细胞增殖与凋亡在牙齿发育中的作用
作者：赵书芳 金岩 李松 赵皿 杨宪刚
单位：赵书芳 金岩 李松 赵皿 第四军医大学口腔医学院 710032；杨宪刚 吉林职工医科大学
关键词：增殖细胞核抗原；细胞凋亡；发育；原位末端标记法
华西口腔医学杂志990201 摘要 目的:阐明细胞增殖与凋亡在牙齿发生、发育过程中的机制，探讨牙齿发育的机理。方法:选用纯系SD大鼠建立牙齿发育模型，采用原位末端标记法(TUNEL法)及免疫组织化学增殖细胞核抗原(PCNA)染色技术，观察分析纯系SD大鼠牙胚发育不同阶段细胞增殖及凋亡情况。结果:在牙齿发育的蕾状期、帽状期、钟状期增殖及凋亡的阳性细胞均出现在细胞增殖生长中心处。钟状晚期及牙体组织形成后，已分化的外釉上皮细胞、成釉细胞、成牙本质细胞中也可见，但以牙乳头及星网层细胞中多见。结论:牙齿发育过程中的细胞增殖与凋亡同时出现在生长中心部位，说明二者在牙齿发育中相互协调，共同控制牙齿的形态形成。
, 百拇医药
Cell Proliferation and Programmed Cell Death in Tooth Development
Zhao Shufang, Jin Yan, Li Song, et al
College of Stomatology, the Fourth Military Medical University
Yang Xiangang
Jilin Employee Medical University
Abstract Objective: To evaluate the role of cell proliferation and programmed cell death (PCD) in the tooth development by detecting programmed cell death and expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Methods: Expression of PCNA and PCD were detected by immunohistochemical staining and Tdt-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) in different stages of the tooth development of Sprague-Dawly rats. Results: The positive cells of PCNA and PCD predominantly appeared at the prolife-rating growth center in the bud, the cap and the earlier bell stages of tooth development. PCNA and PCD were also observed in ameloblasts and odontoblasts, especially in the stellate reticulum cells of enamel organ and dental papilla during the period of dentin formation. Conclusion: Cell proliferation and programmed cell death are interrelated and interact on each other in the development of teeth, and they both involve in sculpturing the shape of teeth.
, 百拇医药
Key words: proliferating cell nuclear antigen programmed cell death development Tdt-mediated dUTP nick end labelling
人体从胚胎开始到发育成熟不只是细胞增殖的过程。近年的许多研究发现细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，简称PCD)在机体的胚胎发育、器官形成过程中发挥着重要的作用[1～3]。如果这对矛盾不能协调进行，将可能发生畸形甚至导致肿瘤的发生。关于这点在肿瘤方面已有许多研究，但在发育中尤其是牙齿发育所知甚少[2,3]。因此，本实验拟采用原位末端标记法(TUNEL法)及增殖细胞核抗原免疫组化技术较系统地观察和分析SD大鼠牙齿发育过程中的细胞增殖和凋亡的作用，以期揭示牙齿发育的机理。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物模型建立
选用纯系SD(Sprape Dawley, SD)大鼠20只，3月龄，体重220～250 g，上海实验动物中心提供。每日随机按4∶1雌雄比例同笼，次日早8∶00观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0天,标记后隔离饲养，记录生长情况。
1.2 标本制备
取妊娠SD雌鼠分别于胚胎13、15、17、19天及生后1、3、5、7天宰杀，剖腹取其胎鼠头部，固定在4%多聚甲醛溶液中，系列酒精脱水，石腊定向包埋，行冠状和矢状面5 μm切片。
1.3 免疫组织化学检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,简称PCNA)
免疫组织化学染色采用ABC法，石蜡切片脱蜡至水，经3% H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10分后，用正常羊血清封闭30分;加PCNA单抗(鼠抗大鼠，美国Santa Cruz公司产品)置于 4℃过夜，室温下复温1小时后滴加生物素化二抗37℃反应30分;再加ABC复合物37℃孵育30分,二氨基联苯氨(DAB)显色后，二甲苯透明,封片。
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1.4 原位末端标记法(TUNEL法)标记PCD细胞
TUNEL(Tdt-mediated dUTP nick end labelling)法(试剂盒购自美国 Oncor公司)：切片常规脱蜡至水，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15分；3%H2O2的PBS溶液中处理5分后，加5 μl的平衡液(TUNEL试剂盒原配)1分；再加含TDT酶反应液15 μl，37℃反应l.5小时后用预热的中止反应液中止反应(TUNEL试剂盒原配)；缓冲液1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30分;滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2小时;经缓冲液1、缓冲液3漂洗后，加新配制的显色液5-溴-4-氯-3-吲哚盐加硝基蓝四唑盐(NBT加BCIP)显色系统，用缓冲液3配制，NBT4.5 μl、BCIP 3.5 μl、0.24 mg/ml左旋咪唑20 μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
2 结 果
, 百拇医药
2.l PCNA免疫组化观察
胚胎13天蕾状期,PCNA阳性细胞集中在蕾状突起中央部分，周围的上皮细胞及间充质细胞增生活跃，也散在可见阳性细胞(图l)。胚胎15天帽状期，细胞增生活跃，成釉器及牙乳头和牙囊已形成。PCNA阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域(原发性釉结节)及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，牙乳头中的间充质细胞中散在(图2)。胚胎17天钟状早期及19天钟状期，PCNA阳性细胞主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处,间充质细胞中散在可见(图3)。出生后，牙本质牙釉质基质均已开始形成，成釉器逐渐退化，PCNA阳性细胞在星网层细胞多见，间充质细胞散在可见。随着牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加，成釉器不断退化，PCNA阳性细胞在成釉器的成釉细胞及成牙本质、间充质细胞中可见，其余部位逐渐少见。
图1 蕾状期PCD阳性细胞散在于上皮细胞形成的蕾状突起中央区及头部 NBT+BCIP ×200
, 百拇医药
图2 帽状期PCD阳性细胞集中出现在以内釉上皮中心为主的区域 NBT+BCIP ×132
图3 帽状期PCD阳性细胞出现在颈环和邻近颈环的周围间充质细胞中 NBT+BCIP ×132
2.2 TUNEL法观察
胚胎13天,口腔上皮细胞增生内陷呈蕾状突起，PCD阳性细胞集中在上皮细胞形成的蕾状头部，邻近间充质细胞增生活跃，偶见PCD阳性细胞(图4)。胚胎15天帽状期,细胞增生活跃，成釉器及牙乳头和牙囊已形成。PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域(原发性釉结节)及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，其中已分化的内釉上皮细胞约占30%，星网层细胞约40%，牙乳头中的间充质细胞约占30%，余者偶见(图5)。胚胎17天钟状早期,PCD阳性细胞明显增多，主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处，内釉上皮细胞中约40%，其邻接的星网层细胞约30%,间充质细胞约25%，其余部位散在(图6)。胚胎19天钟状期，成牙本质细胞已分化，开始分泌牙本质基质，在成牙本质细胞中PCD阳性细胞约有20%，在成釉器的星网层细胞约占30%，牙乳头中的间充质细胞约占20%，其它部位散在。生后1天牙本质、牙釉质基质均已开始形成，成釉器逐渐退化，PCD阳性细胞在星网层细胞多见约30%，间充质细胞约20%，其余偶见。生后3天牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加，成釉器不断退化，PCD阳性细胞在成釉器的星网层细胞约25%，间充质细胞约15%，其余部位少见。生后5天牙本质、牙釉质基质进一步钙化形成,成釉器进一步退化，PCD阳性细胞逐渐较少。生后7天随着基质钙化形成，牙胚各部分细胞成分明显减少，PCD阳性细胞也少见。
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图4 蕾状突起头部及周围间充质细胞中PCNA阳性细胞广泛分布 NBT+BCIP ×132
图5 帽状期PCNA阳性细胞集中分布于颈环周围 ×200
图6 牙体组织形成期PCNA阳性细胞集中出现在成牙本质细胞层 ×200
3 讨 论
发生于发育过程中的细胞凋亡是一些生物性因子或激素通过细胞膜或细胞内受体介导的细胞自然死亡现象。多用于揭示在胚胎发育、个体成熟等复杂的生理及病理过程中，在特定的时间、空间所发生的一种主动接受基因调控的程序性细胞死亡。目前已知细胞凋亡在组织、器官发育形成过程中具有组织塑形，消除不必要结构，控制细胞数量，清除多余、衰老、异常的细胞的作用。因此，本研究采用细胞凋亡特异性原位末端标记法，可以特异显示细胞凋亡在牙齿发育过程中的变化规律[4,5]。
, http://www.100md.com
PCNA是一种DNA多聚酶δ的辅助因子，是细胞增殖分裂所必须的成分之一，是一种只出现在细胞增殖状态细胞核内的酸性蛋白质。它在细胞增生分裂的S期达到高峰，因此，PCNA阳性着色细胞主要反映处于S期增殖状态的细胞。本实验通过免疫组化染色观察不同时期牙齿发育过程中PCNA的情况，揭示PCNA与细胞凋亡在牙齿发育中的关系。
结果表明:在牙胚发育的蕾状期，蕾状突起头部的星形细胞及周围上皮细胞、间充质细胞中PCNA阳性细胞广泛分布，这时PCD活跃在生长中心蕾状突起的头部，说明从牙蕾开始形成到蕾状期发育完成，上皮细胞增殖极其活跃，此时的PCD调控着细胞增殖数量，可能是上皮性成釉器不断向下生长的需要，也可能是牙蕾形态形成所必需的一种主动塑形现象。帽状期PCNA阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域(原发性釉结节)及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，此时，PCD也出现在帽状成釉器中以内釉上皮为中心的生长中心(原发性釉结节、颈环)处，提示原发性釉结节及颈环是牙齿发育的中心。这些部位通过上皮间充质相互诱导作用，细胞不断分裂、增殖的同时PCD在调控着细胞的增殖和分化，调控着牙尖、牙颈、牙根部的形成。使牙胚得以不断发育及塑形。这可能是牙胚不断向外生长扩大及不断塑形的需要。牙齿发育进入钟状期，PCNA及PCD阳性细胞集中在成釉器未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处，说明继发性釉结节是钟状期的牙齿生长中心。已有研究表明继发性釉结节是控制牙尖形成的信号中心，此期同样通过PCNA的表达及PCD出现发挥着调控牙齿发育及塑形。进入牙体组织形成期随着成釉细胞、成牙本质细胞的分化成熟，牙本质、牙釉质基质的分泌形成，成釉细胞、成牙本质细胞及星网层、牙乳头细胞均有PCNA的表达及PCD阳性细胞，说明成釉细胞、成牙本质细胞增殖旺盛分泌基质的同时，通过PCD清除已经结束生命周期的、衰老的、多余的上皮及间充质细胞，控制着细胞数量，消除继发性釉结节、星网层等暂时性结构。可见，在牙齿发育过程中，PCNA和PCD相互协调作用，及时调控着细胞的增殖和分化，及时清除异常、衰老的细胞，在牙齿形态形成过程中，发挥重要的塑形作用。
, 百拇医药
由此得知：牙齿胚胎发育过程中PCNA和PCD有着密切的关系，它们都集中出现在生长中心的细胞中，由于生长中心的细胞多处于增殖期，在细胞增殖旺盛的同时，通过细胞凋亡可清除过多增殖的细胞，控制着细胞的数量；也及时消除异常、衰老的细胞及暂时性结构，即在细胞增殖高峰之后是细胞凋亡高峰，二者在牙齿形态形成过程中，相互协调、互相制约共同发挥着重要的塑形作用。
参考文献
1 Michael D， Weil JM, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997，88:347～354
2 Sanders EJ, Wride MA. Programmed cell death in development. Int Rev Cytol, l995，163：105～173
, http://www.100md.com
3 木崎治俊.ァボト-シスと疾患.医学のあゅみ,1996,178(10):712～716
4 Taniguchi K, Sato N, Uchiyama Y. Apoptosis and he-terophagy of medial edge epithelial cells of the secondary palatine shelves during fusion. Arch Histol Cytol, 1995, 58(2):191～203
5 松田秀司,三岛宏一,尾原清司,等.颚关节の发生におけるァポト-シスの意义.第十回日本颚关节学会总会,1997:65,252
(1998-07-30收稿), 百拇医药
单位：赵书芳 金岩 李松 赵皿 第四军医大学口腔医学院 710032；杨宪刚 吉林职工医科大学
关键词：增殖细胞核抗原；细胞凋亡；发育；原位末端标记法
华西口腔医学杂志990201 摘要 目的:阐明细胞增殖与凋亡在牙齿发生、发育过程中的机制，探讨牙齿发育的机理。方法:选用纯系SD大鼠建立牙齿发育模型，采用原位末端标记法(TUNEL法)及免疫组织化学增殖细胞核抗原(PCNA)染色技术，观察分析纯系SD大鼠牙胚发育不同阶段细胞增殖及凋亡情况。结果:在牙齿发育的蕾状期、帽状期、钟状期增殖及凋亡的阳性细胞均出现在细胞增殖生长中心处。钟状晚期及牙体组织形成后，已分化的外釉上皮细胞、成釉细胞、成牙本质细胞中也可见，但以牙乳头及星网层细胞中多见。结论:牙齿发育过程中的细胞增殖与凋亡同时出现在生长中心部位，说明二者在牙齿发育中相互协调，共同控制牙齿的形态形成。
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Cell Proliferation and Programmed Cell Death in Tooth Development
Zhao Shufang, Jin Yan, Li Song, et al
College of Stomatology, the Fourth Military Medical University
Yang Xiangang
Jilin Employee Medical University
Abstract Objective: To evaluate the role of cell proliferation and programmed cell death (PCD) in the tooth development by detecting programmed cell death and expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Methods: Expression of PCNA and PCD were detected by immunohistochemical staining and Tdt-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) in different stages of the tooth development of Sprague-Dawly rats. Results: The positive cells of PCNA and PCD predominantly appeared at the prolife-rating growth center in the bud, the cap and the earlier bell stages of tooth development. PCNA and PCD were also observed in ameloblasts and odontoblasts, especially in the stellate reticulum cells of enamel organ and dental papilla during the period of dentin formation. Conclusion: Cell proliferation and programmed cell death are interrelated and interact on each other in the development of teeth, and they both involve in sculpturing the shape of teeth.
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Key words: proliferating cell nuclear antigen programmed cell death development Tdt-mediated dUTP nick end labelling
人体从胚胎开始到发育成熟不只是细胞增殖的过程。近年的许多研究发现细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，简称PCD)在机体的胚胎发育、器官形成过程中发挥着重要的作用[1～3]。如果这对矛盾不能协调进行，将可能发生畸形甚至导致肿瘤的发生。关于这点在肿瘤方面已有许多研究，但在发育中尤其是牙齿发育所知甚少[2,3]。因此，本实验拟采用原位末端标记法(TUNEL法)及增殖细胞核抗原免疫组化技术较系统地观察和分析SD大鼠牙齿发育过程中的细胞增殖和凋亡的作用，以期揭示牙齿发育的机理。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物模型建立
选用纯系SD(Sprape Dawley, SD)大鼠20只，3月龄，体重220～250 g，上海实验动物中心提供。每日随机按4∶1雌雄比例同笼，次日早8∶00观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0天,标记后隔离饲养，记录生长情况。
1.2 标本制备
取妊娠SD雌鼠分别于胚胎13、15、17、19天及生后1、3、5、7天宰杀，剖腹取其胎鼠头部，固定在4%多聚甲醛溶液中，系列酒精脱水，石腊定向包埋，行冠状和矢状面5 μm切片。
1.3 免疫组织化学检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,简称PCNA)
免疫组织化学染色采用ABC法，石蜡切片脱蜡至水，经3% H2O2封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10分后，用正常羊血清封闭30分;加PCNA单抗(鼠抗大鼠，美国Santa Cruz公司产品)置于 4℃过夜，室温下复温1小时后滴加生物素化二抗37℃反应30分;再加ABC复合物37℃孵育30分,二氨基联苯氨(DAB)显色后，二甲苯透明,封片。
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1.4 原位末端标记法(TUNEL法)标记PCD细胞
TUNEL(Tdt-mediated dUTP nick end labelling)法(试剂盒购自美国 Oncor公司)：切片常规脱蜡至水，室温下20 mg/L的蛋白酶K消化15分；3%H2O2的PBS溶液中处理5分后，加5 μl的平衡液(TUNEL试剂盒原配)1分；再加含TDT酶反应液15 μl，37℃反应l.5小时后用预热的中止反应液中止反应(TUNEL试剂盒原配)；缓冲液1漂洗2次(15 min/次)后加2%的正常羊血清孵育30分;滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2小时;经缓冲液1、缓冲液3漂洗后，加新配制的显色液5-溴-4-氯-3-吲哚盐加硝基蓝四唑盐(NBT加BCIP)显色系统，用缓冲液3配制，NBT4.5 μl、BCIP 3.5 μl、0.24 mg/ml左旋咪唑20 μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
2 结 果
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2.l PCNA免疫组化观察
胚胎13天蕾状期,PCNA阳性细胞集中在蕾状突起中央部分，周围的上皮细胞及间充质细胞增生活跃，也散在可见阳性细胞(图l)。胚胎15天帽状期，细胞增生活跃，成釉器及牙乳头和牙囊已形成。PCNA阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域(原发性釉结节)及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，牙乳头中的间充质细胞中散在(图2)。胚胎17天钟状早期及19天钟状期，PCNA阳性细胞主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处,间充质细胞中散在可见(图3)。出生后，牙本质牙釉质基质均已开始形成，成釉器逐渐退化，PCNA阳性细胞在星网层细胞多见，间充质细胞散在可见。随着牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加，成釉器不断退化，PCNA阳性细胞在成釉器的成釉细胞及成牙本质、间充质细胞中可见，其余部位逐渐少见。
图1 蕾状期PCD阳性细胞散在于上皮细胞形成的蕾状突起中央区及头部 NBT+BCIP ×200
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图2 帽状期PCD阳性细胞集中出现在以内釉上皮中心为主的区域 NBT+BCIP ×132
图3 帽状期PCD阳性细胞出现在颈环和邻近颈环的周围间充质细胞中 NBT+BCIP ×132
2.2 TUNEL法观察
胚胎13天,口腔上皮细胞增生内陷呈蕾状突起，PCD阳性细胞集中在上皮细胞形成的蕾状头部，邻近间充质细胞增生活跃，偶见PCD阳性细胞(图4)。胚胎15天帽状期,细胞增生活跃，成釉器及牙乳头和牙囊已形成。PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域(原发性釉结节)及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，其中已分化的内釉上皮细胞约占30%，星网层细胞约40%，牙乳头中的间充质细胞约占30%，余者偶见(图5)。胚胎17天钟状早期,PCD阳性细胞明显增多，主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处，内釉上皮细胞中约40%，其邻接的星网层细胞约30%,间充质细胞约25%，其余部位散在(图6)。胚胎19天钟状期，成牙本质细胞已分化，开始分泌牙本质基质，在成牙本质细胞中PCD阳性细胞约有20%，在成釉器的星网层细胞约占30%，牙乳头中的间充质细胞约占20%，其它部位散在。生后1天牙本质、牙釉质基质均已开始形成，成釉器逐渐退化，PCD阳性细胞在星网层细胞多见约30%，间充质细胞约20%，其余偶见。生后3天牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加，成釉器不断退化，PCD阳性细胞在成釉器的星网层细胞约25%，间充质细胞约15%，其余部位少见。生后5天牙本质、牙釉质基质进一步钙化形成,成釉器进一步退化，PCD阳性细胞逐渐较少。生后7天随着基质钙化形成，牙胚各部分细胞成分明显减少，PCD阳性细胞也少见。
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图4 蕾状突起头部及周围间充质细胞中PCNA阳性细胞广泛分布 NBT+BCIP ×132
图5 帽状期PCNA阳性细胞集中分布于颈环周围 ×200
图6 牙体组织形成期PCNA阳性细胞集中出现在成牙本质细胞层 ×200
3 讨 论
发生于发育过程中的细胞凋亡是一些生物性因子或激素通过细胞膜或细胞内受体介导的细胞自然死亡现象。多用于揭示在胚胎发育、个体成熟等复杂的生理及病理过程中，在特定的时间、空间所发生的一种主动接受基因调控的程序性细胞死亡。目前已知细胞凋亡在组织、器官发育形成过程中具有组织塑形，消除不必要结构，控制细胞数量，清除多余、衰老、异常的细胞的作用。因此，本研究采用细胞凋亡特异性原位末端标记法，可以特异显示细胞凋亡在牙齿发育过程中的变化规律[4,5]。
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PCNA是一种DNA多聚酶δ的辅助因子，是细胞增殖分裂所必须的成分之一，是一种只出现在细胞增殖状态细胞核内的酸性蛋白质。它在细胞增生分裂的S期达到高峰，因此，PCNA阳性着色细胞主要反映处于S期增殖状态的细胞。本实验通过免疫组化染色观察不同时期牙齿发育过程中PCNA的情况，揭示PCNA与细胞凋亡在牙齿发育中的关系。
结果表明:在牙胚发育的蕾状期，蕾状突起头部的星形细胞及周围上皮细胞、间充质细胞中PCNA阳性细胞广泛分布，这时PCD活跃在生长中心蕾状突起的头部，说明从牙蕾开始形成到蕾状期发育完成，上皮细胞增殖极其活跃，此时的PCD调控着细胞增殖数量，可能是上皮性成釉器不断向下生长的需要，也可能是牙蕾形态形成所必需的一种主动塑形现象。帽状期PCNA阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域(原发性釉结节)及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，此时，PCD也出现在帽状成釉器中以内釉上皮为中心的生长中心(原发性釉结节、颈环)处，提示原发性釉结节及颈环是牙齿发育的中心。这些部位通过上皮间充质相互诱导作用，细胞不断分裂、增殖的同时PCD在调控着细胞的增殖和分化，调控着牙尖、牙颈、牙根部的形成。使牙胚得以不断发育及塑形。这可能是牙胚不断向外生长扩大及不断塑形的需要。牙齿发育进入钟状期，PCNA及PCD阳性细胞集中在成釉器未来牙尖形成部位(继发性釉结节)及颈环处，说明继发性釉结节是钟状期的牙齿生长中心。已有研究表明继发性釉结节是控制牙尖形成的信号中心，此期同样通过PCNA的表达及PCD出现发挥着调控牙齿发育及塑形。进入牙体组织形成期随着成釉细胞、成牙本质细胞的分化成熟，牙本质、牙釉质基质的分泌形成，成釉细胞、成牙本质细胞及星网层、牙乳头细胞均有PCNA的表达及PCD阳性细胞，说明成釉细胞、成牙本质细胞增殖旺盛分泌基质的同时，通过PCD清除已经结束生命周期的、衰老的、多余的上皮及间充质细胞，控制着细胞数量，消除继发性釉结节、星网层等暂时性结构。可见，在牙齿发育过程中，PCNA和PCD相互协调作用，及时调控着细胞的增殖和分化，及时清除异常、衰老的细胞，在牙齿形态形成过程中，发挥重要的塑形作用。
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由此得知：牙齿胚胎发育过程中PCNA和PCD有着密切的关系，它们都集中出现在生长中心的细胞中，由于生长中心的细胞多处于增殖期，在细胞增殖旺盛的同时，通过细胞凋亡可清除过多增殖的细胞，控制着细胞的数量；也及时消除异常、衰老的细胞及暂时性结构，即在细胞增殖高峰之后是细胞凋亡高峰，二者在牙齿形态形成过程中，相互协调、互相制约共同发挥着重要的塑形作用。
参考文献
1 Michael D， Weil JM, Raff MC. Programmed cell death in animal development. Cell, 1997，88:347～354
2 Sanders EJ, Wride MA. Programmed cell death in development. Int Rev Cytol, l995，163：105～173
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3 木崎治俊.ァボト-シスと疾患.医学のあゅみ,1996,178(10):712～716
4 Taniguchi K, Sato N, Uchiyama Y. Apoptosis and he-terophagy of medial edge epithelial cells of the secondary palatine shelves during fusion. Arch Histol Cytol, 1995, 58(2):191～203
5 松田秀司,三岛宏一,尾原清司,等.颚关节の发生におけるァポト-シスの意义.第十回日本颚关节学会总会,1997:65,252
(1998-07-30收稿), 百拇医药