化学发光法测定大鼠脑组织中一氧化氮合成酶的活性
作者：舒柏华 徐顺清 周宜开 朱遂强
单位：舒柏华 徐顺清 周宜开 同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030；朱遂强 同济医科大学附属同济医院神经内科，武汉 430030
关键词：一氧化氮； 一氧化氮合成酶； 化学发光
同济医科大学学报990205 摘要 利用化学发光分析技术建立一种新的一氧化氮合成酶(NOS)活性测定方法。L-精氨酸在多种辅助因子的参与下，经NOS的催化生成一氧化氮(NO)。NO与过氧化氢反应生成过氧亚硝酸，后者能与鲁米诺产生强的发光反应，当NO浓度为0.1 pmol/L～1 nmol/L时，发光强度与NO浓度成正比；通过测量发光强度来确定NOS的活性。用该方法重复测量10只大鼠脑组织中的NOS活性，其测定值为：(28.3±6.9) pmol NO/L/mg蛋白/min；稳定性较好。此方法避免了同位素方法的繁琐及放射性污染，是一种简便易行的NOS活性测定方法。
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中图法分类号 Q55
Determination of Activities of Nitric Oxide Synthase in Rat
Brain by Chemiluminescent Assay
Shu Baihua, Xu Shunqing, Zhou Yikai et al
Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract A new method for determining activities of nitric oxide synthase (NOS) was set by using chemiluminescent assay. In the present of some cofactors, NOS can catalyze L-Argine to form nitric oxide (NO). NO can react with H2O2 to form peroxynitrite, which can produce a strong chemiluminescent reaction with luminol. When NO concentration is between 0.1 pmol/L to 1 nmol/L, the chemiluminescent intensity is direct ratio with NO concentration. The activities of NOS in rat brain were determinated by the chemiluminescent intensity. In the brain tissues of 10 rats, the mean NOS activity was (28.3±6.9) pmol/NO.L-1.mgprotein-1.min-1. The stability of the method is good. The method is not complicated as radioassay and doesn't have radioactivity pollution.
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Key words nitric oxide; nitric oxide synthase; chemiluminescence
一氧化氮(nitric oxide, NO)在免疫、心血管、内分泌、神经等系统中都具有重要的生物学作用[1～3]。体内NO均由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)催化合成。测定神经系统中的NOS活性对NO生理功能和神经毒理学的研究具有重要意义。目前多利用同位素氚标记的精氨酸为底物测定NOS活性[4]，此方法不仅具有放射性污染，而且操作十分繁琐。本文利用化学发光法建立一种新的、简便易行的NOS活性测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
L-精氨酸(L1-Arg)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、钙调蛋白(CaM)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)、亮肽素(LP)、苯*****(PMSF)、抗凝乳蛋白酶素(CM)、大豆胰蛋白抑制剂(STI)、去铁乙胺(DFA)等购自Sigma公司；二硫苏糖醇为Fluka公司产品；超氧歧化酶(SOD，中科院上海生化所产品)、鲁米诺(Luminol, Serva产品)；NO气体由北京氦普气体有限公司提供。
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1.2 方法
1.2.1组织匀浆液的配制：50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)内含0.32 mol/L蔗糖溶液，1 mmol/L的EDTA，1 mmol/L的二硫苏糖醇，10 mg/L的亮肽素，10 mg/L的CM，10 mg/L的STI，100 mg/L的PMSF。用双蒸水配制，4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 酶反应液的配制[5]：50 mmol/L HEPES缓冲液(pH7.4)含有1 mmol/L NADpH，1 mmol/L二硫苏糖醇，1.25 mmol/L CaCl2，10 mg/L CaM, 1 mmol/L EDTA和一定量的FAD、FMN。用双氧水配制，溶液呈黄色，4 ℃保存备用。
1.2.3 发光试剂的配制：用2 mmol/L碳酸缓冲液配制鲁米诺溶液，内含0.018 mmol/L的鲁米诺、0.15 mmol/L的去铁乙胺、10 mmol/L H2O2(临用前加入)。
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1.2.4 脑组织匀浆的制备：取一定量的脑组织，加入9倍的匀浆液，用匀浆器在冰浴中进行匀浆。匀浆液在低温高速离心机中以15 000 r/min离心30 min，取上清测NOS活性。用Lorry氏法测其蛋白含量。
1.2.5 NOS活性的测定：取上清液100 μl、酶反应液300 μl加入发光管中，再加入100 μl的L-Arg反应底物，混匀置37 ℃水浴15 min后，将发光管放入LKB1251(Finland)发光仪测量室内，然后注入500 μl发光试剂，记录6 s发光积分值。
1.2.6 NO发光标准曲线的测量：将7 ml双蒸水超声处理10 min，然后通氮气1 h，以驱除水中的氧。为制备NO标准液，将NO气体通入含100 mg/L KOH的无氧双蒸水30 s，制得浓度约为0.1 pmol/L～1 mmol/L的NO标准溶液，然后用HbO2氧化法测定标准液的发光值[6]。先在发光管内加入500 μl发光液，然后从加样孔注入NO标准溶液500 μl，记录6 s发光积分值。
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1.2.7 NOS活性的换算：根据样品所测得的发光值，从NO发光标准曲线查出相应的NO的浓度，根据样品量、蛋白质含量及酶促反应时间计算出NOS活性(pmol NO/L/mg蛋白/min)。
2 结 果
2.1 最佳发光试剂的组成
为选择适合的发光剂，本文分别用鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、MCLA为发光试剂来检测NO。同时对不同的缓冲液系统和试剂浓度进行了比较。实验结果表明：最佳发光剂的组成为：0.018 mmol/L鲁米诺、0.15mmol/L去铁乙胺、10mmol/L的H2O2、2 mmol/L的K2CO3。以该发光溶液测定NO，信噪比较高、标准曲线线性较好。
2.2 NO发光标准曲线
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以标准液发光强度为纵座标，以NO浓度为横座标绘制标准曲线。当NO浓度为0.1 pmol/L～1 nmol/L时，标准曲线呈线性关系。
2.3 方法的稳定性
用本方法重复2次测量10只正常雄性SD大鼠相同部位脑组织中的NOS活性，2次测量结果分别为(27.7±5.3)和(28.9±6.5) pmol NO/L/mg蛋白/min。两组结果之间的差异无显著性意义(P<0.05)，两者之间的平均误差为4.2 %。
3 讨 论
NO是近年来发现的一种“气体性”信使分子，在生物体内具有重要的生物学作用，它是由NOS催化合成的。哺乳动物神经系统组织中主要含有结构型NOS，存在于神经元的胞浆中，是一种胞浆酶。该酶分子上存在有CaM、NADPH、FAD、FMN等辅助因子的结合位点。在Ca2+和这些辅助因子的共同作用下，NOS可被激活，后者可使L-Arg分子中的胍基氮氧化脱落，生成NO和等量的瓜氨酸。因此，可将神经组织制成匀浆，高速低温离心后取上清，作为NOS制备物。再以L-Arg为底物，在多种辅助因子参与下，经NOS催化生成NO[7]。NO能与过氧化氢反应生成过氧亚硝酸，过氧亚硝酸是一种比过氧化氢强得多的发光物质，它能与鲁米诺发生很强的化学发光反应[8]，发光信号强度与NO浓度成正比；如果NO浓度很高(>1 μmol/L)，则首先出现一个短暂的发光抑制，然后出现一个很强的发光高峰，当NO浓度稀释至100 nmol/L时，开始时的短暂抑制现象消失；若以过氧亚硝酸为发光物，亦无开始时的短暂发光抑制现象，这说明短暂抑制是由于高浓度NO所致。组织中的氧自由基亦能与鲁米诺发生化学发光反应而干扰NO的测定，为排除氧自由基的干扰，在反应体系中加入了SOD(30 U/ml)。加入SOD后发光强度有轻微的下降，但与不加SOD时无显著性差异(P>0.05)，且本底值下降。
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在选择最佳发光试剂的实验中发现：异鲁米诺与NO反应时发光信号很微弱，虽然异鲁米诺对过氧化脂质的检测十分有用，但用它来检测生物样本中的NO，其信噪比很低。光泽精与NO反应不能被H2O2所放大，信号十分微弱。MCLA在NO溶液中很快被NO所破坏而不能发光。只有鲁米诺与NO反应能产生较强的发光。文章分别用了碳酸、硼酸、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、HEPES-NaOH等5种不同pH和浓度的缓冲液实验，其中2mmol/L的碳酸缓冲液的信噪比最高。文章还利用了去铁乙胺排除血红蛋白的干扰，但高浓度的去铁乙胺可与H2O2发生反应而产生较弱的发光，同时可抑制鲁米诺与过氧亚硝酸的反应，本文的实验结果表明：0.15mmol/L的去铁乙胺既不影响NO与鲁米诺-H2O2 的发光，又可排除血红蛋白对NO的影响。
作者简介：舒柏华，男，1957年生，副教授
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参考文献
1 Marletta M A, Yoon P S, Iyengar R et al. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 1988, 27: 8 706
2 Komori K, Lorenz R R, Vanhoutte P M. Nitric oxide, Ach and electrical and mechanical properties of canine arterial smooth muscle. Am J Physiol, 1988, 255:H207
3 Garthwaite J Charles S L, Williams R C. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain. Nature, 1988, 336: 385
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4 Knowles R G, Palacios M, Palmer R M J et al. Kinetic characteristics of nitric oxide synthase from rat brain. Biochem J 1990, 269:207
5 Rengasamy A, Johns R A. Characterization of endothelium relaxing factor /nitric oxide synthase from bovine cerebellum and mechanism of modulation by low and high oxygentension. J Pharmacol Exp Ther, 1991, 259: 310
6 Kelm M, Schurader J. Detection of nitric oxide released from cultured endothelial cells. J Cir Res, 1990, 66:1 561
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7 Knowles R G, Palacios M, Palmer R M J et al. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system. Pro Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 5 159
8 Kikuchi K, Nagano T, Hayakawa H et al. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol system. Anal Chem, 1993, 65: 1 794
收稿日期：1997-04-18, 百拇医药
单位：舒柏华 徐顺清 周宜开 同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030；朱遂强 同济医科大学附属同济医院神经内科，武汉 430030
关键词：一氧化氮； 一氧化氮合成酶； 化学发光
同济医科大学学报990205 摘要 利用化学发光分析技术建立一种新的一氧化氮合成酶(NOS)活性测定方法。L-精氨酸在多种辅助因子的参与下，经NOS的催化生成一氧化氮(NO)。NO与过氧化氢反应生成过氧亚硝酸，后者能与鲁米诺产生强的发光反应，当NO浓度为0.1 pmol/L～1 nmol/L时，发光强度与NO浓度成正比；通过测量发光强度来确定NOS的活性。用该方法重复测量10只大鼠脑组织中的NOS活性，其测定值为：(28.3±6.9) pmol NO/L/mg蛋白/min；稳定性较好。此方法避免了同位素方法的繁琐及放射性污染，是一种简便易行的NOS活性测定方法。
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中图法分类号 Q55
Determination of Activities of Nitric Oxide Synthase in Rat
Brain by Chemiluminescent Assay
Shu Baihua, Xu Shunqing, Zhou Yikai et al
Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract A new method for determining activities of nitric oxide synthase (NOS) was set by using chemiluminescent assay. In the present of some cofactors, NOS can catalyze L-Argine to form nitric oxide (NO). NO can react with H2O2 to form peroxynitrite, which can produce a strong chemiluminescent reaction with luminol. When NO concentration is between 0.1 pmol/L to 1 nmol/L, the chemiluminescent intensity is direct ratio with NO concentration. The activities of NOS in rat brain were determinated by the chemiluminescent intensity. In the brain tissues of 10 rats, the mean NOS activity was (28.3±6.9) pmol/NO.L-1.mgprotein-1.min-1. The stability of the method is good. The method is not complicated as radioassay and doesn't have radioactivity pollution.
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Key words nitric oxide; nitric oxide synthase; chemiluminescence
一氧化氮(nitric oxide, NO)在免疫、心血管、内分泌、神经等系统中都具有重要的生物学作用[1～3]。体内NO均由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)催化合成。测定神经系统中的NOS活性对NO生理功能和神经毒理学的研究具有重要意义。目前多利用同位素氚标记的精氨酸为底物测定NOS活性[4]，此方法不仅具有放射性污染，而且操作十分繁琐。本文利用化学发光法建立一种新的、简便易行的NOS活性测定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
L-精氨酸(L1-Arg)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、钙调蛋白(CaM)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)、亮肽素(LP)、苯*****(PMSF)、抗凝乳蛋白酶素(CM)、大豆胰蛋白抑制剂(STI)、去铁乙胺(DFA)等购自Sigma公司；二硫苏糖醇为Fluka公司产品；超氧歧化酶(SOD，中科院上海生化所产品)、鲁米诺(Luminol, Serva产品)；NO气体由北京氦普气体有限公司提供。
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1.2 方法
1.2.1组织匀浆液的配制：50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)内含0.32 mol/L蔗糖溶液，1 mmol/L的EDTA，1 mmol/L的二硫苏糖醇，10 mg/L的亮肽素，10 mg/L的CM，10 mg/L的STI，100 mg/L的PMSF。用双蒸水配制，4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 酶反应液的配制[5]：50 mmol/L HEPES缓冲液(pH7.4)含有1 mmol/L NADpH，1 mmol/L二硫苏糖醇，1.25 mmol/L CaCl2，10 mg/L CaM, 1 mmol/L EDTA和一定量的FAD、FMN。用双氧水配制，溶液呈黄色，4 ℃保存备用。
1.2.3 发光试剂的配制：用2 mmol/L碳酸缓冲液配制鲁米诺溶液，内含0.018 mmol/L的鲁米诺、0.15 mmol/L的去铁乙胺、10 mmol/L H2O2(临用前加入)。
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1.2.4 脑组织匀浆的制备：取一定量的脑组织，加入9倍的匀浆液，用匀浆器在冰浴中进行匀浆。匀浆液在低温高速离心机中以15 000 r/min离心30 min，取上清测NOS活性。用Lorry氏法测其蛋白含量。
1.2.5 NOS活性的测定：取上清液100 μl、酶反应液300 μl加入发光管中，再加入100 μl的L-Arg反应底物，混匀置37 ℃水浴15 min后，将发光管放入LKB1251(Finland)发光仪测量室内，然后注入500 μl发光试剂，记录6 s发光积分值。
1.2.6 NO发光标准曲线的测量：将7 ml双蒸水超声处理10 min，然后通氮气1 h，以驱除水中的氧。为制备NO标准液，将NO气体通入含100 mg/L KOH的无氧双蒸水30 s，制得浓度约为0.1 pmol/L～1 mmol/L的NO标准溶液，然后用HbO2氧化法测定标准液的发光值[6]。先在发光管内加入500 μl发光液，然后从加样孔注入NO标准溶液500 μl，记录6 s发光积分值。
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1.2.7 NOS活性的换算：根据样品所测得的发光值，从NO发光标准曲线查出相应的NO的浓度，根据样品量、蛋白质含量及酶促反应时间计算出NOS活性(pmol NO/L/mg蛋白/min)。
2 结 果
2.1 最佳发光试剂的组成
为选择适合的发光剂，本文分别用鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、MCLA为发光试剂来检测NO。同时对不同的缓冲液系统和试剂浓度进行了比较。实验结果表明：最佳发光剂的组成为：0.018 mmol/L鲁米诺、0.15mmol/L去铁乙胺、10mmol/L的H2O2、2 mmol/L的K2CO3。以该发光溶液测定NO，信噪比较高、标准曲线线性较好。
2.2 NO发光标准曲线
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以标准液发光强度为纵座标，以NO浓度为横座标绘制标准曲线。当NO浓度为0.1 pmol/L～1 nmol/L时，标准曲线呈线性关系。
2.3 方法的稳定性
用本方法重复2次测量10只正常雄性SD大鼠相同部位脑组织中的NOS活性，2次测量结果分别为(27.7±5.3)和(28.9±6.5) pmol NO/L/mg蛋白/min。两组结果之间的差异无显著性意义(P<0.05)，两者之间的平均误差为4.2 %。
3 讨 论
NO是近年来发现的一种“气体性”信使分子，在生物体内具有重要的生物学作用，它是由NOS催化合成的。哺乳动物神经系统组织中主要含有结构型NOS，存在于神经元的胞浆中，是一种胞浆酶。该酶分子上存在有CaM、NADPH、FAD、FMN等辅助因子的结合位点。在Ca2+和这些辅助因子的共同作用下，NOS可被激活，后者可使L-Arg分子中的胍基氮氧化脱落，生成NO和等量的瓜氨酸。因此，可将神经组织制成匀浆，高速低温离心后取上清，作为NOS制备物。再以L-Arg为底物，在多种辅助因子参与下，经NOS催化生成NO[7]。NO能与过氧化氢反应生成过氧亚硝酸，过氧亚硝酸是一种比过氧化氢强得多的发光物质，它能与鲁米诺发生很强的化学发光反应[8]，发光信号强度与NO浓度成正比；如果NO浓度很高(>1 μmol/L)，则首先出现一个短暂的发光抑制，然后出现一个很强的发光高峰，当NO浓度稀释至100 nmol/L时，开始时的短暂抑制现象消失；若以过氧亚硝酸为发光物，亦无开始时的短暂发光抑制现象，这说明短暂抑制是由于高浓度NO所致。组织中的氧自由基亦能与鲁米诺发生化学发光反应而干扰NO的测定，为排除氧自由基的干扰，在反应体系中加入了SOD(30 U/ml)。加入SOD后发光强度有轻微的下降，但与不加SOD时无显著性差异(P>0.05)，且本底值下降。
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在选择最佳发光试剂的实验中发现：异鲁米诺与NO反应时发光信号很微弱，虽然异鲁米诺对过氧化脂质的检测十分有用，但用它来检测生物样本中的NO，其信噪比很低。光泽精与NO反应不能被H2O2所放大，信号十分微弱。MCLA在NO溶液中很快被NO所破坏而不能发光。只有鲁米诺与NO反应能产生较强的发光。文章分别用了碳酸、硼酸、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、HEPES-NaOH等5种不同pH和浓度的缓冲液实验，其中2mmol/L的碳酸缓冲液的信噪比最高。文章还利用了去铁乙胺排除血红蛋白的干扰，但高浓度的去铁乙胺可与H2O2发生反应而产生较弱的发光，同时可抑制鲁米诺与过氧亚硝酸的反应，本文的实验结果表明：0.15mmol/L的去铁乙胺既不影响NO与鲁米诺-H2O2 的发光，又可排除血红蛋白对NO的影响。
作者简介：舒柏华，男，1957年生，副教授
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参考文献
1 Marletta M A, Yoon P S, Iyengar R et al. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 1988, 27: 8 706
2 Komori K, Lorenz R R, Vanhoutte P M. Nitric oxide, Ach and electrical and mechanical properties of canine arterial smooth muscle. Am J Physiol, 1988, 255:H207
3 Garthwaite J Charles S L, Williams R C. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain. Nature, 1988, 336: 385
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4 Knowles R G, Palacios M, Palmer R M J et al. Kinetic characteristics of nitric oxide synthase from rat brain. Biochem J 1990, 269:207
5 Rengasamy A, Johns R A. Characterization of endothelium relaxing factor /nitric oxide synthase from bovine cerebellum and mechanism of modulation by low and high oxygentension. J Pharmacol Exp Ther, 1991, 259: 310
6 Kelm M, Schurader J. Detection of nitric oxide released from cultured endothelial cells. J Cir Res, 1990, 66:1 561
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7 Knowles R G, Palacios M, Palmer R M J et al. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system. Pro Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 5 159
8 Kikuchi K, Nagano T, Hayakawa H et al. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol system. Anal Chem, 1993, 65: 1 794
收稿日期：1997-04-18, 百拇医药