米托蒽醌白蛋白微球和联糖米托蒽醌白蛋白微球肝靶向性比较研究
作者：张志荣 张奇志
单位：华西医科大学药学院 成都610041
关键词：联糖米托蒽醌；白蛋白微球；肝靶向给药系统；高效液相色谱法
中国医院药学杂志990306 摘要 目的:比较米托蒽醌白蛋白微球和联糖米托蒽醌白蛋白微球肝靶向性的优劣。方法:以小鼠为实验动物，以静脉注射给药后小鼠血浆及各器官中的米托蒽醌含量为指标。结果:联糖米托蒽醌白蛋白微球在肝中的分布高于米托蒽醌白蛋白微球，而且肝中米托蒽醌较高浓度的维持时间也更长。结论:联糖米托蒽醌白蛋白微球肝靶向性比米托蒽醌白蛋白微球好，但无统计学上的显著性差异。
Comparison of liver targeting effect of mitoxantrone-bovine serum albumin-microspheres with galactosyl-mitoxantrone-bovine serum albumin-microspheres
, 百拇医药
Zhang Zhirong,Zhang Qizhi(School of Pharmacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the liver targeting effect of DHAQ-BSA-MS and Gal-DHAQ-BSA-MS.METHODS:The liver targeting effect of DHAQ-BSA-MS and Gal-DHAQ-BSA-MS were evaluated by measuring the drug concentration in each organ and plasma after i.v. administration via the tail vein of mice.RESULTS:The results showed that mean concentration of Gal-DHAQ-BSA-MS in the liver was higher than that of HDAQ-BSA-MS,in addition,the Gal-DHAQ-BSA-MS deposited a longer time in the liver with a higher drug concentration.CONCLUSIONS:There is no significant difference on statistics between DHAQ-BSA-MS and Gal-DHAQ-BSA-MS.
, 百拇医药
KEY WORDS galactosyl-mitoxantrone-bovine serum albumin-microspheres,liver targeted drug delivery system,HPLC
研究表明，静脉注射0.1～2.0 μm的微球具有明显的肝靶向性[1.2]。哺乳动物的肝实质细胞，主要是质膜部分存在无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。ASGP-R能专一性识别以非还原性半乳糖为末端的糖蛋白并与之结合[3.4]。Vera等人用放射示踪法研究证明，ASGP-R与其配体的结合具有高度的分子特异性、亲和力依赖和剂量依赖性[5]。以ASGP-R的合成配体为药物载体，其良好的肝靶向性已为众多研究所证实。
本研究直接将半乳糖基与白蛋白微球进行偶联，理论上其靶向性应优于白蛋白微球，为验证这一设计思想，比较研究了米托蒽醌(DHAQ)白蛋白微球和联糖DHAQ白蛋白微球的肝靶向性。
, 百拇医药
1 仪器、药品及动物
LC-10A高效液相色谱仪附SPD-10A紫外可见光检测器和C-R7A数据处理机(日本岛津)；TGL-16型高速台式离心机(上海医疗器械厂)；CQ-250型超声波清洗仪(上海超声波仪器厂)。
DHAQ(由本院有机教研室提供)；DHAQ白蛋白微球(自制)；联糖DHAQ白蛋白微球(自制)；其他试剂均为分析纯。昆明种小鼠18～22 g，雌雄各半(由本校实验动物中心提供)。
2 血浆及各器官中DHAQ含量测定方法
本文在报道的HPLC法的基础上加以改进[6]，用于DHAQ的生物样品的分析，结果令人满意。
2.1 色谱条件 预处理柱：YWG-ODS柱(10 μm)；分析柱：Shimpack CLC-ODS(5 μm，150×4.6 mm,ID)；流动相：甲醇-0.2 mol.L-1乙酸铵缓冲液(H2SO4调pH=2.0)(48∶52)；流速：1.0 ml.min-1；检测波长：599 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。
, http://www.100md.com
2.2 样品预处理方法 取血浆(或器官匀浆)0.5 ml，加入CHCl3∶CH3OH∶6 mol.L-1 HCl(3.8∶1.9∶0.3)的混合液1.5 ml，漩涡混合3 min，超声振荡10 min，15 000 r.min-1离心10 min。取上清液到1.5 ml离心管中，精取0.7 ml，加入浓氨水250 μl和氯仿1 ml，漩涡混合2 min，于15 000 r.min-1离心10 min。取下层液0.9 ml，流通氮气吹干，残渣用流动相100 μl溶解，漩涡混合2 min后以15000 r.min-1离心10 min，取上清液20 μl进样。
2.3 方法可行性考察 取样品液20 μl进样，在上述色谱条件下分离测定，记录DHAQ的色谱图。血浆及肝脏匀浆样品色谱如图1和图2。由图可见，空白血浆及空白器官匀浆不干扰测定，DHAQ的保留时间约为4.0 min。
, 百拇医药
按文献方法测定[6]，该法对血浆的平均回收率为102.8%，对器官匀浆的平均回收率为103.9%～98.3%；方法精密度良好。
图 1 空白血浆(a)和加有DHAQ血浆(b)的HPLC图谱
图 2 空白肝匀浆(a)和加有DHAQ肝匀浆(b)的HPLC图谱
3 DHAQ白蛋白微球在小鼠体内分布研究
取DHAQ白蛋白微球先用生理盐水洗涤，除去微球表面吸附的药物，再用含0.1% Tween-80的生理盐水超声分散均匀备用。取小鼠35只随机分为7组，每组5只，按4 mg.kg-1体重剂量(按DHAQ计)，小鼠尾静脉注射DHAQ白蛋白微球液(0.05 ml/10 g)，分别于5，10，15，25 min和1，6，12 h断头处死，剖取每只鼠的血、心、肝、脾、肺、肾。各器官分别称重，血液按小鼠体重的8%计算。按前述样品预处理方法和测定方法进行处理和测定，记录色谱图和DHAQ的峰高。根据各器官和血液的总重，计算出各器官中DHAQ的含量，将各器官中DHAQ的量相加即得总DHAQ量。各器官中的DHAQ的量与总量之比，即为各器官中DHAQ白蛋白微球在体内分布的百分数。结果见表1。
, 百拇医药
表 1 静注DHAQ-AM(按体重4 mg DHAQ/kg)后血浆和器官组织中DHAQ的分布(n=5) 时间/h
血
心
脾
肺
肝
肾
合计
0.083
1.1
1.5
1.2
, 百拇医药
7.8
65.8
22.7
100
0.167
可测
1.8
1.5
11.3
59.3
26.4
100
0.250
, 百拇医药
可测
2.2
1.6
12.0
61.5
22.7
100
0.417
可测
1.5
1.7
16.4
54.8
, http://www.100md.com
25.6
100
1.0
可测
2.8
2.6
15.9
43.0
35.8
100
6.0
可测
1.8
, http://www.100md.com
2.1
10.3
43.5
39.7
100
12.0
-
2.0
4.8
11.2
46.3
35.7
100
, 百拇医药
4 联糖DHAQ白蛋白微球在小鼠体内分布研究
取联糖DHAQ白蛋白微球的冻干针剂，加生理盐水分散，15000 r.min-1离心5 min，倾去上清液，下层微球用含0.1% Tween的生理盐水超声分散备用。取小鼠35只随机分为7组，每组5只，按4 mg.kg-1体重剂量(按DHAQ计)，小鼠尾静脉注射联糖白蛋白微球液，分别于5，10，15，25 min和1，6，12 h断头处死一组小鼠。取每只鼠的血、心、肝、脾、肺、肾。同白蛋白微球在小鼠体内的分布测定法测定。结果见表2。表 2 静注联糖DHAQ-AM(按体重4 mg DHAQ/kg)后血浆和器官组织中DHAQ的分布(n=5)
时间/h
血
心
, http://www.100md.com
脾
肺
肝
肾
合计
0.083
0.9
2.0
2.2
8.8
62.1
24.1
100
, http://www.100md.com 0.167
0.3
1.8
2.7
7.1
64.4
23.3
100
0.250
0.2
1.7
3.1
6.9
, http://www.100md.com
64.4
23.6
100
0.417
可测
1.8
3.0
7.0
62.1
26.2
100
1.0
可测
, http://www.100md.com
2.6
4.2
8.5
45.6
39.1
100
6.0
可测
2.6
4.7
8.7
45.6
38.4
, 百拇医药
100
12.0
-
2.6
5.6
10.0
48.2
33.6
100
5 DHAQ白蛋白微球与联糖DHAQ白蛋白微球肝靶向性的比较
将两种微球在肝组织中的累积量对时间作图，见图3，可见从给药后7 min开始，联糖DHAQ-AM在肝组织中的量高于DHAQ-AM。
, http://www.100md.com
图 3 按4 mg DHAQ/kg静注DHAQ-AM(a)和联糖DHAQ-AM(b)后小鼠肝中的DHAQ含量-时间曲线
将两种微球在不同时间点小鼠肝中累积量的数据进行单因素方差分析，数据处理结果见表3。F=0.28，查F检验临界值表，F0.1，1，12=3.18，F0.1，1，12，说明这两种微球在肝中靶向性没有显著性差别。
表 3 DHAQ-AM和联糖DHAQ-AM的分布数据的单因素方差分析 方差来源
平方和
自由度
均方
F
组 间
, 百拇医药
23.449 2
1
23.449
0.28
组 内
1 006.938 0
12
83.911
总方差
103.387 0
13
6 讨论
体内DHAQ含量测定研究中，曾直接沉淀蛋白后进样，经预试发现此法灵敏度不够高。最后，采用了液-液萃取处理样品的方法。在HPLC流动相的选择方面，分别试验了乙腈-水-冰醋酸(90∶60∶0.52)和甲醇-乙酸铵缓冲液两种流动相，经试验选定了后者。文献报道[7.8]，在血样中加入维生素C并立即贮于-20 ℃，可以防止DHAQ氧化，故在样品制备中均加入了维生素C作稳定剂，并且在取样当天处理测定。血中最低检出浓度达10 ng.ml-1，可满足DHAQ分析要求。
, http://www.100md.com
从小鼠体内分布实验数据看，联糖白蛋白微球在肝中分布量高于白蛋白微球。但从统计分析来看，微球联糖前后其靶向性差别无显著性。其可能的原因是：微球静注于体内后，虽然也存在ASGP-R与半乳糖基的识别和结合，但这种作用较弱，而肝中丰富的网状内皮系统对微球的内吞和融合作用，即被动靶向作用占据了主导地位。所以微球偶联半乳糖后对其靶向性无显著改善。另一方面我们也可看到联糖微球在肝中维持一个较高药物浓度的时间比不联糖微球长，可能是由于ASGP-R与半乳糖基结合后，虽作用弱，但还是延缓了微球在肝中的滞留时间。这有利于药物疗效在肝脏的发挥。
*本院1997届硕士研究生
参考文献
1 谢星辉译.控释和靶向性微球给药系统.国外药学-合成药、生化药、制剂分册，1985，6(6)：350
2 程宇慧，廖工铁，侯世祥等.白蛋白微球作为肝靶向给药载体的研究.药学学报，1993，28(1)：68
, 百拇医药
3 Baenziger JV and Maynard Y.Human hepatic lectin:physiochemical properties and specificity.J Biol Chem,1980,255:4 607
4 Schwartz AL and Rup D.Biosynthesis of the human asialoglycoprotein receptor.J Biol Chem,1983,258:11 249
5 Vera DR,Krohn KA,Stadalnik RC,et al.Tc-99m-galactosylneoglycoalbumin:In vivo characterization of receptor-mediated binding to hepatocytes.Radiology,1984,151:191
6 Ostroy F and Gams RA.An HPLC method for the quantitative determination of 1,4-dihydroxy-5,8 bis[[2-[(2-hydroxyethy) amino]ethyl]amino] 9,10-anthracenedione(DHAQ,lederle labs CL232 325,NCS 301739) in serum.J of liquid chromatography,1980,3(4):637
7 Peng YM,Ormberg DA and Alberts DS.Improved HPLC of the nem antineoplastic agents bisantrene and mitoxantrone.J of chromatography,1982,233:235
8 Ehninger G,Proksch B,Heinzel G,et al.Clinical pharmacology of mitoxantrone.Cancer treatment reports,1986,70(12):1373
(1997年11月16日收稿), http://www.100md.com
单位：华西医科大学药学院 成都610041
关键词：联糖米托蒽醌；白蛋白微球；肝靶向给药系统；高效液相色谱法
中国医院药学杂志990306 摘要 目的:比较米托蒽醌白蛋白微球和联糖米托蒽醌白蛋白微球肝靶向性的优劣。方法:以小鼠为实验动物，以静脉注射给药后小鼠血浆及各器官中的米托蒽醌含量为指标。结果:联糖米托蒽醌白蛋白微球在肝中的分布高于米托蒽醌白蛋白微球，而且肝中米托蒽醌较高浓度的维持时间也更长。结论:联糖米托蒽醌白蛋白微球肝靶向性比米托蒽醌白蛋白微球好，但无统计学上的显著性差异。
Comparison of liver targeting effect of mitoxantrone-bovine serum albumin-microspheres with galactosyl-mitoxantrone-bovine serum albumin-microspheres
, 百拇医药
Zhang Zhirong,Zhang Qizhi(School of Pharmacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the liver targeting effect of DHAQ-BSA-MS and Gal-DHAQ-BSA-MS.METHODS:The liver targeting effect of DHAQ-BSA-MS and Gal-DHAQ-BSA-MS were evaluated by measuring the drug concentration in each organ and plasma after i.v. administration via the tail vein of mice.RESULTS:The results showed that mean concentration of Gal-DHAQ-BSA-MS in the liver was higher than that of HDAQ-BSA-MS,in addition,the Gal-DHAQ-BSA-MS deposited a longer time in the liver with a higher drug concentration.CONCLUSIONS:There is no significant difference on statistics between DHAQ-BSA-MS and Gal-DHAQ-BSA-MS.
, 百拇医药
KEY WORDS galactosyl-mitoxantrone-bovine serum albumin-microspheres,liver targeted drug delivery system,HPLC
研究表明，静脉注射0.1～2.0 μm的微球具有明显的肝靶向性[1.2]。哺乳动物的肝实质细胞，主要是质膜部分存在无唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。ASGP-R能专一性识别以非还原性半乳糖为末端的糖蛋白并与之结合[3.4]。Vera等人用放射示踪法研究证明，ASGP-R与其配体的结合具有高度的分子特异性、亲和力依赖和剂量依赖性[5]。以ASGP-R的合成配体为药物载体，其良好的肝靶向性已为众多研究所证实。
本研究直接将半乳糖基与白蛋白微球进行偶联，理论上其靶向性应优于白蛋白微球，为验证这一设计思想，比较研究了米托蒽醌(DHAQ)白蛋白微球和联糖DHAQ白蛋白微球的肝靶向性。
, 百拇医药
1 仪器、药品及动物
LC-10A高效液相色谱仪附SPD-10A紫外可见光检测器和C-R7A数据处理机(日本岛津)；TGL-16型高速台式离心机(上海医疗器械厂)；CQ-250型超声波清洗仪(上海超声波仪器厂)。
DHAQ(由本院有机教研室提供)；DHAQ白蛋白微球(自制)；联糖DHAQ白蛋白微球(自制)；其他试剂均为分析纯。昆明种小鼠18～22 g，雌雄各半(由本校实验动物中心提供)。
2 血浆及各器官中DHAQ含量测定方法
本文在报道的HPLC法的基础上加以改进[6]，用于DHAQ的生物样品的分析，结果令人满意。
2.1 色谱条件 预处理柱：YWG-ODS柱(10 μm)；分析柱：Shimpack CLC-ODS(5 μm，150×4.6 mm,ID)；流动相：甲醇-0.2 mol.L-1乙酸铵缓冲液(H2SO4调pH=2.0)(48∶52)；流速：1.0 ml.min-1；检测波长：599 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl。
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2.2 样品预处理方法 取血浆(或器官匀浆)0.5 ml，加入CHCl3∶CH3OH∶6 mol.L-1 HCl(3.8∶1.9∶0.3)的混合液1.5 ml，漩涡混合3 min，超声振荡10 min，15 000 r.min-1离心10 min。取上清液到1.5 ml离心管中，精取0.7 ml，加入浓氨水250 μl和氯仿1 ml，漩涡混合2 min，于15 000 r.min-1离心10 min。取下层液0.9 ml，流通氮气吹干，残渣用流动相100 μl溶解，漩涡混合2 min后以15000 r.min-1离心10 min，取上清液20 μl进样。
2.3 方法可行性考察 取样品液20 μl进样，在上述色谱条件下分离测定，记录DHAQ的色谱图。血浆及肝脏匀浆样品色谱如图1和图2。由图可见，空白血浆及空白器官匀浆不干扰测定，DHAQ的保留时间约为4.0 min。
, 百拇医药
按文献方法测定[6]，该法对血浆的平均回收率为102.8%，对器官匀浆的平均回收率为103.9%～98.3%；方法精密度良好。
图 1 空白血浆(a)和加有DHAQ血浆(b)的HPLC图谱
图 2 空白肝匀浆(a)和加有DHAQ肝匀浆(b)的HPLC图谱
3 DHAQ白蛋白微球在小鼠体内分布研究
取DHAQ白蛋白微球先用生理盐水洗涤，除去微球表面吸附的药物，再用含0.1% Tween-80的生理盐水超声分散均匀备用。取小鼠35只随机分为7组，每组5只，按4 mg.kg-1体重剂量(按DHAQ计)，小鼠尾静脉注射DHAQ白蛋白微球液(0.05 ml/10 g)，分别于5，10，15，25 min和1，6，12 h断头处死，剖取每只鼠的血、心、肝、脾、肺、肾。各器官分别称重，血液按小鼠体重的8%计算。按前述样品预处理方法和测定方法进行处理和测定，记录色谱图和DHAQ的峰高。根据各器官和血液的总重，计算出各器官中DHAQ的含量，将各器官中DHAQ的量相加即得总DHAQ量。各器官中的DHAQ的量与总量之比，即为各器官中DHAQ白蛋白微球在体内分布的百分数。结果见表1。
, 百拇医药
表 1 静注DHAQ-AM(按体重4 mg DHAQ/kg)后血浆和器官组织中DHAQ的分布(n=5) 时间/h
血
心
脾
肺
肝
肾
合计
0.083
1.1
1.5
1.2
, 百拇医药
7.8
65.8
22.7
100
0.167
可测
1.8
1.5
11.3
59.3
26.4
100
0.250
, 百拇医药
可测
2.2
1.6
12.0
61.5
22.7
100
0.417
可测
1.5
1.7
16.4
54.8
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25.6
100
1.0
可测
2.8
2.6
15.9
43.0
35.8
100
6.0
可测
1.8
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2.1
10.3
43.5
39.7
100
12.0
-
2.0
4.8
11.2
46.3
35.7
100
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4 联糖DHAQ白蛋白微球在小鼠体内分布研究
取联糖DHAQ白蛋白微球的冻干针剂，加生理盐水分散，15000 r.min-1离心5 min，倾去上清液，下层微球用含0.1% Tween的生理盐水超声分散备用。取小鼠35只随机分为7组，每组5只，按4 mg.kg-1体重剂量(按DHAQ计)，小鼠尾静脉注射联糖白蛋白微球液，分别于5，10，15，25 min和1，6，12 h断头处死一组小鼠。取每只鼠的血、心、肝、脾、肺、肾。同白蛋白微球在小鼠体内的分布测定法测定。结果见表2。表 2 静注联糖DHAQ-AM(按体重4 mg DHAQ/kg)后血浆和器官组织中DHAQ的分布(n=5)
时间/h
血
心
, http://www.100md.com
脾
肺
肝
肾
合计
0.083
0.9
2.0
2.2
8.8
62.1
24.1
100
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0.3
1.8
2.7
7.1
64.4
23.3
100
0.250
0.2
1.7
3.1
6.9
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64.4
23.6
100
0.417
可测
1.8
3.0
7.0
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26.2
100
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2.6
4.2
8.5
45.6
39.1
100
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可测
2.6
4.7
8.7
45.6
38.4
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100
12.0
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2.6
5.6
10.0
48.2
33.6
100
5 DHAQ白蛋白微球与联糖DHAQ白蛋白微球肝靶向性的比较
将两种微球在肝组织中的累积量对时间作图，见图3，可见从给药后7 min开始，联糖DHAQ-AM在肝组织中的量高于DHAQ-AM。
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图 3 按4 mg DHAQ/kg静注DHAQ-AM(a)和联糖DHAQ-AM(b)后小鼠肝中的DHAQ含量-时间曲线
将两种微球在不同时间点小鼠肝中累积量的数据进行单因素方差分析，数据处理结果见表3。F=0.28，查F检验临界值表，F0.1，1，12=3.18，F
表 3 DHAQ-AM和联糖DHAQ-AM的分布数据的单因素方差分析 方差来源
平方和
自由度
均方
F
组 间
, 百拇医药
23.449 2
1
23.449
0.28
组 内
1 006.938 0
12
83.911
总方差
103.387 0
13
6 讨论
体内DHAQ含量测定研究中，曾直接沉淀蛋白后进样，经预试发现此法灵敏度不够高。最后，采用了液-液萃取处理样品的方法。在HPLC流动相的选择方面，分别试验了乙腈-水-冰醋酸(90∶60∶0.52)和甲醇-乙酸铵缓冲液两种流动相，经试验选定了后者。文献报道[7.8]，在血样中加入维生素C并立即贮于-20 ℃，可以防止DHAQ氧化，故在样品制备中均加入了维生素C作稳定剂，并且在取样当天处理测定。血中最低检出浓度达10 ng.ml-1，可满足DHAQ分析要求。
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从小鼠体内分布实验数据看，联糖白蛋白微球在肝中分布量高于白蛋白微球。但从统计分析来看，微球联糖前后其靶向性差别无显著性。其可能的原因是：微球静注于体内后，虽然也存在ASGP-R与半乳糖基的识别和结合，但这种作用较弱，而肝中丰富的网状内皮系统对微球的内吞和融合作用，即被动靶向作用占据了主导地位。所以微球偶联半乳糖后对其靶向性无显著改善。另一方面我们也可看到联糖微球在肝中维持一个较高药物浓度的时间比不联糖微球长，可能是由于ASGP-R与半乳糖基结合后，虽作用弱，但还是延缓了微球在肝中的滞留时间。这有利于药物疗效在肝脏的发挥。
*本院1997届硕士研究生
参考文献
1 谢星辉译.控释和靶向性微球给药系统.国外药学-合成药、生化药、制剂分册，1985，6(6)：350
2 程宇慧，廖工铁，侯世祥等.白蛋白微球作为肝靶向给药载体的研究.药学学报，1993，28(1)：68
, 百拇医药
3 Baenziger JV and Maynard Y.Human hepatic lectin:physiochemical properties and specificity.J Biol Chem,1980,255:4 607
4 Schwartz AL and Rup D.Biosynthesis of the human asialoglycoprotein receptor.J Biol Chem,1983,258:11 249
5 Vera DR,Krohn KA,Stadalnik RC,et al.Tc-99m-galactosylneoglycoalbumin:In vivo characterization of receptor-mediated binding to hepatocytes.Radiology,1984,151:191
6 Ostroy F and Gams RA.An HPLC method for the quantitative determination of 1,4-dihydroxy-5,8 bis[[2-[(2-hydroxyethy) amino]ethyl]amino] 9,10-anthracenedione(DHAQ,lederle labs CL232 325,NCS 301739) in serum.J of liquid chromatography,1980,3(4):637
7 Peng YM,Ormberg DA and Alberts DS.Improved HPLC of the nem antineoplastic agents bisantrene and mitoxantrone.J of chromatography,1982,233:235
8 Ehninger G,Proksch B,Heinzel G,et al.Clinical pharmacology of mitoxantrone.Cancer treatment reports,1986,70(12):1373
(1997年11月16日收稿), http://www.100md.com