人类胎盘碱性磷酸酶部分性质的研究
作者：耿芳宋 王秀丽 张金玉
单位：青岛医学院生物化学教研室(青岛266021)
关键词：碱性磷酸酶；胎盘；人；酶稳定性
青岛医学院学报990205 【摘要】 ①目的 探讨纯化的人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的部分性质，为其结构与功能的研究积累资料。②方法 应用分光光度法观察了温度、酸碱度及抑制剂对酶活力的影响；同时对其紫外吸收光谱进行了测定。③结果在该实验条件下，酶的最适温度为65℃，对热稳定，-25℃冷冻后酶的活力明显下降；最适pH为11.0，在pH7.0～11.5之间稳定；以对硝基酚磷酸二钠为底物，其Km值为0.25mmol/L；L-苯丙氨酸是PLAP的反竞争性抑制剂，其抑制常数为2.35mmol/L,而NaH2PO4是PLAP的竞争性抑制剂，其抑制常数为0.99mmol/L；酶蛋白的最大紫外吸收波长为280nm.④结论 了解纯化PLAP的上述性质，有助于其结构与功能的研究。
, 百拇医药
中国图书馆分类法分类号 Q55
SOME OF THE PROPERTIES OF HUMAN
PLACENTAL ALKALINE PHOSPHATASE
Geng Fangsong, Wang Xiuli, Zhang Jinyu
Department of Biochemistry, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study some of the properties of p urified human placental alkaline phosphatase (PLAP).Methods The effects of temperature, pH and inhibitors on PLAP a ctivity were studied by spectrophotometry and the ultraviolet absorption spectra of PLAP were simultaneously measured. Results The optimum temperature of PLAP was 65℃. PLAP was stable to heat and its activity markedly decreased when PLAP was frozen in -25℃. The optimum pH of PLAP was 11.0 and PLAP was stable in 7.02PO4 with the double reciprocal plot. L-phenylalanine was an uncompetitive inhibitor whereas NaH2PO4 was a competitive inhibitor for PLAP . The purified PLAP exhibits a unique ultraviolet absorption spectrum with a max imum at 280nm. Conclusion Understanding the above properties of PLAP may help t o study its structure and functions
, 百拇医药
【KEY WORDS】 alkaline phosphatase; placenta; men; enzyme stability
人类胎盘碱性磷酸酶(E.C.3.1.3.1,PLAP)是通过寡糖磷脂酰肌醇嵌在胎盘细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物〔1,2〕。由于PLAP是某些肿瘤的标志酶之一，故已对其进行了广泛的研究，但其作用机制和生物学功能尚未完全阐明〔3,4〕。为了深入地研究PLAP构象与活力的关系，我们对纯化的PLAP的某些性质进行了探讨。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂
DEAE-纤维素为上海试剂二厂产品；DEAE-SephadexA-50为Pharmacia公司产品；Tris为Sigma公司产品；对硝基酚磷酸二钠(PNPP)和L-苯丙氨酸均为Merck公司产品；其他试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
, 百拇医药
1.2 PLAP的分离纯化和纯度鉴定
按文献〔5〕的方法进行。纯化的PLAP经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为一条带，反相高效液相色谱(HPLC)分析为单一对称峰。纯化酶的比活力为138.12mmol.s-1/g.
1.3 酶活力的测定
按文献〔6〕的方法进行。取底物液(含5mmol/LPNPP,100mmol/LpH9.9的Tris-HCl缓冲液,2mmol/LMgCl2)1mL，37℃预保温5min，加入稀释酶溶液10μL(酶的质量浓度为0.094g/L)，立即混匀，37℃准确保温5min，然后加入0.025mol/LNaOH3mL终止反应，在752C型分光光度计上测定410nm波长的吸光度。根据吸光度的变化值，计算酶的相对活力。
1.4 PLAP紫外吸收光谱的测定
, 百拇医药
纯化的PLAP用岛津UV-260型双光束分光光度计在200～320nm波长范围内扫描。酶质量浓度为0.258g/L,测定温度为25℃，用相同的pH9.9的Tris-HCl缓冲液进行校正。
2 结果
2.1 PLAP的最适温度与温度稳定性
2.1.1 最适温度 按酶活力测定的条件和方法，在指定的不同温度下，分别测定酶活力，以温度对酶活力做图1.由图1可见，在该测定条件下反应5min,PLAP的最适温度为65℃.
图1 PLAP的温度-活力曲线
2.1.2 温度稳定性 将酶在指定的不同温度下保温培育，每隔一定时间(10,20,40,60,120,180,240,300min),按酶活力测定的条件和方法，分别测定酶活力；以测得的未经保温培育处理的酶活力为标准，计算酶的相对活力，结果见表1.
, 百拇医药
表1 PLAP的相对活力(%) 培育温度
(t/℃)
培育时间(t/min)
10
20
40
60
120
180
240
300
-25
99.5
, 百拇医药
99.1
99.1
98.1
86.4
83.6
78.4
74.6
0
100.0
101.4
98.6
97.7
98.1
, 百拇医药
96.7
99.5
95.4
20
103.7
102.3
98.6
97.2
96.3
95.3
94.5
94.4
37
, 百拇医药
103.3
101.4
98.1
96.7
98.6
96.2
82.2
70.0
45
102.8
97.7
99.5
96.7
, 百拇医药
94.8
74.2
50.2
34.3
55
103.3
100.0
99.5
95.7
82.0
72.8
40.8
2.4
, http://www.100md.com
65
100.0
95.8
85.4
82.2
51.2
23.9
23.9
23.5
75
39.9
9.9
7.5
, 百拇医药
1.4
0.0
0.0
0.0
0.0
由表1可见，当PLAP在-25℃培育时，培育时间在60min内酶活力变化不大，超过60min时，随培育时间的延长，酶活力逐渐下降；当PLAP在0，20℃培育时，在指定的培育时间内经培育后，酶活力无明显改变；培育温度在37～65℃之间，酶活力发生显著变化并与其培育温度和时间有关，培育温度越高，酶活力发生显著变化所需培育时间就越短；65℃培育10min,酶活力无明显变化，而75℃培育10min,酶活力迅速下降，培育时间超过60min,酶活力丧失。此外，由表1还可以看出，在20～55℃之间短时间保温培育后，酶活力略有增加。提示PLAP对热稳定，冷冻后活力降低。
, 百拇医药
2.2 PLAP的最适pH与酸碱稳定性
2.2.1 最适pH 按酶活力测定的条件和方法，在指定的不同pH下，分别测定酶活力，以pH值对酶活力做图2.由图2可知，PLAP在此测定条件下，其表观最适pH值为11.0.
图2 PLAP的pH-活力曲线
2.2.2 酸碱稳定性 将酶置于指定的不同pH值的Tris缓冲溶液中，37℃保温，每隔一定时间(1,2h),按酶活力测定的条件和方法，分别测定酶活力，以测得的未经处理的酶活力为标准，计算酶的相对活力，结果见表2.
表2 PLAP的相对活力(%) 培育时间
(t/h)
pH
, 百拇医药
6.0
7.0
7.5
8.0
9.0
10.0
11.0
11.5
12.0
1
75.0
94.9
95.7
, http://www.100md.com
94.4
98.8
97.7
101.2
99.5
16.2
2
72.3
95.0
91.1
97.2
99.4
98.8
, 百拇医药
101.0
100.5
13.0
2.3 PLAP的Km值测定
改变底物浓度(底物终浓度分别为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8mmol/L)，按酶活力测定的条件和方法测定酶活力；用双倒数做图法做图3，由图3求得PLAP作用于PNPP的Km值为0.25mmol/L.
图3 PLAP的双倒数图
①无抑制剂存在；②L-苯丙氨酸终浓度为1mmol/L；③NaH2O3终浓度为1mmol/L
2.4 抑制剂对酶活力的影响
, 百拇医药
在酶促反应体系中，加入L-苯丙氨酸溶液或NaH2PO4,使其终浓度均为1mmol/L,分别测得PLAP的相对活力为64%和33%,提示L-苯丙氨酸和NaH2PO4均为PLAP的抑制剂。应用双倒数作图法判明L-苯丙氨酸为PLAP的反竞争性抑制剂，而NaH2PO4为其竞争性抑制剂；并求得其抑制常数(Ki)分别为2.35mmol/L和0.99mmol/L,见图3.
2.5 PLAP紫外吸收光谱的测定
PLAP在pH9.9的Tris-HCl缓冲液中的紫外吸收光谱见图4.由图4可见，该酶的最大紫外吸收峰在280nm处。
图4 PLAP的紫外吸收光谱
3 讨论
, http://www.100md.com
本文所报道的PLAP的热稳定性和最适温度，酸碱稳定性和最适pH，L-苯丙氨酸和NaH2PO4对PLAP的抑制作用，以PNPP为底物的Km值均与文献结果基本一致〔2,7,8〕。
系统了解酶的性质不仅有助于酶结构、功能及其作用机制的研究，而且对于同工酶的分析，酶的提纯和贮存也具有重要的指导意义。由于PLAP冷冻后活力降低，在pH值为7.0～11.5之间的Tris缓冲液中，0～20℃时稳定，故PLAP多于pH值为8.0的Tris缓冲液中4℃贮存，不能采用冷冻干燥后贮存，至于PLAP冷冻后酶活力降低的机制有待进一步阐明。PLAP对热稳定，这一特性也正是我们在PLAP提纯中采用热处理的理论依据；然而，在PLAP的纯化过程中也观察到，粗酶液在65℃下加热60min对酶活力无影响。而本文结果显示，纯化酶液在65℃,保温时间超过10min,酶活力下降，提示粗酶的热稳定性大于纯酶，热稳定性与所在的介质有关。基于该测定条件下，PLAP最适温度为65℃,最适pH为11.0,在酶活力测定时，若其活力过小，可适当提高培育温度或测活液的pH,以提高其测定的灵敏度，但培育温度最高不应超过65℃,而测活液的pH值不应超过11.0.利用PLAP的热稳定性，L-苯丙氨酸和磷酸盐的抑制作用可对人类碱性磷酸酶同工酶进行分析。L-苯丙氨酸对PLAP的抑制较弱，而对肝型碱性磷酸酶的抑制却很强；相反，磷酸盐对PLAP的抑制强，而对肝型碱性磷酸酶抑制弱〔8〕，可以此对二者进行鉴别。由于PLAP的最大紫外吸收峰在280nm处，故在应用紫外法对酶蛋白进行定量测定时，所选用的波长应为280nm.总之，熟习PLAP的上述性质，为其深入研究奠定了良好的基础。
, 百拇医药
本文为山东省卫生厅科研基金资助课题(批准号：J95K036)
参考文献
1 Millan JL. Molecular cloning and sequence analysis of human placental alkaline phosphatase. J Biol Chem,1986,261(7):3112
2 Harris H. The human alkaline phosphatase:what we know and what we don 't know. Clinica Chimica Acta,1989,186(2):133
3 Hoylaerts MC, Manes T, Millan JL. Molecular mechanism of uncompetitiv e inhibition of human placental and germ-cell alkaline phosphatase. Biochem J ,1992,286:23
, 百拇医药
4 Makiya R, Stigbrand T. Placental alkaline phosphatase as the placenta l IgG receptor. Clin Chem,1992,38(12):2543
5 耿芳宋,王秀丽,张金玉,等.人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化.青岛医学院学报,1998,34(2):84
6 Miggiano GAD, Mordente A, Pischiutta MG, et al. Early conformational changes and activity modulation induced by guanidinium chloride on intestinal al kaline phosphatase. Biochem J,1987,248:551
7 陈惠黎,李文杰主编.分子酶学.北京:人民卫生出版社,1983.378
8 Stinson RA, Seargeant LE. Comparative studies of pure alkaline phosph atases from five human tissues. Clinica Chimica Acta,1981,110:261
(1998-10-16收稿 1999-05-20修回), 百拇医药
单位：青岛医学院生物化学教研室(青岛266021)
关键词：碱性磷酸酶；胎盘；人；酶稳定性
青岛医学院学报990205 【摘要】 ①目的 探讨纯化的人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的部分性质，为其结构与功能的研究积累资料。②方法 应用分光光度法观察了温度、酸碱度及抑制剂对酶活力的影响；同时对其紫外吸收光谱进行了测定。③结果在该实验条件下，酶的最适温度为65℃，对热稳定，-25℃冷冻后酶的活力明显下降；最适pH为11.0，在pH7.0～11.5之间稳定；以对硝基酚磷酸二钠为底物，其Km值为0.25mmol/L；L-苯丙氨酸是PLAP的反竞争性抑制剂，其抑制常数为2.35mmol/L,而NaH2PO4是PLAP的竞争性抑制剂，其抑制常数为0.99mmol/L；酶蛋白的最大紫外吸收波长为280nm.④结论 了解纯化PLAP的上述性质，有助于其结构与功能的研究。
, 百拇医药
中国图书馆分类法分类号 Q55
SOME OF THE PROPERTIES OF HUMAN
PLACENTAL ALKALINE PHOSPHATASE
Geng Fangsong, Wang Xiuli, Zhang Jinyu
Department of Biochemistry, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study some of the properties of p urified human placental alkaline phosphatase (PLAP).Methods The effects of temperature, pH and inhibitors on PLAP a ctivity were studied by spectrophotometry and the ultraviolet absorption spectra of PLAP were simultaneously measured. Results The optimum temperature of PLAP was 65℃. PLAP was stable to heat and its activity markedly decreased when PLAP was frozen in -25℃. The optimum pH of PLAP was 11.0 and PLAP was stable in 7.0
, 百拇医药
【KEY WORDS】 alkaline phosphatase; placenta; men; enzyme stability
人类胎盘碱性磷酸酶(E.C.3.1.3.1,PLAP)是通过寡糖磷脂酰肌醇嵌在胎盘细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物〔1,2〕。由于PLAP是某些肿瘤的标志酶之一，故已对其进行了广泛的研究，但其作用机制和生物学功能尚未完全阐明〔3,4〕。为了深入地研究PLAP构象与活力的关系，我们对纯化的PLAP的某些性质进行了探讨。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂
DEAE-纤维素为上海试剂二厂产品；DEAE-SephadexA-50为Pharmacia公司产品；Tris为Sigma公司产品；对硝基酚磷酸二钠(PNPP)和L-苯丙氨酸均为Merck公司产品；其他试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
, 百拇医药
1.2 PLAP的分离纯化和纯度鉴定
按文献〔5〕的方法进行。纯化的PLAP经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为一条带，反相高效液相色谱(HPLC)分析为单一对称峰。纯化酶的比活力为138.12mmol.s-1/g.
1.3 酶活力的测定
按文献〔6〕的方法进行。取底物液(含5mmol/LPNPP,100mmol/LpH9.9的Tris-HCl缓冲液,2mmol/LMgCl2)1mL，37℃预保温5min，加入稀释酶溶液10μL(酶的质量浓度为0.094g/L)，立即混匀，37℃准确保温5min，然后加入0.025mol/LNaOH3mL终止反应，在752C型分光光度计上测定410nm波长的吸光度。根据吸光度的变化值，计算酶的相对活力。
1.4 PLAP紫外吸收光谱的测定
, 百拇医药
纯化的PLAP用岛津UV-260型双光束分光光度计在200～320nm波长范围内扫描。酶质量浓度为0.258g/L,测定温度为25℃，用相同的pH9.9的Tris-HCl缓冲液进行校正。
2 结果
2.1 PLAP的最适温度与温度稳定性
2.1.1 最适温度 按酶活力测定的条件和方法，在指定的不同温度下，分别测定酶活力，以温度对酶活力做图1.由图1可见，在该测定条件下反应5min,PLAP的最适温度为65℃.
图1 PLAP的温度-活力曲线
2.1.2 温度稳定性 将酶在指定的不同温度下保温培育，每隔一定时间(10,20,40,60,120,180,240,300min),按酶活力测定的条件和方法，分别测定酶活力；以测得的未经保温培育处理的酶活力为标准，计算酶的相对活力，结果见表1.
, 百拇医药
表1 PLAP的相对活力(%) 培育温度
(t/℃)
培育时间(t/min)
10
20
40
60
120
180
240
300
-25
99.5
, 百拇医药
99.1
99.1
98.1
86.4
83.6
78.4
74.6
0
100.0
101.4
98.6
97.7
98.1
, 百拇医药
96.7
99.5
95.4
20
103.7
102.3
98.6
97.2
96.3
95.3
94.5
94.4
37
, 百拇医药
103.3
101.4
98.1
96.7
98.6
96.2
82.2
70.0
45
102.8
97.7
99.5
96.7
, 百拇医药
94.8
74.2
50.2
34.3
55
103.3
100.0
99.5
95.7
82.0
72.8
40.8
2.4
, http://www.100md.com
65
100.0
95.8
85.4
82.2
51.2
23.9
23.9
23.5
75
39.9
9.9
7.5
, 百拇医药
1.4
0.0
0.0
0.0
0.0
由表1可见，当PLAP在-25℃培育时，培育时间在60min内酶活力变化不大，超过60min时，随培育时间的延长，酶活力逐渐下降；当PLAP在0，20℃培育时，在指定的培育时间内经培育后，酶活力无明显改变；培育温度在37～65℃之间，酶活力发生显著变化并与其培育温度和时间有关，培育温度越高，酶活力发生显著变化所需培育时间就越短；65℃培育10min,酶活力无明显变化，而75℃培育10min,酶活力迅速下降，培育时间超过60min,酶活力丧失。此外，由表1还可以看出，在20～55℃之间短时间保温培育后，酶活力略有增加。提示PLAP对热稳定，冷冻后活力降低。
, 百拇医药
2.2 PLAP的最适pH与酸碱稳定性
2.2.1 最适pH 按酶活力测定的条件和方法，在指定的不同pH下，分别测定酶活力，以pH值对酶活力做图2.由图2可知，PLAP在此测定条件下，其表观最适pH值为11.0.
图2 PLAP的pH-活力曲线
2.2.2 酸碱稳定性 将酶置于指定的不同pH值的Tris缓冲溶液中，37℃保温，每隔一定时间(1,2h),按酶活力测定的条件和方法，分别测定酶活力，以测得的未经处理的酶活力为标准，计算酶的相对活力，结果见表2.
表2 PLAP的相对活力(%) 培育时间
(t/h)
pH
, 百拇医药
6.0
7.0
7.5
8.0
9.0
10.0
11.0
11.5
12.0
1
75.0
94.9
95.7
, http://www.100md.com
94.4
98.8
97.7
101.2
99.5
16.2
2
72.3
95.0
91.1
97.2
99.4
98.8
, 百拇医药
101.0
100.5
13.0
2.3 PLAP的Km值测定
改变底物浓度(底物终浓度分别为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8mmol/L)，按酶活力测定的条件和方法测定酶活力；用双倒数做图法做图3，由图3求得PLAP作用于PNPP的Km值为0.25mmol/L.
图3 PLAP的双倒数图
①无抑制剂存在；②L-苯丙氨酸终浓度为1mmol/L；③NaH2O3终浓度为1mmol/L
2.4 抑制剂对酶活力的影响
, 百拇医药
在酶促反应体系中，加入L-苯丙氨酸溶液或NaH2PO4,使其终浓度均为1mmol/L,分别测得PLAP的相对活力为64%和33%,提示L-苯丙氨酸和NaH2PO4均为PLAP的抑制剂。应用双倒数作图法判明L-苯丙氨酸为PLAP的反竞争性抑制剂，而NaH2PO4为其竞争性抑制剂；并求得其抑制常数(Ki)分别为2.35mmol/L和0.99mmol/L,见图3.
2.5 PLAP紫外吸收光谱的测定
PLAP在pH9.9的Tris-HCl缓冲液中的紫外吸收光谱见图4.由图4可见，该酶的最大紫外吸收峰在280nm处。
图4 PLAP的紫外吸收光谱
3 讨论
, http://www.100md.com
本文所报道的PLAP的热稳定性和最适温度，酸碱稳定性和最适pH，L-苯丙氨酸和NaH2PO4对PLAP的抑制作用，以PNPP为底物的Km值均与文献结果基本一致〔2,7,8〕。
系统了解酶的性质不仅有助于酶结构、功能及其作用机制的研究，而且对于同工酶的分析，酶的提纯和贮存也具有重要的指导意义。由于PLAP冷冻后活力降低，在pH值为7.0～11.5之间的Tris缓冲液中，0～20℃时稳定，故PLAP多于pH值为8.0的Tris缓冲液中4℃贮存，不能采用冷冻干燥后贮存，至于PLAP冷冻后酶活力降低的机制有待进一步阐明。PLAP对热稳定，这一特性也正是我们在PLAP提纯中采用热处理的理论依据；然而，在PLAP的纯化过程中也观察到，粗酶液在65℃下加热60min对酶活力无影响。而本文结果显示，纯化酶液在65℃,保温时间超过10min,酶活力下降，提示粗酶的热稳定性大于纯酶，热稳定性与所在的介质有关。基于该测定条件下，PLAP最适温度为65℃,最适pH为11.0,在酶活力测定时，若其活力过小，可适当提高培育温度或测活液的pH,以提高其测定的灵敏度，但培育温度最高不应超过65℃,而测活液的pH值不应超过11.0.利用PLAP的热稳定性，L-苯丙氨酸和磷酸盐的抑制作用可对人类碱性磷酸酶同工酶进行分析。L-苯丙氨酸对PLAP的抑制较弱，而对肝型碱性磷酸酶的抑制却很强；相反，磷酸盐对PLAP的抑制强，而对肝型碱性磷酸酶抑制弱〔8〕，可以此对二者进行鉴别。由于PLAP的最大紫外吸收峰在280nm处，故在应用紫外法对酶蛋白进行定量测定时，所选用的波长应为280nm.总之，熟习PLAP的上述性质，为其深入研究奠定了良好的基础。
, 百拇医药
本文为山东省卫生厅科研基金资助课题(批准号：J95K036)
参考文献
1 Millan JL. Molecular cloning and sequence analysis of human placental alkaline phosphatase. J Biol Chem,1986,261(7):3112
2 Harris H. The human alkaline phosphatase:what we know and what we don 't know. Clinica Chimica Acta,1989,186(2):133
3 Hoylaerts MC, Manes T, Millan JL. Molecular mechanism of uncompetitiv e inhibition of human placental and germ-cell alkaline phosphatase. Biochem J ,1992,286:23
, 百拇医药
4 Makiya R, Stigbrand T. Placental alkaline phosphatase as the placenta l IgG receptor. Clin Chem,1992,38(12):2543
5 耿芳宋,王秀丽,张金玉,等.人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化.青岛医学院学报,1998,34(2):84
6 Miggiano GAD, Mordente A, Pischiutta MG, et al. Early conformational changes and activity modulation induced by guanidinium chloride on intestinal al kaline phosphatase. Biochem J,1987,248:551
7 陈惠黎,李文杰主编.分子酶学.北京:人民卫生出版社,1983.378
8 Stinson RA, Seargeant LE. Comparative studies of pure alkaline phosph atases from five human tissues. Clinica Chimica Acta,1981,110:261
(1998-10-16收稿 1999-05-20修回), 百拇医药