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编号:10496233
细胞生长因子和维拉帕米在肝细胞胶原合成和前胶原基因表达中的作用
http://www.100md.com 《临床与实验病理学杂志》 1999年第2期
     作者:胡颖 陆汉明 李定国 程枫

    单位:胡颖 陆汉明 李定国 程枫(上海第二医科大学附属新华医院 200092 上海第二医科大学生化教研室 200025)

    关键词:肝细胞;血小板衍生生长因子;钙拮抗剂;胶原合成;胶原基因表达

    临床与实验病理学杂志990219摘要 目的:探索肝细胞在肝纤维化形成中的可能作用。方法:用核酸原位分子杂交方法和3H-脯氨酸掺入法,观察原代培养大鼠肝细胞在血小板衍生生长因子(PDGF)刺激前后胶原合成和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达及钙拮抗剂维拉帕米对此作用的影响。结果:肝细胞培养一定时间后能够合成胶原,能够表达Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因。PDGF能促进肝细胞的胶原合成和前胶原基因表达。但此刺激作用为维拉帕米所抑制。结论:这些研究为肝细胞参与肝纤维化形成提供了实验依据。

    中国图书分类号 R392.1 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(1999)02-0146-03
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    Action of varapamil and cell growth factor on the collagen synthesis and procollagen gene expression of hepatocyte

    Hu Ying Lu Hanming Li Dingguo et al

    (Xinhua Hospital of Shanghai Second Medical University,Shanghai 200092)

    ABSTRACT Purpose To evaluate the effect of hepatocyte(HC) on liver fibrosis. Methods Effects of platelet-derived growth factor (PDGF) and calcium antagonist, verapamil (Ver), on collagen biosynthesis, expression of procollagen types Ⅰ and Ⅲ mRNA of HC were investigated by in situ hybridization and 3H-Proline incorporation. Results After HCs were cultured five to seven days, they could synthesize collagen and express procollagen types Ⅰ、Ⅲ mRNA. PDGF could significantly enhance collagen synthesis and the expression of procollagen type Ⅰ、Ⅲ mRNA of HCs and Ver could antagonize the effect of PDGF. Conclusion These findings provide a direct evidence for the participation of HCs in liver fibrosis.
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    KEY WORDS hepatocyte; platelet-derived growth factor; calcium antagonists; collagen biosynthesis procollagen gene expression

    肝细胞在肝纤维化形成中的作用目前尚不清楚。以往运用生化、免疫组化和其它一些方法进行的体内或体外实验有时甚至得出了矛盾的结果。我们利用参与肝纤维化形成的重要细胞生长因子即血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)作为刺激因子,观察原代培养大鼠肝细胞(hepatocyte, HC)在刺激前后胶原合成、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达和钙拮抗剂维拉帕米(verapamil, Ver)对此过程的影响,以探讨肝细胞在肝纤维化形成中的可能作用。

    1 材料和方法

    1.1 主要材料 SD雄性大鼠,体重300±50 g,中科院上海实验动物中心提供。PDGF-BB:Sigma公司产品。Ver: Knoll公司产品。SperumDNA:ICN公司产品。地高辛标记检测试剂盒;宝灵曼公司产品。Ⅰ、Ⅲ型前胶原cDNA质粒:上海第二医科大学生化教研室。
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    1.2 实验方法

    1.2.1 特殊试剂配制 (1)Ver盐酸盐注射液:以注射用水稀释,使其终浓度分别为5 mg.L-1,10 mg.L-1和20 mg.L-1。(2)Bul 1:顺丁烯二酸0.1 mol.L-1,NaCl 0.15 mol.L-1,用NaOH调pH至7.5,高压灭菌。(3)Bul 2(预杂交液):4×SSC 2 ml, 40% Formamide 4 ml, 1×Denhard′s 200 μl, 5% Dextran Sulfate 2.5 ml, 0.025% tRNA 500 μl, 0.05% SperumDNA 500 μl,DEP H2O定容至10 ml。(4)Bul 3: Tris-HCl 0.1 mol.L-1, NaCl 0.1 mol.L-1, MgCl2 0.05 mol.L-1用HCl调pH至9.5。(5)Bul 4: Tris-HCl 10 mol.L-1, EDTA 1 mol.L-1, pH8.0。
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    1.2.2 分离大鼠肝细胞 参照徐叔云等〔1〕的方法加以改良分离大鼠肝细胞。简述如下:给大鼠戊巴比妥钠(30 mg*kg-1)腹腔注射麻醉,打开腹腔,进行门静脉插管,先后用无钙灌流液和酶灌流液灌流,取肝剪碎,计数细胞活率大于90%以上时,调整细胞数为每毫升5×105,接种于24孔培养板中,培养在含5%CO2的37℃孵育箱中。

    1.2.3 Ver、PDGF对大鼠肝细胞胶原合成的影响

    以3H-脯氨酸的掺入量代表肝细胞胶原合成的活动情况。肝细胞培养5~7天后,弃培养液,换加含1%小牛血清的DMEM培养液,并加入PDGF等处理因素,对照组分别加入等量的药物溶剂,设三复孔。继续培养24 h,每孔分别加入3H-脯氨酸3.7×105Bq,24 h后,在Ysj-75型液闪读数仪上测定样品的放射性(cpm)。
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    1.2.4 探针标记 按德国宝灵曼公司生产的地高辛标记检测试剂盒中的说明书进行。标记好的探针置-20℃保存。

    1.2.5 原位杂交 分离的肝细胞培养5~7天后,加入PDGF、Ver等处理因素(剂量同第一部分),对照组分别加入等量的药物溶剂,在相同条件下继续培养24 h后,将肝细胞从培养板中消化下来,用PBS、0.1%BSA、0.02%叠氮钠混合液洗涤3次,离心(3000 r.min-1×5 min)。调整细胞密度至1×106,涂片,3%多聚甲醛固定5 min。预杂交、杂交,依次用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC洗涤15 min,Buf l洗5 min,置Bufl+2%NSS中,室温下孵育30 min。抗原抗体结合,室温2 h。Buf 1洗,室温2×15 min,Buf 3洗,室温2 min,给予显色液(Buf 3+X-P+NBT),暗孵育(37℃中5 h),Buf 4洗5 min后,HE染色,乙醇梯度脱水,甲苯透明,中性树胶封片。
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    2 结果

    2.1 Ver和PDGF对大鼠原代培养肝细胞3H-脯氨酸掺入的影响 观察PDGF-ΒΒ(10 μg.L-1)在1%血清存在下,对肝细胞3H-脯氨酸掺入的影响。结果显示,在PDGF作用下,肝细胞3H-脯氨酸的掺入明显高于对照组(P<0.01),说明PDGF具有显著促进HC胶原合成的作用。此外,从表1中还可以看出,Ver对PDGF的促3H-脯氨酸掺入有抑制作用,但3个浓度间抑制程度没有明显差别,而其对正常HC3H-脯氨酸掺入则无影响。

    表1 Ver、PDGF对大鼠HC3H-脯氨酸掺入影响() 组别

    n

, 百拇医药     cpm

    对照组

    3

    624±86

    PDGF组

    3

    5738±76**

    PDGF+Ver小

    3

    2910±54△△

    PDGF+Ver中

    3
, 百拇医药
    2209±61△△

    PDGF+Ver大

    3

    2929±45△△

    与对照组比较,P<0.01;与PDGF组比,△△P<0.01

    2.2 Ver、PDGF对HC胶原基因表达的影响 用图像分析系统处理原位杂交颗粒,N代表细胞阳性杂交颗粒数,RATIO为单位面积内阳性杂交颗粒数。结果显示,正常及PDGF刺激后的HC均有Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达,但Ⅲ型表达较Ⅰ型为弱,PDGF作用后的HCⅠ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平显著高于正常HC(P<0.01)(表2),而Ver中、大剂量则能抑制PDGF的这种刺激作用。另外,如表2所示,N和RATIO两类数值是不平行的,RATIO排除了细胞面积大小对杂交结果的影响,故能更准确地反映前胶原mRNA表达情况。
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    表2 Ver、PDGF对HCⅠ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响 组别

    Ⅰ型

    Ⅲ型

    N

    RAT10

    N

    RAT10

    对照组

    162

    11.15

    104

    7.8
, 百拇医药
    PDGF

    429

    34.66

    297

    19.25

    PDGF+Ver小

    221

    17.11

    187

    10.61

    PDGF+Ver中

, 百拇医药     74

    3.89△△

    42

    2.89△△

    PDGF+Ver大

    41

    2.87△△

    29

    1.56△△△

    与对照组比较,P<0.01;与PDGF组比较,P>0.05,△△P<0.05,△△△P<0.01;与Ⅰ型比较:#P<0.05
, 百拇医药
    3 讨论

    肝纤维化是多种损伤因子导致肝脏慢性损伤的结果,表现为肝组织内细胞外基质的过度沉积和分布异常。这些细胞外基质包括胶原、非胶原糖蛋白及蛋白多糖等。其中胶原含量的显著升高是最具特征的改变。因此,胶原代谢成为肝纤维化研究的主要内容之一。肝纤维化时胶原含量的增加源自胶原的合成和分解紊乱,其中以胶原的过度合成为主,Ⅰ型和Ⅲ型胶原的过度合成在肝纤维化时最为显著〔2〕。自Ohuchi等于1972年发现肝细胞内存在大量的胶原合成所必须的脯氨酸羟化酶以来,有关肝细胞是否合成胶原的问题引起了诸多学者的重视。为了能较好地反映在体肝细胞的代谢活性,我们采用正常SD大鼠的原代培养肝细胞进行研究。除补体Ciq及胆碱酯酶等成分外,羟脯氨酸乃是胶原蛋白中所含的特有氨基酸,因此,常通过测定羟脯氨酸来进行胶原定量。

    蛋白质的合成都经历DNA→RNA→蛋白质的过程。mRNA携带转录自DNA的遗传信息,成为蛋白质翻译的模板。特异mRNA的转录调节(即基因表达调节)成为其蛋白质合成调节的首要环节。所以检测某种蛋白质特异mRNA的水平,即可在转录水平了解其代谢调节的变化。胶原的合成也同其他蛋白质一样,先由胶原基因转录为各种前胶原α链的特异mRNA,再由核蛋白体翻译为相应的肽链。因此我们可以从前胶原mRNA的表达、胶原定量来系统了解一下胶原的合成情况。
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    以往的研究显示:在株化肝细胞研究中,培养肝细胞是在融合(confluent)状态下不经传代地连续培养一定时间才可见胶原生成〔3〕,原代培养肝细胞经约5~7天的培养始有胶原合成功能的活化,原代培养的肝细胞随着培养时间延长,其胶原合成活性逐渐上升〔4〕。一般的正常肝细胞,其胶原合成活性是很低的或是抑制的〔5〕,肝细胞是在某些因素的作用下,从而表达了潜在的胶原合成作用〔6〕。晚近的研究表明:PDGF具有促进人成纤维细胞、大鼠肝贮脂细胞胶原合成的作用;正常及纤维化肝脏均有PDGF-AA、PDGF-BB及PDGFR-β mRNA的表达,纤维化肝脏中表达水平显著高于正常肝脏;PDGF-BB促进细胞增殖作用强于PDGF-AA。为此我们选择PDGF-BB作为刺激因子,观察原代培养大鼠肝细胞在刺激前后胶原合成、Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达水平及钙拮抗剂的治疗作用。结果显示:原代培养的肝细胞经5~7天培养后,能够合成胶原,且有Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达,但表达水平较低,经PDGF刺激后,肝细胞的胶原合成和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达显著增强,然Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达强度不同,Ⅰ型胶原基因的表达高于Ⅲ型胶原基因的表达,这些研究为肝细胞参与肝纤维化形成提供了实验依据。
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    作者简介:胡颖,女,36岁,博士,主治医师。研究方向:肝纤维化、胃癌

    陆汉明,男,76岁,教授,博士生导师。

    参考文献

    1 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社,1986:528~530

    2 国隆一郎.肝细胞コウ—ゲ二产生.肝胆萃,1990;20(4):636

    3 木神原耕子.肝细胞のコ—テデ二纤维形成.肝胆萃,1990;21:603

    4 Chojkier M, Lyche KD, Filip M. Increased production of collagen in vivo by hepatocytes and nonparenchymal cells in rats with carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis. Hepatology, 1988;8(4):808

    5 Hata R, Ninomiya Y. Hepatocytes (hepatic parenchymal cells) produce a major part of collagen in vivo. Biochem Int, 1984;8(2):181

    6 刘学松,李定国,陆汉明.肝细胞的胶原合成与肝纤维化.中华消化杂志,1994;4(1):53

    收稿日期:1998-05-22, 百拇医药