胰岛素两种生物效价测量方法的比较
作者：李霞萍 方秀炜
单位：李霞萍 平湖 314200 浙江平湖第一人民医院；方秀炜 杭州 310008 杭州第一生物化学制药厂
关键词：
中国现代应用药学990336 胰岛素的效价测定采用生物检定法。最常用的为小鼠血糖法(毛细管法)和小鼠惊厥法。两种方法各有利弊。
1 血糖法[1]
1.1 仪器试剂
7530G分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)；80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)；HHW21Cu600电热恒温水温箱(上海医疗器械七厂)；微量取液器；定量加样器；0.1mol/L枸橼酸缓冲液(杭州萧山化学试剂厂)；过氧化物酶(上海丽珠东风生物技术有限公司)；葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶试剂配制：取过氧化酶(POD)0.2ml，葡萄糖氧化酶(GOD 540μ/ml 0.24ml),4-氨基安替吡啉(4-AA)10mg，二甲基苯胺0.05混合，加柠檬酸缓冲液至200ml)。(中国科学院微生物研究所)；4-氨基安替吡啉(中国上海试剂一厂)；二甲基苯胺(亭新化工厂、上海化学试剂采购供应站)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
“S”为胰岛素标准品，“T”为胰岛素样品。胰岛素原料标示量ATO27u/mg；注射用胰岛素标示量ATO40u/mg。
ds1 80mu/ml 0.25ml/鼠 dT1 80mu/ml 0.25ml/鼠
ds2 40mu/ml 0.25ml/鼠 dT2 40mu/ml 0.25ml/鼠
采用四点双交叉法，取同一种属，同一性别，出生日期相近，体重相差不超过3g的成年小白鼠，并按体重均匀合成四组，每组十只并编号，按编号顺序分别自皮下注射相同体积的标准品或供试品稀释液。给药后40min，用微量毛细管(经肝素处理)直接从眼眶静脉丛取血，用酒精灯封口，再在离心机2000rPM离心25min，用50μl微量进样器取上层清液20μl，再加酶试液25μl，水浴37℃，保温反应30min后，在550nm波长处测定吸收度。同时取0，50，100，150和200mg/ml浓度的葡萄糖标准液与血样按同法操作绘制标准曲线：y=308.6x+2.469,r=0.9990，求得血糖值。计算：
, 百拇医药
R=DantilogM
双交叉设计(Twim Cross-over)按排方法为：第一次 S2 S1 T2 T1
第二次 T1 T2 S1 S2
2 惊厥法[2]
经反复实验，采用浓度为：
ds1 60mu/ml dT1 60mu/ml 0.3ml/鼠
ds2 30mu/ml dT2 30mu/ml 0.3ml/鼠
, 百拇医药
实验取同一种属，同一性别，出生日期邻近，体重相差不超过3g的成年小白鼠，并按体重均匀分成四组，每组二十四只。在15min内分别给予小鼠皮下注射相同体积的标准品(高、低剂量)或供试品(高、低剂量)稀释液。并将注射后的小鼠放入特定已编号的铁丝笼中，再放入恒温器，观察小鼠的惊厥情况并记录。
3 结果
两法测定胰岛素效价的结果见表1、表2。
表1 胰岛素粉效价测定结果(广东长茂，效价为27μ/mg) 批号
血糖法
惊厥法
961028
28.60
, 百拇医药 28.35
970107
29.93
27.97
970318
28.88
26.04
970605
29.57
26.01
971027
29.49
28.89
, 百拇医药
970205
28.46
32.01
980608
27.20
27.96
4 讨 论
从实验的过程和结果分析，惊厥法存在以下缺点。
4.1 恒温温度对注射胰岛素的小鼠影响较大，由于恒温设备较难控制，温度过高时，小鼠普遍易惊厥，易死亡，其测定效价偏高；温度过低时，小鼠则难以惊厥，效价过低。
4.2 小鼠存在个体差异，对实验结果影响较大，尽管在实验中已筛选实验小鼠，其结果仍易引起系统误差。表2 胰岛素针效价测定结果(杭州第一生物化学制药厂，效价40μ/ml) 批号
, 百拇医药
血糖法
惊厥法
941021
39.99
35.64
941115
41.14
35.45
950203
40.25
35.50
950314
39.80
, 百拇医药
36.40
950324
40.80
36.25
950404
40.10
35.56
950515
39.90
36.35
4.3 惊厥法的实验设计为质反应，判断指标受主观因素影响较多，存在人为误差。
综上所述，血糖法采用四点交叉法，减少小鼠的个体差异，在实验中采用可见光分光光度法检测，消除了人为目测误差，提高了其方法的准确性。
1 中国药典.二部，1995∶附录99.
2 中国药典.二部，1971∶附录88. 收稿日期：1998-03-01, 百拇医药
单位：李霞萍 平湖 314200 浙江平湖第一人民医院；方秀炜 杭州 310008 杭州第一生物化学制药厂
关键词：
中国现代应用药学990336 胰岛素的效价测定采用生物检定法。最常用的为小鼠血糖法(毛细管法)和小鼠惊厥法。两种方法各有利弊。
1 血糖法[1]
1.1 仪器试剂
7530G分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)；80-2离心沉淀器(上海手术器械厂)；HHW21Cu600电热恒温水温箱(上海医疗器械七厂)；微量取液器；定量加样器；0.1mol/L枸橼酸缓冲液(杭州萧山化学试剂厂)；过氧化物酶(上海丽珠东风生物技术有限公司)；葡萄糖氧化酶(葡萄糖氧化酶试剂配制：取过氧化酶(POD)0.2ml，葡萄糖氧化酶(GOD 540μ/ml 0.24ml),4-氨基安替吡啉(4-AA)10mg，二甲基苯胺0.05混合，加柠檬酸缓冲液至200ml)。(中国科学院微生物研究所)；4-氨基安替吡啉(中国上海试剂一厂)；二甲基苯胺(亭新化工厂、上海化学试剂采购供应站)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
“S”为胰岛素标准品，“T”为胰岛素样品。胰岛素原料标示量ATO27u/mg；注射用胰岛素标示量ATO40u/mg。
ds1 80mu/ml 0.25ml/鼠 dT1 80mu/ml 0.25ml/鼠
ds2 40mu/ml 0.25ml/鼠 dT2 40mu/ml 0.25ml/鼠
采用四点双交叉法，取同一种属，同一性别，出生日期相近，体重相差不超过3g的成年小白鼠，并按体重均匀合成四组，每组十只并编号，按编号顺序分别自皮下注射相同体积的标准品或供试品稀释液。给药后40min，用微量毛细管(经肝素处理)直接从眼眶静脉丛取血，用酒精灯封口，再在离心机2000rPM离心25min，用50μl微量进样器取上层清液20μl，再加酶试液25μl，水浴37℃，保温反应30min后，在550nm波长处测定吸收度。同时取0，50，100，150和200mg/ml浓度的葡萄糖标准液与血样按同法操作绘制标准曲线：y=308.6x+2.469,r=0.9990，求得血糖值。计算：
, 百拇医药
R=DantilogM
双交叉设计(Twim Cross-over)按排方法为：第一次 S2 S1 T2 T1
第二次 T1 T2 S1 S2
2 惊厥法[2]
经反复实验，采用浓度为：
ds1 60mu/ml dT1 60mu/ml 0.3ml/鼠
ds2 30mu/ml dT2 30mu/ml 0.3ml/鼠
, 百拇医药
实验取同一种属，同一性别，出生日期邻近，体重相差不超过3g的成年小白鼠，并按体重均匀分成四组，每组二十四只。在15min内分别给予小鼠皮下注射相同体积的标准品(高、低剂量)或供试品(高、低剂量)稀释液。并将注射后的小鼠放入特定已编号的铁丝笼中，再放入恒温器，观察小鼠的惊厥情况并记录。
3 结果
两法测定胰岛素效价的结果见表1、表2。
表1 胰岛素粉效价测定结果(广东长茂，效价为27μ/mg) 批号
血糖法
惊厥法
961028
28.60
, 百拇医药 28.35
970107
29.93
27.97
970318
28.88
26.04
970605
29.57
26.01
971027
29.49
28.89
, 百拇医药
970205
28.46
32.01
980608
27.20
27.96
4 讨 论
从实验的过程和结果分析，惊厥法存在以下缺点。
4.1 恒温温度对注射胰岛素的小鼠影响较大，由于恒温设备较难控制，温度过高时，小鼠普遍易惊厥，易死亡，其测定效价偏高；温度过低时，小鼠则难以惊厥，效价过低。
4.2 小鼠存在个体差异，对实验结果影响较大，尽管在实验中已筛选实验小鼠，其结果仍易引起系统误差。表2 胰岛素针效价测定结果(杭州第一生物化学制药厂，效价40μ/ml) 批号
, 百拇医药
血糖法
惊厥法
941021
39.99
35.64
941115
41.14
35.45
950203
40.25
35.50
950314
39.80
, 百拇医药
36.40
950324
40.80
36.25
950404
40.10
35.56
950515
39.90
36.35
4.3 惊厥法的实验设计为质反应，判断指标受主观因素影响较多，存在人为误差。
综上所述，血糖法采用四点交叉法，减少小鼠的个体差异，在实验中采用可见光分光光度法检测，消除了人为目测误差，提高了其方法的准确性。
1 中国药典.二部，1995∶附录99.
2 中国药典.二部，1971∶附录88. 收稿日期：1998-03-01, 百拇医药