞因子反而不利于其发育。ES细胞发育为造血细胞的不同阶段，需不同的微环境，因而本实验采取分阶段诱导ES-D3细胞发育的方法，在ES细胞发育至一定阶段后，才加入细胞因子及移入骨髓基质细胞饲养层上，能高效、定向地诱导B淋巴细胞的发生。
胚胎干细胞在早期发育不依赖细胞因子 体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体，Doetschman等[4]证明了人脐带血(含IL-6等)和Epo可显著增加造血岛形成。在ES细胞体外发育为造血细胞的体系中，何时及加入何种因子，使其向造血细胞发育的效率最高，值得探讨。本实验结果表明，早期胚胎体的形成并不依赖细胞因子。胚胎体细胞表面不表达各种细胞因子(SCF除外)受体，可能是胚胎体形成不需要细胞因子的原因之一。Nakano等[6]在研究骨髓硬化症小鼠基质细胞对ES-D3细胞分化的影响时，发现M-CSF可抑制ES-D3细胞向造血细胞分化，其机制不清楚。2-ME可与培养液中的半胱氨酸以二硫键结合形成复合物，使半胱氨酸更易进入胞浆，形成充足的谷胱甘肽，因而可促进胚胎体的形成[6]。
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胚胎细胞的条件培养液可促使胚胎体细胞向造血细胞分化 SCF和TPO均可促进骨髓造血干细胞的增殖和存活，然而仅在这两种因子作用下，胚胎体细胞发育缓慢。条件培养液可促使胚胎体细胞增殖形成CD34+非贴壁生长的集落，细胞形态较小，类似早期造血细胞，表明条件培养液可促使胚胎体细胞向造血细胞分化。Kennedy[7]等认为ES细胞来源的内皮细胞系的条件培养液(D4T CM，medium conditioned by an EB-derived endothelial cell line)可促进此阶段细胞的生长，此报道与本实验结果相符。
骨髓基质细胞饲养层的作用 骨髓内的造血微环境对造血细胞尤其是B淋巴细胞发育起重要作用。原代骨髓基质细胞饲养层接近体内的骨髓造血微环境，它对ES-D3细胞分化的影响未见文献报道。本实验先使ES-D3细胞在体外发育至CD34+的细胞，再移至骨髓基质细胞饲养层，其可向CD34-CD38+的浆细胞分化。骨髓基质细胞饲养层分泌IL-7、SCF等造血调节因子，另外其细胞表面的粘附因子VCAM-1(vascular cell adhesion molecular-1)与造血细胞表面的极晚期抗原-4(very late activation antigen,VLA-4)相互作用，均对B淋巴细胞的发育起重要作用[8]。
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诱导浆细胞现出的因素 经抗原刺激后，成熟的B淋巴细胞才能转变为抗体分泌细胞即浆细胞。在本实验内，ES-D3细胞来源于129品系的小鼠，骨髓基质细胞饲养层来源于昆明鼠，存在着抗原差异，可能是刺激B淋巴细胞向浆细胞分化的因素之一，在第三阶段的发育过程中，使用IL-6因子，它是诱导B淋巴细胞向浆细胞分化的主要因子。
*国家自然科学基金资助；博士点基金资助；CMB基金资助
参考文献
1 Mcclanahan T,Dalrymple S,Barkett,et al.Hematopoietic growth factor receptor genes as markers of lineage commitment during in vitro development of hematopoietic cells.Blood,1993,6:909.
, 百拇医药
2 Nisitani S,Tsubata T,Honjo T.Lineage marker-negative lymphocyte precursors derived from embryonic stem cells in vitro differentiate into mature lymphocytes in vivo. Int Immunol,1993,6:909.
3 Potocnik AT,Nidlsen PJ,Eichman K.In vitro generation of lymphoid precursors from embryonic stem cells.EMBO J, 1994,13:5274.
4 Doetschman TC,Eistetter H,Kemler R,et al.The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines:formation of visceral yolk sac,blood islands and myocardium.J Embryol Exp Morph,1985,87:27.
, 百拇医药
5 Nakano T,Kodama H,Honjo T.Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.Science,1994,265:1098.
6 Kavanagh TJ,Grossman A,Jeacks EP,et al.Proliferative capacity of human peripheral blood lymphocytes sorted on the basis of glutathione content.J Cell Physiol,1990,145:472.
7 Kennedy M,Firpo M,Choi K,et al.A common precursor for primitive erythropoiesis and definitive haematopoiesis.Nature,1997,386(3):488.
, 百拇医药
8 Masahito koguma,Ken-ichi Matsuda,et al.Selective proliferation of lymphoid cells from linage-c-kits+sca-1+cells by a clonal bone marrow stroman cell line.Exp Hematol 1998,26:280.
9 胡新立，尚克刚.6个小鼠ES细胞系的建立和鉴定.北京大学学报(自然科学版)，1996，32：248.
收稿日期：1998年8月5日
修稿日期：1998年11月3日
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