枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究*
作者：黄元庆 鲁建华 沈 泳 卢景 古 丽 贺晨霞
单位：宁夏医学院营养与食品卫生教研室，银川 750004
关键词：枸杞总黄酮；线粒体；脂质过氧化
枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究黄元庆 鲁建华 沈 泳 卢景
古 丽 贺晨霞
摘要 利用Fe2+-Cys-His体系诱发鼠肝线粒体和红细胞产生脂质过氧化的方法，研究了枸杞总黄酮类化合物(TFL)的抗脂质过氧化作用。结果表明，TFL可阻断该体系诱发的鼠肝线粒体脂质过氧化，当TFL终浓度在0.025～2.0mg/ml范围时，对丙二醛(MDA)生成阻断率为38.38%～99.96%，呈剂量-效应关系，同时具有保持线粒体膜流动性的作用。扫描电镜观察到TFL对脂质过氧化所致红细胞形态结构的破坏有保护作用。
, 百拇医药
中图分类号 R931.71 R544.6
The protective effects of total flavonoids from Lycium Barbarum L. on lipid peroxidation of liver mitochondria and red blood cell in rats
Huang Yuanqing, Lu Jianhua, Shen Yong, Lu Jingfen, et al.
Department of Nutrition and Food Hygiene, Faculty of Preventive medicine,Ningxia Medical College, Yinchuan 750004, China
The protective effects of total flavonoids from Lycium Barbarum L.(TFL) on lipid peroxidation in mitochondria and red blood cells (RBC) induced by oxygen radicals produced by Fe2+ cysteine system were investigated. The mitochondria lipid peroxidation (measured as malondialdehyde, MDA) was significantly inhibited by TFL with a dose-response relation between the concentrations of 0.025 and 2.0 mg/ml, and the fluidity of mitochondria membrane was also protected effectively. It was observed by scan electron microscope, that the shape of RBC in the Fe2+ system was damaged significantly. The shape of RBC was remained with the addition of TFL.
, 百拇医药
Key words:flavonoids of Lycium Barbarum L., lipid peroxidation, mitochondria
枸杞总黄酮(Flavonoids of Lycium Barbarum L.TFL)是从枸杞叶中提取得到的黄酮类化合物。枸杞叶总黄酮含量为5.77mg/g[1]。TFL的HPLC分离表明它含有9个组分峰，芦丁为其组分之一[2]。以往对枸杞抗氧化活性成分的研究表明，按其对氧自由基清除作用的IC50比较，黄酮类化合物作用最强。同时发现TFL具有抑制癌细胞热代谢及抑制佛波酯引起的大鼠多形核白细胞呼吸爆发的作用。ESR研究表明，TFL具有清除O(-)/(*)2和·OH自由基的作用，所以枸杞总黄酮为枸杞中重要的抗氧化成分。
本研究利用Fe2+-Cys-His体系诱发大鼠肝脏线粒体及其红细胞的氧化损伤的模型，分析观察在体系中加入TFL后，体系中产生脂质过氧化产物MDA、膜流动性和红细胞形态变化来研究TFL的抗脂质过氧化作用。
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1 材料及主要仪器
1.1 材料
Wistar大鼠体重200～300g，宁夏医学院动物中心提供。TFL从枸杞叶(1997，11采于宁夏农科院枸杞研究所)中提取。
1.2 试剂
半胱氨酸、组胺酸、硫代巴比妥酸(TBA)、戊二醛均为分析纯；1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(1，6-dipheny1-1,3,5-hexa-triene DPH)为Sigma产品。
1.3 仪器
低温高速离心机(Beckman)，可见光分光光度计，荧光分光光度计(具偏振器 日立公司850型)，JFM-35C型扫描电镜。
2 方法
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2.1 鼠肝线粒体(MT)制备
蛋白质测定按考马斯亮兰显色法[3]。
2.2 TFL对鼠肝线粒体脂质过氧化的保护作用。
2.2.1 Fe2+-Cys-His-MT反应体系含Fe2+0.05mmol/L，Cys 0.2mmol/L, His 0.2mmol/L,MT 1.0mg/ml。在37℃该体系温育30min后，用20%三氯醋酸终止反应，按TBA显色法测定MDA。
2.2.2 Fe2+-Cys-His-MT反应体系中加入不同浓度的TFL(0.025～2.0mg/ml)，同时做空白(体系中不含Fe2+)和对照(无TFL)，温育30min终止反应，分别测定MDA，线粒体膜流动性。计算MDA形成阻断率，按公式：IR(%)=(A对照-ATFL)×100% A对照
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2.3 DPH荧光探剂标记法测定线粒体膜流动性[4]
上述不同处理的MT加等体积2×10-6mol/L DPH37℃温育30min，在4℃ 3300g离心10min，用PBS洗2次，加等体积PBS。荧光强度的测定：850型荧光分光光度计于Em=377nm,Ex=463nm条件下，分别测定偏振器处于平行和垂直时的荧光强度(Ⅰ‖,Ⅰ⊥)计算荧光偏振度P和微粘度η，按公式：
P=(Ⅰ‖-Ⅰ⊥)(Ⅰ‖+Ⅰ⊥)，η=2P/(0.46-P)
2.4 扫描电镜观察TFL对RBC脂质过氧化损伤的保护作用
诱发RBC脂质过氧化损伤处理同MT，体系中RBC终浓度为含Hb0.1g/ml。处理后各组RBC按常规电镜标本方法制备在扫描电镜下观察和照相[5]。
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3 结果
3.1 TFL对鼠肝线粒体脂质过氧的保护作用
3.1.1 TFL在Fe2+-Cys-His-MT体系中终浓度在0.0025～2.0mg/ml时对体系诱发的脂质过氧化有抑制作用，并呈现剂量-效应关系，如图1所示(呈直线相关)。
图1 TFL浓度—MDA形成阻断率(%)的剂量-效应关系
每点为三次实验的平均值，线性方程：
=20.796x-14.872 R2=0.9428
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3.1.2 线粒体膜流动性的保护 在Fe2+-Cys-His-MT中加入TFL时MT膜的η微粘度和荧光偏振度明显小于阳性对照组，提示TFL组MT脂膜流动性大于阳性对照组(附表)。
附表 线粒体膜流动性
指标
对照组(A)
TFL组(B)
非处理组(C)
η微粘度(泊)
3.1188±0.5582
2.1005±0.3476
2.9069±0.3104
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荧光偏振度
0.2767±0.0008
0.2319±0.0009
0.2647±0.0001
P值
0.0080(A:B)
0.1057(B:C)
0.6921(A:C)
3.1.3 对RBC氧化损伤的保护作用 RBC在Fe2+-Cys-His体系中加入TFL 2.0mg/ml 37℃温育30min后分析其过氧化产物MDA及对RBC进行扫描电镜观察发现，20mg/ml TFL处理组MDA形成阻断率IR(%)为37%，同时RBC在形态上与正常RBC一致，对照组RBC出现明显损伤，2.0mg/ml TFL处理组MDA形成阻断率IR(%)为5%，同时RBC在形态受到一定程度的保护(图2)。
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图2 RBC扫描电镜图片×4000倍
1.正常RBC 2. 2.0mg/mlTFL处理RBC
3.对照组RBC 4.20mg/mlTFL处理RBC
4 讨论
在体内代谢过程中，持续的产生自由基并存在相应的清除自由基的机构，使自由基的产生和消除处于动态平衡状态，当此平衡因自由基产生增加或清除能力下降而失平衡时，将产生一系列的链式反应引起机体的脂质过氧化损伤。脂质过氧化是指不饱和脂肪酸中发生的一系列自由基反应，铁、铜等过渡组金属离子可能是“自动”氧化的启动因子，而且这些金属复合物能特异高效地催化脂氢过氧化物的分解引起自由基连锁反应。质膜结构中富含不饱和脂肪酸，高氧分压和金属络合物的存在使生物膜对过氧化作用很敏感，亚细胞器含有的不饱和脂肪酸比质膜多，因而对过氧化更敏感。过氧化作用，与线粒体的膨胀、溶解，以及细胞膜受损、细胞自溶等形态改变完全一致。脂质过氧化的中间产物自由基与最终分解产物丙二醛对膜的结构产生严重损伤，影响膜功能。FUFA的脂膜过氧化的启动直接影响到膜结构以及有关过氧化产物影响膜流动、交联、结构与功能，使膜脆性增加。本实验中Fe2+诱发红细胞和线粒体脂质过氧化，产生MDA、引起线粒体膜流动性下降和红细胞结构的损坏，与上述理论相符。TFL可以抑制Fe2+诱发的红细胞脂质过氧化所产生的MDA，可以保护线粒体膜流动性和红细胞结构。结合以前ESR的研究TFL具有清除
和.OH的作用，其作用机制可能是TFL清除和.OH从而阻断了脂质过氧化的链式反应，抑制了脂质过氧化以及MDA产生的细胞毒性作用达到了保护细胞器及红细胞的作用。
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* 国家自然科学基金资助课题(39160029)
作者简介：黄元庆，男，学士，副教授
鲁建华 兰州医学院第二附属医院眼科
古丽 北京医科大学天然与仿生药物国家重点实验室
参考文献
[1] 李国莉，黄元庆.宁夏枸杞不同组分黄酮含量分析.宁夏医学院学报，1995，17(2)：114—115
[2] 黄元庆，谭安民，沈泳，等.枸杞黄酮类化合物清除氧自由基及对小鼠L1210癌细胞能量代谢的抑制作用.卫生研究，1998，27(2)：109—111
[3] 徐淑云.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991
[4] 林克椿.用荧光探剂DPH等研究腹水细胞脂膜流动性.生物化学与生物物理学进展，1981，6：32—35
[5] 章静波.细胞生物学实用方法与技术.北京：高等教育出版社，1997
(1998-09-03收稿), 百拇医药
单位：宁夏医学院营养与食品卫生教研室，银川 750004
关键词：枸杞总黄酮；线粒体；脂质过氧化
枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究黄元庆 鲁建华 沈 泳 卢景
古 丽 贺晨霞摘要 利用Fe2+-Cys-His体系诱发鼠肝线粒体和红细胞产生脂质过氧化的方法，研究了枸杞总黄酮类化合物(TFL)的抗脂质过氧化作用。结果表明，TFL可阻断该体系诱发的鼠肝线粒体脂质过氧化，当TFL终浓度在0.025～2.0mg/ml范围时，对丙二醛(MDA)生成阻断率为38.38%～99.96%，呈剂量-效应关系，同时具有保持线粒体膜流动性的作用。扫描电镜观察到TFL对脂质过氧化所致红细胞形态结构的破坏有保护作用。
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中图分类号 R931.71 R544.6
The protective effects of total flavonoids from Lycium Barbarum L. on lipid peroxidation of liver mitochondria and red blood cell in rats
Huang Yuanqing, Lu Jianhua, Shen Yong, Lu Jingfen, et al.
Department of Nutrition and Food Hygiene, Faculty of Preventive medicine,Ningxia Medical College, Yinchuan 750004, China
The protective effects of total flavonoids from Lycium Barbarum L.(TFL) on lipid peroxidation in mitochondria and red blood cells (RBC) induced by oxygen radicals produced by Fe2+ cysteine system were investigated. The mitochondria lipid peroxidation (measured as malondialdehyde, MDA) was significantly inhibited by TFL with a dose-response relation between the concentrations of 0.025 and 2.0 mg/ml, and the fluidity of mitochondria membrane was also protected effectively. It was observed by scan electron microscope, that the shape of RBC in the Fe2+ system was damaged significantly. The shape of RBC was remained with the addition of TFL.
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Key words:flavonoids of Lycium Barbarum L., lipid peroxidation, mitochondria
枸杞总黄酮(Flavonoids of Lycium Barbarum L.TFL)是从枸杞叶中提取得到的黄酮类化合物。枸杞叶总黄酮含量为5.77mg/g[1]。TFL的HPLC分离表明它含有9个组分峰，芦丁为其组分之一[2]。以往对枸杞抗氧化活性成分的研究表明，按其对氧自由基清除作用的IC50比较，黄酮类化合物作用最强。同时发现TFL具有抑制癌细胞热代谢及抑制佛波酯引起的大鼠多形核白细胞呼吸爆发的作用。ESR研究表明，TFL具有清除O(-)/(*)2和·OH自由基的作用，所以枸杞总黄酮为枸杞中重要的抗氧化成分。
本研究利用Fe2+-Cys-His体系诱发大鼠肝脏线粒体及其红细胞的氧化损伤的模型，分析观察在体系中加入TFL后，体系中产生脂质过氧化产物MDA、膜流动性和红细胞形态变化来研究TFL的抗脂质过氧化作用。
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1 材料及主要仪器
1.1 材料
Wistar大鼠体重200～300g，宁夏医学院动物中心提供。TFL从枸杞叶(1997，11采于宁夏农科院枸杞研究所)中提取。
1.2 试剂
半胱氨酸、组胺酸、硫代巴比妥酸(TBA)、戊二醛均为分析纯；1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(1，6-dipheny1-1,3,5-hexa-triene DPH)为Sigma产品。
1.3 仪器
低温高速离心机(Beckman)，可见光分光光度计，荧光分光光度计(具偏振器 日立公司850型)，JFM-35C型扫描电镜。
2 方法
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2.1 鼠肝线粒体(MT)制备
蛋白质测定按考马斯亮兰显色法[3]。
2.2 TFL对鼠肝线粒体脂质过氧化的保护作用。
2.2.1 Fe2+-Cys-His-MT反应体系含Fe2+0.05mmol/L，Cys 0.2mmol/L, His 0.2mmol/L,MT 1.0mg/ml。在37℃该体系温育30min后，用20%三氯醋酸终止反应，按TBA显色法测定MDA。
2.2.2 Fe2+-Cys-His-MT反应体系中加入不同浓度的TFL(0.025～2.0mg/ml)，同时做空白(体系中不含Fe2+)和对照(无TFL)，温育30min终止反应，分别测定MDA，线粒体膜流动性。计算MDA形成阻断率，按公式：IR(%)=(A对照-ATFL)×100% A对照
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2.3 DPH荧光探剂标记法测定线粒体膜流动性[4]
上述不同处理的MT加等体积2×10-6mol/L DPH37℃温育30min，在4℃ 3300g离心10min，用PBS洗2次，加等体积PBS。荧光强度的测定：850型荧光分光光度计于Em=377nm,Ex=463nm条件下，分别测定偏振器处于平行和垂直时的荧光强度(Ⅰ‖,Ⅰ⊥)计算荧光偏振度P和微粘度η，按公式：
P=(Ⅰ‖-Ⅰ⊥)(Ⅰ‖+Ⅰ⊥)，η=2P/(0.46-P)
2.4 扫描电镜观察TFL对RBC脂质过氧化损伤的保护作用
诱发RBC脂质过氧化损伤处理同MT，体系中RBC终浓度为含Hb0.1g/ml。处理后各组RBC按常规电镜标本方法制备在扫描电镜下观察和照相[5]。
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3 结果
3.1 TFL对鼠肝线粒体脂质过氧的保护作用
3.1.1 TFL在Fe2+-Cys-His-MT体系中终浓度在0.0025～2.0mg/ml时对体系诱发的脂质过氧化有抑制作用，并呈现剂量-效应关系，如图1所示(呈直线相关)。
图1 TFL浓度—MDA形成阻断率(%)的剂量-效应关系
每点为三次实验的平均值，线性方程：
=20.796x-14.872 R2=0.9428, http://www.100md.com
3.1.2 线粒体膜流动性的保护 在Fe2+-Cys-His-MT中加入TFL时MT膜的η微粘度和荧光偏振度明显小于阳性对照组，提示TFL组MT脂膜流动性大于阳性对照组(附表)。
附表 线粒体膜流动性
指标
对照组(A)
TFL组(B)
非处理组(C)
η微粘度(泊)
3.1188±0.5582
2.1005±0.3476
2.9069±0.3104
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荧光偏振度
0.2767±0.0008
0.2319±0.0009
0.2647±0.0001
P值
0.0080(A:B)
0.1057(B:C)
0.6921(A:C)
3.1.3 对RBC氧化损伤的保护作用 RBC在Fe2+-Cys-His体系中加入TFL 2.0mg/ml 37℃温育30min后分析其过氧化产物MDA及对RBC进行扫描电镜观察发现，20mg/ml TFL处理组MDA形成阻断率IR(%)为37%，同时RBC在形态上与正常RBC一致，对照组RBC出现明显损伤，2.0mg/ml TFL处理组MDA形成阻断率IR(%)为5%，同时RBC在形态受到一定程度的保护(图2)。
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图2 RBC扫描电镜图片×4000倍
1.正常RBC 2. 2.0mg/mlTFL处理RBC
3.对照组RBC 4.20mg/mlTFL处理RBC
4 讨论
在体内代谢过程中，持续的产生自由基并存在相应的清除自由基的机构，使自由基的产生和消除处于动态平衡状态，当此平衡因自由基产生增加或清除能力下降而失平衡时，将产生一系列的链式反应引起机体的脂质过氧化损伤。脂质过氧化是指不饱和脂肪酸中发生的一系列自由基反应，铁、铜等过渡组金属离子可能是“自动”氧化的启动因子，而且这些金属复合物能特异高效地催化脂氢过氧化物的分解引起自由基连锁反应。质膜结构中富含不饱和脂肪酸，高氧分压和金属络合物的存在使生物膜对过氧化作用很敏感，亚细胞器含有的不饱和脂肪酸比质膜多，因而对过氧化更敏感。过氧化作用，与线粒体的膨胀、溶解，以及细胞膜受损、细胞自溶等形态改变完全一致。脂质过氧化的中间产物自由基与最终分解产物丙二醛对膜的结构产生严重损伤，影响膜功能。FUFA的脂膜过氧化的启动直接影响到膜结构以及有关过氧化产物影响膜流动、交联、结构与功能，使膜脆性增加。本实验中Fe2+诱发红细胞和线粒体脂质过氧化，产生MDA、引起线粒体膜流动性下降和红细胞结构的损坏，与上述理论相符。TFL可以抑制Fe2+诱发的红细胞脂质过氧化所产生的MDA，可以保护线粒体膜流动性和红细胞结构。结合以前ESR的研究TFL具有清除
和.OH的作用，其作用机制可能是TFL清除和.OH从而阻断了脂质过氧化的链式反应，抑制了脂质过氧化以及MDA产生的细胞毒性作用达到了保护细胞器及红细胞的作用。, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(39160029)
作者简介：黄元庆，男，学士，副教授
鲁建华 兰州医学院第二附属医院眼科
古丽 北京医科大学天然与仿生药物国家重点实验室
参考文献
[1] 李国莉，黄元庆.宁夏枸杞不同组分黄酮含量分析.宁夏医学院学报，1995，17(2)：114—115
[2] 黄元庆，谭安民，沈泳，等.枸杞黄酮类化合物清除氧自由基及对小鼠L1210癌细胞能量代谢的抑制作用.卫生研究，1998，27(2)：109—111
[3] 徐淑云.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1991
[4] 林克椿.用荧光探剂DPH等研究腹水细胞脂膜流动性.生物化学与生物物理学进展，1981，6：32—35
[5] 章静波.细胞生物学实用方法与技术.北京：高等教育出版社，1997
(1998-09-03收稿), 百拇医药