雷公藤治疗系统性红斑狼疮免疫机制的研究
作者：虞海燕 秦万章 吴厚生
单位：虞海燕 杭州 310003 浙江医科大学附属邵逸夫医院；秦万章 上海医科大学附属中山医院；吴厚生 上海医科大学医学检验系
关键词：雷公藤；系统性红斑狼疮；免疫机制
中国现代应用药学990204摘要 目的：探讨雷公藤治疗系统性红斑狼疮的免疫作用机制。方法：用系统性红斑狼疮(SLE)的外周血单个核细胞(PBMC)体外培养观察雷公藤对于SLE的T、B细胞功能的影响。结果：雷公藤不仅能抑制SLE病人PBMC对PHA诱导的增殖反应，也能抑制SLE病人活化B细胞的自发增殖以及SAC诱导的静止期B细胞的增殖反应。另外雷公藤还能明显的抑制SLE病人PBMC的自发性IgG分泌以及r-IL2诱导的PBMC的IgG分泌，进一步研究雷公藤对PBMC在PWM的刺激下IgG分泌影响的时效关系，结果显示在培养0，24，48和72h加入雷公藤均能显示明显的抑制作用，而在96h以后加入雷公藤则不呈现明显的抑制作用。结论：雷公藤治疗SLE的机制可能在于它能对SLE亢进的多个免疫环节起作用，它不仅能抑制T细胞的功能，还能直接抑制亢进的B细胞功能。其抑制IgG产生的主要作用环节可能在于抑制B细胞的活化，增殖阶段，而不是分化分泌阶段。
, 百拇医药
Immunomechanism of tripterygium wilforddi hook in systemic lupus erythematosus treatment
Yu Haiyan(Yu HY),Qin Wanzhang(Qin WZ),Wu Housheng(Wu HS)(Sir Run Run Shaw Hospital of Zhejiang University,Hangzhou 310003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To inverstigate the immunomechanism of Tripterygium Wilforddi Hook(TWH) in the treatment of SLE patients.METHODS:The periphral blood mononuclear cell(PBMC) from normal volunteers and SLE patients were used to study the effects TWH on T and B cell function in vitro.RESULTS:TWH markedly inhibited the PHA-induced PBMC proliferation.It also inhibited the spontaneous proliferation of the activated B cells from SLE patients and resting B cells proliferation induced by mitogen staphylococcus Aureus Cowan (SAC).Moreover,it suppressed spontaneous IgG production and IL-2 induced IgG production for PBMC from SLE patients.It also inhibited the IgG production of PBMC induced by PWM.The time course of TWH inhibition showed that the effect on IgG production of PBMC induced by PWM only occurred in the first 72 hours after exposure to TWH in vitro.CONCLUSION:The mechanism of TWH in SLE treatment not only owe to inhibition on Thcells function,but also to its direct inhibition on increased B cells fuction.The inhibition may mainly occur in the activation and proliferation stages of T and B cells.
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KEY WORDS systemic lupus erythematosus;tripterygium wilforddi hook T cell Bcell
雷公藤作为免疫抑制药物在近20年来已被广泛用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病。临床观察[1]发现雷公藤不仅能改善SLE病人的临床症状，对免疫学上的异常变化也有一定的改善作用，能降低γ-球蛋白，使抗核抗体(ANA)转阴或滴度下降，推测雷公藤可能抑制SLE亢进的体液免疫而使病情得到控制和改善，但其治疗SLE的详细作用机理还不甚清楚，动物实验表明雷公藤能抑制T细胞的增殖反应，抑制T辅助细胞产生IL2并抑制IL2-R的表达，故而认为雷公藤是主要作用于T细胞而间接抑制体液免疫反应的[2，3]。我们知道系统性红斑狼疮存在有T辅助功能及B细胞功能亢进的现象，并且以系统性红斑狼疮病人的外周血单个核细胞体外培养也发现其自发性细胞增殖与自发性IgG分泌的功能均明显增高。因此本文采用SLE病人外周血单个核细胞作为“细胞模型”体外培养观察雷公藤对SLE病人的T、B细胞功能的影响从而推测其详细的作用机制。
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1 研究对象与方法
1.1 研究对象
SLE病人22例，均选自上海医科大学附属中山医院自身免疫病专科门诊。病例均符合1982年美国风湿病协会(ARA)修正的诊断标准[4]，疾病的活动性按以下指标判断：①活动性皮疹；②光敏感；③关节炎或关节痛；④明显乏力，发热37.2℃以上；⑤肌痛及肌无力；⑥淋巴结肿大；⑦浆膜炎；⑧心、肝、肾损害；⑨血常规异常；⑩尿常规异常；血沉升高，粘蛋白升高或RF阳性；补体低下；免疫球蛋白、C-反应蛋白和γ-球蛋白均升高；狼疮细胞阳性；抗SM抗体阳性；抗核抗体(ANA)阳性；循环免疫复合物>0.05；抗ds-DNA抗体阳性；Ea、Et降低。以上指标有四项或以上者为活动期。选用的病例平均年龄为30±8.3岁。其中女性21例，活动期为16例。正常人对照选自上海医科大学医学检验系员工，以性别、年龄配对。
1.2 药品与试剂
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1.2.1 雷公藤去皮根：用福建光泽产的雷公藤去皮根50g,加水浸泡24h,煮沸1h,收取煎液，重复3次，低压蒸馏浓缩至50ml,即成为相当于1g/ml的雷公藤水煎剂。
1.2.2 有丝分裂原：植物血凝素PHA-M(DIFCO,USA),美洲商陆PWM(SIGMA,USA),金黄色葡萄球菌Cowan-Ⅰ株SAC(上海医科大学检验免疫室提供)。
1.3 方法
1.3.1 自发性淋巴细胞增殖试验：从正常人和红斑狼疮病人外周静脉血中分离得外周血单个核细胞经洗涤后配成2×106/ml,在96孔细胞板中每孔加100μl,同时加入100μl RPMI1640培养液及不同的药物，并加入0.5μci/孔的3H-TdR,置37℃ 5% CO2培养箱中培养6h,收集细胞，以Beckman LS8000液体闪烁仪检测掺入细胞的3H-TdR量，以CMP值表示。
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1.3.2 IL2的产生和检测：从SLE病人及正常人外周血中分离得的外周血单个核细胞经二次洗涤后调节细胞浓度，于24孔培养板内各加入0.2ml细胞1×106/ml 4% PHA及药物。置37℃ 5% CO2培养箱中培养24h,离心取上清,-70℃保存待测。IL2的检测以CTLL细胞株检测[3]。
1.3.3 IgG的产生与检测：从外周血中分离出的单个核细胞配成2×106/ml悬液，在24孔培养板中每孔加0.2ml,再加0.2ml 10% NBS的RPMI1640或PWM(10μg/ml)或γ-IL2(125u/ml),并加入药物，置37℃ 5% CO2培养箱中培养7d后收集上清，置-70℃冰箱保存待测。IgG的含量则以酶联免疫吸附法ELISA测定。
1.3.4 有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖试验：按每孔100μl加配制好的细胞悬液至96孔细胞培养板中，同时加入不同的有丝分裂原(PHA,SAC)及雷公藤，置于5% CO2 37℃培养箱中培养72h。在培养结束前16h加入0.5μci/孔3H-TdR,收集细胞，以液体闪烁仪测定掺入细胞的3H-TdR量，以CPM值(±s)来表示。
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2 结 果
2.1 雷公藤对自发性淋巴细胞增殖的影响
观察正常人和SLE病人的外周血单个核细胞在体外的自发性增殖情况以及雷公藤对它们的影响发现：正常人在无分裂原刺激下仅有略微的增殖，其3H-TdR掺入值为177.6±19，而SLE病人的外周血单个核细胞却有明显的增殖反应，其3H-TdR掺入量平均为362.5±187。雷公藤对于SLE病人已增高的自发性增殖有抑制作用，经配对T检验P值均小于0.05。而对于正常人的自发性增殖无抑制作用，P值大于0.05，见表1。
表1 雷公藤对SLE病人和正常人PBMC自发性增殖的影响(n=7) 组 别
空白对照*
雷公藤*
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P值
正常人
177.6±19
156.6±19
>0.05
SLE病人
362.5±187
210±63
<0.05
*：3HTdR掺入量CPM值
2.2 雷公藤对正常人及SLE病人的外周血单个核细胞对PHA诱导增殖反应的影响
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正常人及SLE病人的外周血单个核细胞对PHA诱导的增殖反应显示，活动期SLE病人的增殖反应明显低于正常人及稳定期SLE病人(P<0.01)，它们的刺激指数SI(SI=刺激后的CPM值/刺激前的CPM值)分别为活动期SI=3.067±3.0,稳定期SI=36.67±16,正常人对照SI=26.59±14。而雷公藤对正常人及患者的T细胞增殖反应均有明显的抑制作用，且抑制率在正常人及患者之间无显著性差异，见表2。表2 雷公藤对有丝分裂原刺激PBMC增殖反应的影响(n=7) 组别
空白对照*
+PHA*
+PHA+雷公藤*
正常人
288±130
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17645±1245
177±38
SLE病人
598±264
21002±7701
184±45
P值
>0.05
*：3HTdR掺入量CPM值
2.3 雷公藤对SLE患者IL2产生的抑制作用
以患者的PBMC与PHA共育24h，加或不加雷公藤，观察药物对SLE患者的PBMC产生IL2的影响。结果发现雷公藤具有明显的抑制IL2产生的能力。未加雷公藤组SLE患者的PBMC产生的IL2的量为5132±2949，而加雷公藤组SLE患者的PBMC产生的IL2的量只有485±130，抑制率为90.54%。因为我们应用CTLL检测IL2的含量，故而为了排除药物本身对CTLL细胞影响的干扰，我们加雷公藤至含有γ-IL2的CTLL细胞中观察药物对CTLL增殖的抑制情况，结果发现雷公藤对CTLL细胞无明显的抑制作用，对照组CPM值164013±15411，而雷公藤组为121980±2235(P>0.05)，从而说明实验检测得出的雷公藤去皮根对IL2产生具有的抑制作用并不是药物直接抑制CTLL细胞增殖而产生的干扰现象。
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2.4 雷公藤对正常人及SLE患者SAC诱导的B细胞增殖反应的影响
SAC是一种选择性作用于B细胞的致有丝分裂原，主要诱导静止期B细胞的增殖。观察正常人及SLE患者的PBMC对SAC的反应以及雷公藤对反应的影响。发现活动期SLE患者的刺激指数SI为3.32±1.57，而稳定期SLE患者与正常人的刺激指数分别为7.45±3.6，10.18±5.8，可见活动期SLE患者的B细胞增殖反应明显低于正常人对照及稳定期患者(P>0.05)，而稳定期的SLE患者的增殖反应与正常人无明显差异(P>0.05)。观察雷公藤对正常人及活动期SLE患者的B细胞对于SAC诱导的增殖反应发现：雷公藤对正常人及SLE患者的B细胞增殖反应均具明显的抑制作用，抑制率在各组之间无明显的差异(P>0.05)，见表3。
表3 雷公藤对SAC诱导的PBMC增殖反应的影响(n=7)
组别
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空白对照*
+SAC*
+SAC+雷公藤*
抑制率
(%)
正常人
288±130
2766±1799
141±30
93.49
SLE病人
598±264
, 百拇医药
4291±3941
177±26
94.54
*：3HTdR掺入量CPM值
2.5 雷公藤对PWM诱导的PBMC分泌IgG的影响
PWM是T细胞依赖的B细胞激活剂，观察雷公藤对PWM诱导的PBMC分泌IgG的影响结果发现雷公藤对正常人PWM诱导的PBMC分泌IgG具有明显的抑制作用，其抑制率为76.6%±27%。我们进一步观察它们作用的时效关系发现，分别在培养的0，24，48和72h加入雷公藤抑制PWM诱导的PBMC产生IgG，而在培养的96h以后，加入雷公藤则不呈现抑制作用，见表4。表4 雷公藤对正常人PBMC在PWM诱导下产生IgG量的时效关系(±s)
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PWM对照组
时间(h)
0
24
48
72
96
120
IgG分泌量(ng/ml)
1071.98±738
353.35±65
243.6±38
275.8±36
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284.3±84
1210±421
1045±369
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
>0.05
2.6 雷公藤对SLE的PBMC对γ-IL2反应的影响
活化的B细胞表面可表达IL2受体，观察SLE患者与正常人的PBMC对γ-IL2的反应，发现SLE的PBMC对γ-IL2的反应性明显比正常人增高，正常人未加γ-IL2时IgG分泌为317.6±100ng/ml,加γ-IL2后IgG的分泌为466.7±74ng/ml。而SLE患者的PBMC产生IgG量加γ-IL2后从原先的745.56±71.8ng/ml增高到1246.5±90ng/ml。雷公藤能明显抑制SLE的PBMC对γ-IL2反应后的IgG产生，见表5。
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2.7 雷公藤对SLE患者PBMC自发性产生IgG的影响
SLE患者的外周血单个核细胞自发性产生IgG的量明显高于正常对照，而雷公藤能明显抑制SLE患者的PBMC IgG的自发性产生，见表5。表5 雷公藤对SLE病人的自发性和IL2刺激后IgG产生量(ng/ml)的影响(n=7) 组 别
不加IL2
加入IL2
对照组
745.56±71.8
1246.5±90
雷公藤组
165.77±87
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368.9±182
P值
<0.01
<0.01
3 讨 论
雷公藤是一种免疫抑制剂已为人们所公认，基础药理研究已证明它具有免疫抑制剂活性。动物实验表明它对小鼠以溶血素为指标的初次和再次免疫反应均有抑制作用，能抑制T细胞的增殖反应、Th细胞的IL2产生以及IL2-R的表达[2]。本文系统地检测了它对于SLE患者PBMC的T、B细胞功能的影响，结果发现SLE患者的PBMC本身存在有自发性淋转的增高，此自发性淋转增高推测是一种活化的B细胞亚群自发性增殖的结果[6]。雷公藤能显著的抑制此种自发性增殖，故而说明雷公藤具有抑制活化B细胞增殖的功能。SAC是一选择性作用于静止期B细胞的有丝分裂原[5]，检测雷公藤对SAC诱导后PBMC增殖反应的影响，发现它对于SLE患者以及正常人的PBMC对SAC诱导的增殖反应均有明显的抑制作用，两者抑制率无显著性差异。此说明雷公藤不仅抑制已活化B细胞的增殖反应也能抑制静止期B细胞的活化增殖反应。而PHA是T细胞的有丝分裂原，检测SLE患者PBMC对PHA诱导后T细胞增殖反应的情况结果显示活动期的SLE患者其PBMC对PHA诱导所产生的增殖反应明显低于稳定期SLE患者和正常人组，而稳定期SLE患者与正常人无显著差异，加入雷公藤以后发现雷公藤对正常人及SLE患者的增殖功能均有明显的抑制作用，抑制率分别为90.46%和90.35%，两者无显著性差异。说明雷公藤也具有明显的抑制T细胞增殖反应。
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雷公藤还能抑制SLE患者的PBMC对于γ-IL2的高反应性，加入雷公藤后，IgG的分泌量明显下降，我们知道IL2是Th细胞产生的一种淋巴因子，主要功能是维持T细胞的增殖、分化。最近有文献报道它也是一种B细胞因子，能促进B细胞的增殖，SLE的活化B细胞增高，B细胞表面表达IL2增高，故而反应性增高[7]，说明雷公藤可能通过抑制IL2刺激B细胞的增殖进而使IgG分泌降低。
雷公藤对自发性IgG分泌有明显的抑制作用，目前已知SLE的自发性IgG分泌增高可能是由于B细胞自身活化增殖所致[6]。而雷公藤也可能通过抑制了B细胞自发活化增殖而间接地导致IgG分泌的下降。
PWM是T细胞依赖的B细胞激活剂，我们还观察了雷公藤对PWM诱导的正常人PBMC产生IgG的作用，发现雷公藤能明显抑制PWM诱导IgG产生，为了进一步证实它抑制的作用环节，我们分别在不同时间内加入雷公藤及其单体，发现在0，24，48和72h加入均能表现出抑制效应，根据细胞体外活化分裂周期，静止期的细胞在体外经有丝分裂原的活化后，从G0期进入G1期，进一步进入S期经历了72h，而后再分化成分泌细胞进而成为浆细胞分泌IgG，故而我们可以推测雷公藤对于IgG的抑制作用环节在于细胞的活化和增殖阶段，而不是分泌分化阶段。
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综上所述雷公藤对于SLE的治疗机理在于它能对SLE亢进的多个免疫环节起作用，不仅抑制T细胞功能，还能直接抑制亢进的B细胞功能，抑制B细胞的增殖活化，抑制活化B细胞对于γ-IL2的反应，对于IgG产生的抑制环节主要在于抑制了T、B细胞的增殖活化阶段。
参考文献
[1] 秦万章，向熙瑞.雷公藤治疗红斑狼疮等结缔组织病的研究体会.江苏医药，1987，13(12)∶655.
[2] 南京军区医院临床实验科.雷公藤T与黄精Po对淋巴细胞的作用.江苏医药，1979，(10)∶5.
[3] 匡彦德.雷公藤对IL2的产生和IL2受体表达的抑制作用.上海免疫学杂志，1988，8(4)∶250.
[4] Tan EM,Cohem AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of SLE.Arthritis Reum,1982,25∶1271.
, 百拇医药
[5] Kehrl JH,Muraguchi A,Butler JL,et al.Human B cell activition,proliferation and differentiation.Immunological Rev,1984,78∶75.
[6] Yan K,Morimasa K,Asano T,et al.Characteriation of the spontaneous DNA synthesizing and/or IgG secreting cells in peripheral blood from patients with SLE.Clin Immunol J,1985,35(1)∶57.
[7] Lehmann KR,Kotzin Bl,Portanova JP,et al.Interleukin is a proliferative signal for B cells from autoimmune mice.Eur J Immunol,1986,16(9)∶1105.
收稿日期：1998-03-10, 百拇医药
单位：虞海燕 杭州 310003 浙江医科大学附属邵逸夫医院；秦万章 上海医科大学附属中山医院；吴厚生 上海医科大学医学检验系
关键词：雷公藤；系统性红斑狼疮；免疫机制
中国现代应用药学990204摘要 目的：探讨雷公藤治疗系统性红斑狼疮的免疫作用机制。方法：用系统性红斑狼疮(SLE)的外周血单个核细胞(PBMC)体外培养观察雷公藤对于SLE的T、B细胞功能的影响。结果：雷公藤不仅能抑制SLE病人PBMC对PHA诱导的增殖反应，也能抑制SLE病人活化B细胞的自发增殖以及SAC诱导的静止期B细胞的增殖反应。另外雷公藤还能明显的抑制SLE病人PBMC的自发性IgG分泌以及r-IL2诱导的PBMC的IgG分泌，进一步研究雷公藤对PBMC在PWM的刺激下IgG分泌影响的时效关系，结果显示在培养0，24，48和72h加入雷公藤均能显示明显的抑制作用，而在96h以后加入雷公藤则不呈现明显的抑制作用。结论：雷公藤治疗SLE的机制可能在于它能对SLE亢进的多个免疫环节起作用，它不仅能抑制T细胞的功能，还能直接抑制亢进的B细胞功能。其抑制IgG产生的主要作用环节可能在于抑制B细胞的活化，增殖阶段，而不是分化分泌阶段。
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Yu Haiyan(Yu HY),Qin Wanzhang(Qin WZ),Wu Housheng(Wu HS)(Sir Run Run Shaw Hospital of Zhejiang University,Hangzhou 310003)
ABSTRACT OBJECTIVE：To inverstigate the immunomechanism of Tripterygium Wilforddi Hook(TWH) in the treatment of SLE patients.METHODS:The periphral blood mononuclear cell(PBMC) from normal volunteers and SLE patients were used to study the effects TWH on T and B cell function in vitro.RESULTS:TWH markedly inhibited the PHA-induced PBMC proliferation.It also inhibited the spontaneous proliferation of the activated B cells from SLE patients and resting B cells proliferation induced by mitogen staphylococcus Aureus Cowan (SAC).Moreover,it suppressed spontaneous IgG production and IL-2 induced IgG production for PBMC from SLE patients.It also inhibited the IgG production of PBMC induced by PWM.The time course of TWH inhibition showed that the effect on IgG production of PBMC induced by PWM only occurred in the first 72 hours after exposure to TWH in vitro.CONCLUSION:The mechanism of TWH in SLE treatment not only owe to inhibition on Thcells function,but also to its direct inhibition on increased B cells fuction.The inhibition may mainly occur in the activation and proliferation stages of T and B cells.
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KEY WORDS systemic lupus erythematosus;tripterygium wilforddi hook T cell Bcell
雷公藤作为免疫抑制药物在近20年来已被广泛用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病。临床观察[1]发现雷公藤不仅能改善SLE病人的临床症状，对免疫学上的异常变化也有一定的改善作用，能降低γ-球蛋白，使抗核抗体(ANA)转阴或滴度下降，推测雷公藤可能抑制SLE亢进的体液免疫而使病情得到控制和改善，但其治疗SLE的详细作用机理还不甚清楚，动物实验表明雷公藤能抑制T细胞的增殖反应，抑制T辅助细胞产生IL2并抑制IL2-R的表达，故而认为雷公藤是主要作用于T细胞而间接抑制体液免疫反应的[2，3]。我们知道系统性红斑狼疮存在有T辅助功能及B细胞功能亢进的现象，并且以系统性红斑狼疮病人的外周血单个核细胞体外培养也发现其自发性细胞增殖与自发性IgG分泌的功能均明显增高。因此本文采用SLE病人外周血单个核细胞作为“细胞模型”体外培养观察雷公藤对SLE病人的T、B细胞功能的影响从而推测其详细的作用机制。
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1 研究对象与方法
1.1 研究对象
SLE病人22例，均选自上海医科大学附属中山医院自身免疫病专科门诊。病例均符合1982年美国风湿病协会(ARA)修正的诊断标准[4]，疾病的活动性按以下指标判断：①活动性皮疹；②光敏感；③关节炎或关节痛；④明显乏力，发热37.2℃以上；⑤肌痛及肌无力；⑥淋巴结肿大；⑦浆膜炎；⑧心、肝、肾损害；⑨血常规异常；⑩尿常规异常；血沉升高，粘蛋白升高或RF阳性；补体低下；免疫球蛋白、C-反应蛋白和γ-球蛋白均升高；狼疮细胞阳性；抗SM抗体阳性；抗核抗体(ANA)阳性；循环免疫复合物>0.05；抗ds-DNA抗体阳性；Ea、Et降低。以上指标有四项或以上者为活动期。选用的病例平均年龄为30±8.3岁。其中女性21例，活动期为16例。正常人对照选自上海医科大学医学检验系员工，以性别、年龄配对。
1.2 药品与试剂
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1.2.1 雷公藤去皮根：用福建光泽产的雷公藤去皮根50g,加水浸泡24h,煮沸1h,收取煎液，重复3次，低压蒸馏浓缩至50ml,即成为相当于1g/ml的雷公藤水煎剂。
1.2.2 有丝分裂原：植物血凝素PHA-M(DIFCO,USA),美洲商陆PWM(SIGMA,USA),金黄色葡萄球菌Cowan-Ⅰ株SAC(上海医科大学检验免疫室提供)。
1.3 方法
1.3.1 自发性淋巴细胞增殖试验：从正常人和红斑狼疮病人外周静脉血中分离得外周血单个核细胞经洗涤后配成2×106/ml,在96孔细胞板中每孔加100μl,同时加入100μl RPMI1640培养液及不同的药物，并加入0.5μci/孔的3H-TdR,置37℃ 5% CO2培养箱中培养6h,收集细胞，以Beckman LS8000液体闪烁仪检测掺入细胞的3H-TdR量，以CMP值表示。
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1.3.2 IL2的产生和检测：从SLE病人及正常人外周血中分离得的外周血单个核细胞经二次洗涤后调节细胞浓度，于24孔培养板内各加入0.2ml细胞1×106/ml 4% PHA及药物。置37℃ 5% CO2培养箱中培养24h,离心取上清,-70℃保存待测。IL2的检测以CTLL细胞株检测[3]。
1.3.3 IgG的产生与检测：从外周血中分离出的单个核细胞配成2×106/ml悬液，在24孔培养板中每孔加0.2ml,再加0.2ml 10% NBS的RPMI1640或PWM(10μg/ml)或γ-IL2(125u/ml),并加入药物，置37℃ 5% CO2培养箱中培养7d后收集上清，置-70℃冰箱保存待测。IgG的含量则以酶联免疫吸附法ELISA测定。
1.3.4 有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖试验：按每孔100μl加配制好的细胞悬液至96孔细胞培养板中，同时加入不同的有丝分裂原(PHA,SAC)及雷公藤，置于5% CO2 37℃培养箱中培养72h。在培养结束前16h加入0.5μci/孔3H-TdR,收集细胞，以液体闪烁仪测定掺入细胞的3H-TdR量，以CPM值(±s)来表示。
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2 结 果
2.1 雷公藤对自发性淋巴细胞增殖的影响
观察正常人和SLE病人的外周血单个核细胞在体外的自发性增殖情况以及雷公藤对它们的影响发现：正常人在无分裂原刺激下仅有略微的增殖，其3H-TdR掺入值为177.6±19，而SLE病人的外周血单个核细胞却有明显的增殖反应，其3H-TdR掺入量平均为362.5±187。雷公藤对于SLE病人已增高的自发性增殖有抑制作用，经配对T检验P值均小于0.05。而对于正常人的自发性增殖无抑制作用，P值大于0.05，见表1。
表1 雷公藤对SLE病人和正常人PBMC自发性增殖的影响(n=7) 组 别
空白对照*
雷公藤*
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P值
正常人
177.6±19
156.6±19
>0.05
SLE病人
362.5±187
210±63
<0.05
*：3HTdR掺入量CPM值
2.2 雷公藤对正常人及SLE病人的外周血单个核细胞对PHA诱导增殖反应的影响
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正常人及SLE病人的外周血单个核细胞对PHA诱导的增殖反应显示，活动期SLE病人的增殖反应明显低于正常人及稳定期SLE病人(P<0.01)，它们的刺激指数SI(SI=刺激后的CPM值/刺激前的CPM值)分别为活动期SI=3.067±3.0,稳定期SI=36.67±16,正常人对照SI=26.59±14。而雷公藤对正常人及患者的T细胞增殖反应均有明显的抑制作用，且抑制率在正常人及患者之间无显著性差异，见表2。表2 雷公藤对有丝分裂原刺激PBMC增殖反应的影响(n=7) 组别
空白对照*
+PHA*
+PHA+雷公藤*
正常人
288±130
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17645±1245
177±38
SLE病人
598±264
21002±7701
184±45
P值
>0.05
*：3HTdR掺入量CPM值
2.3 雷公藤对SLE患者IL2产生的抑制作用
以患者的PBMC与PHA共育24h，加或不加雷公藤，观察药物对SLE患者的PBMC产生IL2的影响。结果发现雷公藤具有明显的抑制IL2产生的能力。未加雷公藤组SLE患者的PBMC产生的IL2的量为5132±2949，而加雷公藤组SLE患者的PBMC产生的IL2的量只有485±130，抑制率为90.54%。因为我们应用CTLL检测IL2的含量，故而为了排除药物本身对CTLL细胞影响的干扰，我们加雷公藤至含有γ-IL2的CTLL细胞中观察药物对CTLL增殖的抑制情况，结果发现雷公藤对CTLL细胞无明显的抑制作用，对照组CPM值164013±15411，而雷公藤组为121980±2235(P>0.05)，从而说明实验检测得出的雷公藤去皮根对IL2产生具有的抑制作用并不是药物直接抑制CTLL细胞增殖而产生的干扰现象。
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2.4 雷公藤对正常人及SLE患者SAC诱导的B细胞增殖反应的影响
SAC是一种选择性作用于B细胞的致有丝分裂原，主要诱导静止期B细胞的增殖。观察正常人及SLE患者的PBMC对SAC的反应以及雷公藤对反应的影响。发现活动期SLE患者的刺激指数SI为3.32±1.57，而稳定期SLE患者与正常人的刺激指数分别为7.45±3.6，10.18±5.8，可见活动期SLE患者的B细胞增殖反应明显低于正常人对照及稳定期患者(P>0.05)，而稳定期的SLE患者的增殖反应与正常人无明显差异(P>0.05)。观察雷公藤对正常人及活动期SLE患者的B细胞对于SAC诱导的增殖反应发现：雷公藤对正常人及SLE患者的B细胞增殖反应均具明显的抑制作用，抑制率在各组之间无明显的差异(P>0.05)，见表3。
表3 雷公藤对SAC诱导的PBMC增殖反应的影响(n=7)
组别
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空白对照*
+SAC*
+SAC+雷公藤*
抑制率
(%)
正常人
288±130
2766±1799
141±30
93.49
SLE病人
598±264
, 百拇医药
4291±3941
177±26
94.54
*：3HTdR掺入量CPM值
2.5 雷公藤对PWM诱导的PBMC分泌IgG的影响
PWM是T细胞依赖的B细胞激活剂，观察雷公藤对PWM诱导的PBMC分泌IgG的影响结果发现雷公藤对正常人PWM诱导的PBMC分泌IgG具有明显的抑制作用，其抑制率为76.6%±27%。我们进一步观察它们作用的时效关系发现，分别在培养的0，24，48和72h加入雷公藤抑制PWM诱导的PBMC产生IgG，而在培养的96h以后，加入雷公藤则不呈现抑制作用，见表4。表4 雷公藤对正常人PBMC在PWM诱导下产生IgG量的时效关系(±s)
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PWM对照组
时间(h)
0
24
48
72
96
120
IgG分泌量(ng/ml)
1071.98±738
353.35±65
243.6±38
275.8±36
, 百拇医药
284.3±84
1210±421
1045±369
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
>0.05
>0.05
2.6 雷公藤对SLE的PBMC对γ-IL2反应的影响
活化的B细胞表面可表达IL2受体，观察SLE患者与正常人的PBMC对γ-IL2的反应，发现SLE的PBMC对γ-IL2的反应性明显比正常人增高，正常人未加γ-IL2时IgG分泌为317.6±100ng/ml,加γ-IL2后IgG的分泌为466.7±74ng/ml。而SLE患者的PBMC产生IgG量加γ-IL2后从原先的745.56±71.8ng/ml增高到1246.5±90ng/ml。雷公藤能明显抑制SLE的PBMC对γ-IL2反应后的IgG产生，见表5。
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2.7 雷公藤对SLE患者PBMC自发性产生IgG的影响
SLE患者的外周血单个核细胞自发性产生IgG的量明显高于正常对照，而雷公藤能明显抑制SLE患者的PBMC IgG的自发性产生，见表5。表5 雷公藤对SLE病人的自发性和IL2刺激后IgG产生量(ng/ml)的影响(n=7) 组 别
不加IL2
加入IL2
对照组
745.56±71.8
1246.5±90
雷公藤组
165.77±87
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368.9±182
P值
<0.01
<0.01
3 讨 论
雷公藤是一种免疫抑制剂已为人们所公认，基础药理研究已证明它具有免疫抑制剂活性。动物实验表明它对小鼠以溶血素为指标的初次和再次免疫反应均有抑制作用，能抑制T细胞的增殖反应、Th细胞的IL2产生以及IL2-R的表达[2]。本文系统地检测了它对于SLE患者PBMC的T、B细胞功能的影响，结果发现SLE患者的PBMC本身存在有自发性淋转的增高，此自发性淋转增高推测是一种活化的B细胞亚群自发性增殖的结果[6]。雷公藤能显著的抑制此种自发性增殖，故而说明雷公藤具有抑制活化B细胞增殖的功能。SAC是一选择性作用于静止期B细胞的有丝分裂原[5]，检测雷公藤对SAC诱导后PBMC增殖反应的影响，发现它对于SLE患者以及正常人的PBMC对SAC诱导的增殖反应均有明显的抑制作用，两者抑制率无显著性差异。此说明雷公藤不仅抑制已活化B细胞的增殖反应也能抑制静止期B细胞的活化增殖反应。而PHA是T细胞的有丝分裂原，检测SLE患者PBMC对PHA诱导后T细胞增殖反应的情况结果显示活动期的SLE患者其PBMC对PHA诱导所产生的增殖反应明显低于稳定期SLE患者和正常人组，而稳定期SLE患者与正常人无显著差异，加入雷公藤以后发现雷公藤对正常人及SLE患者的增殖功能均有明显的抑制作用，抑制率分别为90.46%和90.35%，两者无显著性差异。说明雷公藤也具有明显的抑制T细胞增殖反应。
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雷公藤还能抑制SLE患者的PBMC对于γ-IL2的高反应性，加入雷公藤后，IgG的分泌量明显下降，我们知道IL2是Th细胞产生的一种淋巴因子，主要功能是维持T细胞的增殖、分化。最近有文献报道它也是一种B细胞因子，能促进B细胞的增殖，SLE的活化B细胞增高，B细胞表面表达IL2增高，故而反应性增高[7]，说明雷公藤可能通过抑制IL2刺激B细胞的增殖进而使IgG分泌降低。
雷公藤对自发性IgG分泌有明显的抑制作用，目前已知SLE的自发性IgG分泌增高可能是由于B细胞自身活化增殖所致[6]。而雷公藤也可能通过抑制了B细胞自发活化增殖而间接地导致IgG分泌的下降。
PWM是T细胞依赖的B细胞激活剂，我们还观察了雷公藤对PWM诱导的正常人PBMC产生IgG的作用，发现雷公藤能明显抑制PWM诱导IgG产生，为了进一步证实它抑制的作用环节，我们分别在不同时间内加入雷公藤及其单体，发现在0，24，48和72h加入均能表现出抑制效应，根据细胞体外活化分裂周期，静止期的细胞在体外经有丝分裂原的活化后，从G0期进入G1期，进一步进入S期经历了72h，而后再分化成分泌细胞进而成为浆细胞分泌IgG，故而我们可以推测雷公藤对于IgG的抑制作用环节在于细胞的活化和增殖阶段，而不是分泌分化阶段。
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综上所述雷公藤对于SLE的治疗机理在于它能对SLE亢进的多个免疫环节起作用，不仅抑制T细胞功能，还能直接抑制亢进的B细胞功能，抑制B细胞的增殖活化，抑制活化B细胞对于γ-IL2的反应，对于IgG产生的抑制环节主要在于抑制了T、B细胞的增殖活化阶段。
参考文献
[1] 秦万章，向熙瑞.雷公藤治疗红斑狼疮等结缔组织病的研究体会.江苏医药，1987，13(12)∶655.
[2] 南京军区医院临床实验科.雷公藤T与黄精Po对淋巴细胞的作用.江苏医药，1979，(10)∶5.
[3] 匡彦德.雷公藤对IL2的产生和IL2受体表达的抑制作用.上海免疫学杂志，1988，8(4)∶250.
[4] Tan EM,Cohem AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of SLE.Arthritis Reum,1982,25∶1271.
, 百拇医药
[5] Kehrl JH,Muraguchi A,Butler JL,et al.Human B cell activition,proliferation and differentiation.Immunological Rev,1984,78∶75.
[6] Yan K,Morimasa K,Asano T,et al.Characteriation of the spontaneous DNA synthesizing and/or IgG secreting cells in peripheral blood from patients with SLE.Clin Immunol J,1985,35(1)∶57.
[7] Lehmann KR,Kotzin Bl,Portanova JP,et al.Interleukin is a proliferative signal for B cells from autoimmune mice.Eur J Immunol,1986,16(9)∶1105.
收稿日期：1998-03-10, 百拇医药