E-cadherin与PCNA在吸烟小鼠气道上皮中的表达*
作者：吴人亮 许三林 王曦 郝春荣 李娜萍
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030
关键词：上皮钙粘附素；增殖细胞核抗原；吸烟；气道
同济医科大学学报990310 摘要 应用免疫组织化学和原位分子杂交方法，检测不同阶段吸烟小鼠细支气管上皮细胞上皮钙粘附素(E-cadherin, E-cd)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达与分布。探讨吸烟气道E-cd表达变化对上皮增殖、重建的影响。结果： 小鼠吸烟4周时，细支气管上皮E-cd表达与正常对照组比较明显下调，而PCNA阳性细胞率明显高于正常对照组(P<0.01)；吸烟8周时，E-cd表达上调，而PCNA表达比吸烟4周时明显减少；吸烟12周时，E-cd与PCNA表达阳性细胞率与吸烟4周时相比均明显减少(P<0.01)。而各组间的细支气管上皮细胞内的E-cd mRNA含量及表达强度均无明显变化。结论： 吸烟引起气道上皮E-cd表达的调控发生在翻译后水平，其胞膜上E-cd表达的下调在吸烟早期气道上皮损伤后修复中发挥重要作用。
, 百拇医药
E-cadherin and PCNA Expression on Airway
Epithelium in Smoking Mice
Wu Renliang, Xu Sanlin, Wang Xi et al
Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract Immunohistochemistry and hybridization in situ technique were used to detect E-cadherin (E-cd) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression and distribution on epithelial cells of bronchioles in smoking mice of different stages to investigate the effects of E-cd expression change on epithelial proliferation and reconstruction in smoking mice. The results showed that 4 weeks after smoking, the E-cd expression in epithelium of mice bronchioles was downregulated as compared with the normal control group, and percentage of postive cells of PCNA was significantly higher than that in normal control(P<0.01). Eight weeks after smoking, E-cd expression was up-regulated and PCNA expression was significantly lower than that after smoking for 4 weeks. Twelve weeks after smoking, percentage of postive cells of E-cd and PCNA was significantly lower than that after smoking for 4 weeks(P<0.01). But the content and staining intensity of E-cd mRNA were not obviously changed in the epithelial cells of bronchoiles among the different groups. It is concluded that E-cd expression is regulated at the posttranslational level. The down regulation of membranous E-cd expression plays an important role in the repair after the injury of airway epithelial cells at early stage of smoking
, 百拇医药
Key words E-cadherin; proliferating cell nuclear antigen; smoking; airway
上皮钙粘附素(E-cadherin, E-cd)是钙依赖性具有同种上皮亲合性的粘附分子，是维持正常上皮细胞形态完整性和极性的跨膜糖蛋白，是上皮钙粘附素-连环素复合体(E-cadherin/catenin complex, E-cd/cat complex)主要成分[1]。本文采用免疫组织化学及原位分子杂交技术检测不同阶段吸烟小鼠细支气管上皮细胞E-cd表达变化，并通过增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学观察，探讨吸烟小鼠气道E-cd表达变化对上皮增殖重建的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物香烟烟雾吸入实验
健康昆明种小白鼠32只，体重18～20 g(由同济医科大学实验动物学部提供)，每组8只，共分4组，其中一组不吸烟作为正常对照，余下3组做香烟烟雾吸入实验，实验用烟为市售红双喜牌过滤嘴香烟(武汉卷烟厂制)，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支，每次需1 h，每d 1次，每周6次，连续12周，分别于4、8、12周吸烟完毕后各处死一组动物。
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1.2 免疫组织化学染色
所有标本取同一部位肺组织，用甲基纤维素包埋，切成6 μm厚冰冻切片。(1)E-cd染色 ： 一抗即抗E-cd单克隆抗体(DECMA-1，大鼠单克隆Uvomoralin IgG)为Sigma公司产品，1∶500稀释；通用型SP试剂盒(包括生物素化羊抗大鼠二抗IgG)为Santa cruz产品，购自北京中山生物技术有限公司。DAB显色，甲基绿复染细胞核，阴性对照用PBS代替一抗。(2)PCNA染色：一抗为PCNA[PC10]鼠抗大鼠单克隆抗体(北京中山生物有限公司产品)1∶100稀释，二抗和SP法采用Sant cruz产品，染色前用微波进行抗原修复，以正常血清代表一抗阴性对照。
1.3 E-cd mRNA原位杂交
载有人E-cadherin(386 bp) CDNA(HC61)的重组质粒(由德国Sachs博士惠赠)经扩增、鉴定、BamHⅠ酶切、回收，以DIG-11dup随机引物法标记，方法按德国Biehringer Mannbeim公司的地高辛高效标记及检测试验盒说明。
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冰冻切片经40 g/L多聚甲醛固定后，0.2 mol/L HCl室温处理20 min，2 mg/L蛋白酶K 37 ℃ 消化30 min，40 g/L多聚甲醛后固定，脱水、空气干燥，预杂交42 ℃、1 h，杂交42 ℃、16～20 h，2×SSC、1.0 g/L SDS室温洗2次、每次3 min，0.1×SSC、1.0 g SDS、42 ℃洗2次，每次3 min。显色检测按试剂盒说明，阴性对照为不加样探针或地高辛抗体。
1.4 判断标准及数据处理
免疫组织化学染色，E-cd阳性反应为细胞膜上，PCNA阳性为细胞核内，呈棕黄色，结果观察采用半定量的记录方法，分别在Olympus双目显微镜，经400倍放大下随机连续观察500个细支气管上皮细胞中的阳性细胞数，取其均值，换算为百分率，采用SAS软件进行配对t检验。
2 结果
, 百拇医药 2.1 E-cd及PCNA免疫组织化学染色特征
正常未吸烟对照组小鼠细支气管上皮细胞均有E-cd表达，阳性细胞呈黄色；连续线型分布在细支气管上皮细胞膜上，其上皮细胞相互连接的侧面更为深染，胞浆内不着色，细胞轮廓清楚(图1)。吸烟4周时，细支气管阳性细胞减少，部分上皮细胞膜上呈不连续的棕黄色、淡染，上皮细胞连接侧面膜上表达强度减弱(图1)。吸烟8周时，细支气管上皮细胞均有E-cd阳性表达，并围绕细胞膜上呈均匀分布，细胞界线清楚(图2)；吸烟12周时，细支气管上皮细胞膜上E-cd阳性细胞明显减少，上皮细胞表达强度明显减弱，不连续、弥散，细胞界线不清。
正常未吸烟对照组小鼠细支气管上皮细胞PCNA阳性细胞呈棕黄色，位于核内，主要分布于粘膜基底部，数量较少，呈不连续带状(图3)。吸烟4周时，PCNA阳性细胞数量增多，气道表面中最多，在核上移细胞中呈强阳性着色(图3)。吸烟8周时，PCNA阳性分布异常，其数量明显减少，表达强度也减弱(图4)。吸烟12周时，PCNA阳性细胞数量明显减少，着色变浅。
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图1 吸烟4周时细支气管上皮细胞膜上E-cd阳性细胞明显减少，表达强度减弱；右上显示E-cd在正常组上皮细胞膜上有完整表达，呈强阳性。 SP ×400
图2 吸烟8周时细支气管E-cd在上皮细胞膜上呈均匀表达。 SP ×400
图3 吸烟4周时细支气管上皮细胞核内PCNA阳性细胞明显增多；
右上显示正常组上皮基底部有带状排列的PCNA阳性细胞。 SP ×400
图4 吸烟8周时细支气管PCNA阳性上皮细胞上移，位于表面，数量减少。SP ×400
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图5 吸烟4周时细支气管E-cd mRNA阳性表达，胞浆内呈现均匀、紫蓝色的细颗粒； 右上为正常组E-cd mRNA表达。原位杂交×400
图6 吸烟8周时细支气管E-cd mRNA表达。原位杂交 ×400
2.2 E-cd mRNA含量的变化
正常未吸烟对照组细支气管上皮细胞胞浆内可见E-cd mRNA表达，呈紫蓝色，细颗粒状，均匀分布于胞浆内。而吸烟4周、8周及12周时，小鼠细支气管上皮细胞胞浆内均可见紫蓝色细颗粒均匀分布的E-cd mRNA表达，形态学观察其表达的含量及强度均未见明显差异。
2.3 E-cd与PCNA阳性表达率
各组小鼠细支气管上皮细胞E-cd与PCNA表达阳性细胞率见附表。
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附表 各组细支气管上皮中E-cd和PCNA阳性细胞率(
±s) 组 别
n
E-cd
PCNA
N
8
79.702
±4.366
5.233
±1.073
S-4周
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8
39.454
±10.780*
31.225
±4.444*
S-8周
8
79.347
±4.916△
7.289
±1.502△
S-12周
, 百拇医药
8
40.302
±3.001*#
6.796
±0.470△
N为正常未吸烟对照组, S为吸烟组;
与正常组比较 * P<0.01，与吸烟4周比较 △ P<0.01
与吸烟8周比较 # P<0.01
由附表可见，吸烟4周时，细支气管上皮中E-cd表达明显低于正常未吸烟对照组，PCNA表达明显高于正常未吸烟对照组(P<0.01)；吸烟8周时，E-cd表达上升，PCNA表达下降，两者与正常未吸烟对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；吸烟时间延长至12周时，E-cd再次下调与正常未吸烟对照组和吸烟8周时比较，差异有极显著意义(P<0.01)，与吸烟4周时比较，差异无显著意义(P>0.05)；而PCNA阳性细胞率却明显下降，除与吸烟4周时比较有极显著性差异外(P<0.01)，与其他各组比较差异均无显著意义(均为P>0.05)。
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3 讨论
上皮钙粘附素(E-cadherin, E-cd)是维持气道上皮细胞极性和完整性的主要的细胞粘分子[1]。吸烟是许多疾病的致病因素，特别是慢性阻塞性肺疾病的主要病因之一，而在我们以往对实验动物的形态学研究中，观察到烟雾吸入造成小气道损伤较为突出[2]，其上皮细胞完整性遭受破坏，受损的气道上皮可通过增生、分化予以修复。并通过对其气道上皮细胞E-cd的检测，发现E-cd表达首先下调，随后逐渐上调，直到恢复正常的动态变化过程[3]。近来人们对E-cd表达变化与炎症及损伤修复的关系已有报道[4]。Hanby等通过对人体胃肠道粘膜上皮修复过程中E-cd表达下调，证实E-cd下调可减少细胞间粘附，增加其细胞增殖、迁移的能力，促进其上皮细胞再生修复。我们对吸烟引起气道上皮损伤与修复中E-cd表达变化的研究也有相似的规律[3]。本次实验进一步对不同阶段吸烟小鼠细支气管上皮细胞E-cd与PCNA表达的动态变化进行检测，并结合以往的形态学观察发现小鼠吸烟4周时，小气道粘膜上皮细胞间E-cd表达下调，强度减弱，上皮细胞变性、死亡，细胞连接松散，基底细胞增生、迁移，PCNA表达的阳性细胞率明显升高，表现为细胞再生予以修复的变化。吸烟8周时，上皮细胞损伤减轻，细胞间连接形成，E-cd在上皮细胞膜上表达上调，而细胞增殖分化迁移，随之减少，PCNA阳性表达也明显下降，恢复到正常水平，表现为气道粘膜上皮处在修复后阶段。随着吸烟时间延长至12周时，E-cd表达再次下调，此时上皮细胞损伤程度加重，上皮细胞凋亡明显增加，而细胞增殖再生修复的能力减弱[5]。由此可见，E-cd与PCNA表达的变化，反映了吸烟引起气道上皮细胞损伤与修复的病变特征。
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Hanby在研究胃肠道上皮修复过程中，其粘膜上皮E-cd mRNA表达与正常相当，提示E-cd表达的下调主要发生在翻译或翻译后水平[4]。本实验原位杂交结果显示各组细支气管上皮细胞E-cd mRNA表达含量及强度均无明显变化，说明E-cd的表达变化仅发生于蛋白水平而非mRNA水平。近来研究表明E-cd有两种存在形式，即胞膜型和可溶型。在损伤和炎症的修复过程中，可能由于多种细胞因子的参与，使上皮细胞间E-cd/cat复合体及其核心细胞骨架蛋白发生酪氨酸磷酸化，使该复合体结构的完整性遭受破坏，E-cd不能定位于膜上，继而被胞浆内蛋白酶降解成可溶性片段，移入胞浆，丧失其粘附的功能[6]，此时胞浆内可溶性E-cd及β-cat水平升高，胞膜上E-cd表达下降。游离的β-cat可与APC或EGF受体相结合，有利于增殖信号的传导[7,8]。从而控制相关蛋白的酪氨酸磷酸化，调节E-cd表达和分布，可减轻上皮细胞损伤，有利于其细胞再生修复。
吸烟引起呼吸道上皮细胞损伤与修复的病变是机体适应性自身调节过程，随着病变的反复发作，气道炎症加重，损伤与修复动态平衡破坏，导致不可逆气道损害。所以进一步研究吸烟引起呼吸道上皮细胞E-cd与其复合体表达与调控，对阐明COPD各阶段气道屏障功能丧失的发生机制，逆转病变的进展具有重要意义。
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* 国家自然科学基金资助项目(No.39570288)
作者简介:吴人亮，男，1943年生，教授
参考文献
1 王曦, 李军, 吴人亮. 上皮钙粘附素-连环素复合体功能调控的研究进展. 国外医学分子生物学分册, 1998, 20(1): 42
2 吴人亮, 李文英, 车东媛等. 吸烟对小鼠小气道损伤的形态学研究. 同济医科大学学报, 1995, 24(5): 395
3 王曦, 吴人亮, 郝春荣等. 吸烟小鼠呼吸道上皮细胞上皮钙粘附素表达的研究. 中国组织化学与细胞化学杂志, 1998, 7(3): 302
4 Hanby A M, Chinery R, Porlsom R et al. Down regulation of E-cadherin in the reparative epithelium of the human gastrointestinal tract. Am J Pathol, 1996, 148: 723
, 百拇医药
5 吴人亮, 郝春荣, 许三林等. 吸烟小鼠呼吸道上皮凋亡与增殖的关系. 同济医科大学学报, 1999, 28(2):104
6 Daniel J M, Reynolds A B. Tyrosine phosphorylation and cadherin/catenin function. Bioessays, 1997, 19: 883
7 Hulsken J, Birchmeier W, Behrens J. E-cadherin and APC compete for the interraction with β-catenin and the cytoskeletion. J Cell Biol, 1996, 127: 2061
8 Hinck L, Nathke I S, Papkoff J et al. Dynanies of cadherin/catenin complex formation: Novel protein interactions and pathways of complex assembly. J Cell Biol, 1994, 125: 1327
(1998-12-25 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030
关键词：上皮钙粘附素；增殖细胞核抗原；吸烟；气道
同济医科大学学报990310 摘要 应用免疫组织化学和原位分子杂交方法，检测不同阶段吸烟小鼠细支气管上皮细胞上皮钙粘附素(E-cadherin, E-cd)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达与分布。探讨吸烟气道E-cd表达变化对上皮增殖、重建的影响。结果： 小鼠吸烟4周时，细支气管上皮E-cd表达与正常对照组比较明显下调，而PCNA阳性细胞率明显高于正常对照组(P<0.01)；吸烟8周时，E-cd表达上调，而PCNA表达比吸烟4周时明显减少；吸烟12周时，E-cd与PCNA表达阳性细胞率与吸烟4周时相比均明显减少(P<0.01)。而各组间的细支气管上皮细胞内的E-cd mRNA含量及表达强度均无明显变化。结论： 吸烟引起气道上皮E-cd表达的调控发生在翻译后水平，其胞膜上E-cd表达的下调在吸烟早期气道上皮损伤后修复中发挥重要作用。
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E-cadherin and PCNA Expression on Airway
Epithelium in Smoking Mice
Wu Renliang, Xu Sanlin, Wang Xi et al
Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract Immunohistochemistry and hybridization in situ technique were used to detect E-cadherin (E-cd) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression and distribution on epithelial cells of bronchioles in smoking mice of different stages to investigate the effects of E-cd expression change on epithelial proliferation and reconstruction in smoking mice. The results showed that 4 weeks after smoking, the E-cd expression in epithelium of mice bronchioles was downregulated as compared with the normal control group, and percentage of postive cells of PCNA was significantly higher than that in normal control(P<0.01). Eight weeks after smoking, E-cd expression was up-regulated and PCNA expression was significantly lower than that after smoking for 4 weeks. Twelve weeks after smoking, percentage of postive cells of E-cd and PCNA was significantly lower than that after smoking for 4 weeks(P<0.01). But the content and staining intensity of E-cd mRNA were not obviously changed in the epithelial cells of bronchoiles among the different groups. It is concluded that E-cd expression is regulated at the posttranslational level. The down regulation of membranous E-cd expression plays an important role in the repair after the injury of airway epithelial cells at early stage of smoking
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Key words E-cadherin; proliferating cell nuclear antigen; smoking; airway
上皮钙粘附素(E-cadherin, E-cd)是钙依赖性具有同种上皮亲合性的粘附分子，是维持正常上皮细胞形态完整性和极性的跨膜糖蛋白，是上皮钙粘附素-连环素复合体(E-cadherin/catenin complex, E-cd/cat complex)主要成分[1]。本文采用免疫组织化学及原位分子杂交技术检测不同阶段吸烟小鼠细支气管上皮细胞E-cd表达变化，并通过增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学观察，探讨吸烟小鼠气道E-cd表达变化对上皮增殖重建的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物香烟烟雾吸入实验
健康昆明种小白鼠32只，体重18～20 g(由同济医科大学实验动物学部提供)，每组8只，共分4组，其中一组不吸烟作为正常对照，余下3组做香烟烟雾吸入实验，实验用烟为市售红双喜牌过滤嘴香烟(武汉卷烟厂制)，尼古丁含量1 mg/支，焦油含量18 mg/支，每次需1 h，每d 1次，每周6次，连续12周，分别于4、8、12周吸烟完毕后各处死一组动物。
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1.2 免疫组织化学染色
所有标本取同一部位肺组织，用甲基纤维素包埋，切成6 μm厚冰冻切片。(1)E-cd染色 ： 一抗即抗E-cd单克隆抗体(DECMA-1，大鼠单克隆Uvomoralin IgG)为Sigma公司产品，1∶500稀释；通用型SP试剂盒(包括生物素化羊抗大鼠二抗IgG)为Santa cruz产品，购自北京中山生物技术有限公司。DAB显色，甲基绿复染细胞核，阴性对照用PBS代替一抗。(2)PCNA染色：一抗为PCNA[PC10]鼠抗大鼠单克隆抗体(北京中山生物有限公司产品)1∶100稀释，二抗和SP法采用Sant cruz产品，染色前用微波进行抗原修复，以正常血清代表一抗阴性对照。
1.3 E-cd mRNA原位杂交
载有人E-cadherin(386 bp) CDNA(HC61)的重组质粒(由德国Sachs博士惠赠)经扩增、鉴定、BamHⅠ酶切、回收，以DIG-11dup随机引物法标记，方法按德国Biehringer Mannbeim公司的地高辛高效标记及检测试验盒说明。
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冰冻切片经40 g/L多聚甲醛固定后，0.2 mol/L HCl室温处理20 min，2 mg/L蛋白酶K 37 ℃ 消化30 min，40 g/L多聚甲醛后固定，脱水、空气干燥，预杂交42 ℃、1 h，杂交42 ℃、16～20 h，2×SSC、1.0 g/L SDS室温洗2次、每次3 min，0.1×SSC、1.0 g SDS、42 ℃洗2次，每次3 min。显色检测按试剂盒说明，阴性对照为不加样探针或地高辛抗体。
1.4 判断标准及数据处理
免疫组织化学染色，E-cd阳性反应为细胞膜上，PCNA阳性为细胞核内，呈棕黄色，结果观察采用半定量的记录方法，分别在Olympus双目显微镜，经400倍放大下随机连续观察500个细支气管上皮细胞中的阳性细胞数，取其均值，换算为百分率，采用SAS软件进行配对t检验。
2 结果
, 百拇医药 2.1 E-cd及PCNA免疫组织化学染色特征
正常未吸烟对照组小鼠细支气管上皮细胞均有E-cd表达，阳性细胞呈黄色；连续线型分布在细支气管上皮细胞膜上，其上皮细胞相互连接的侧面更为深染，胞浆内不着色，细胞轮廓清楚(图1)。吸烟4周时，细支气管阳性细胞减少，部分上皮细胞膜上呈不连续的棕黄色、淡染，上皮细胞连接侧面膜上表达强度减弱(图1)。吸烟8周时，细支气管上皮细胞均有E-cd阳性表达，并围绕细胞膜上呈均匀分布，细胞界线清楚(图2)；吸烟12周时，细支气管上皮细胞膜上E-cd阳性细胞明显减少，上皮细胞表达强度明显减弱，不连续、弥散，细胞界线不清。
正常未吸烟对照组小鼠细支气管上皮细胞PCNA阳性细胞呈棕黄色，位于核内，主要分布于粘膜基底部，数量较少，呈不连续带状(图3)。吸烟4周时，PCNA阳性细胞数量增多，气道表面中最多，在核上移细胞中呈强阳性着色(图3)。吸烟8周时，PCNA阳性分布异常，其数量明显减少，表达强度也减弱(图4)。吸烟12周时，PCNA阳性细胞数量明显减少，着色变浅。
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图1 吸烟4周时细支气管上皮细胞膜上E-cd阳性细胞明显减少，表达强度减弱；右上显示E-cd在正常组上皮细胞膜上有完整表达，呈强阳性。 SP ×400
图2 吸烟8周时细支气管E-cd在上皮细胞膜上呈均匀表达。 SP ×400
图3 吸烟4周时细支气管上皮细胞核内PCNA阳性细胞明显增多；
右上显示正常组上皮基底部有带状排列的PCNA阳性细胞。 SP ×400
图4 吸烟8周时细支气管PCNA阳性上皮细胞上移，位于表面，数量减少。SP ×400
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图5 吸烟4周时细支气管E-cd mRNA阳性表达，胞浆内呈现均匀、紫蓝色的细颗粒； 右上为正常组E-cd mRNA表达。原位杂交×400
图6 吸烟8周时细支气管E-cd mRNA表达。原位杂交 ×400
2.2 E-cd mRNA含量的变化
正常未吸烟对照组细支气管上皮细胞胞浆内可见E-cd mRNA表达，呈紫蓝色，细颗粒状，均匀分布于胞浆内。而吸烟4周、8周及12周时，小鼠细支气管上皮细胞胞浆内均可见紫蓝色细颗粒均匀分布的E-cd mRNA表达，形态学观察其表达的含量及强度均未见明显差异。
2.3 E-cd与PCNA阳性表达率
各组小鼠细支气管上皮细胞E-cd与PCNA表达阳性细胞率见附表。
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附表 各组细支气管上皮中E-cd和PCNA阳性细胞率(
±s) 组 别n
E-cd
PCNA
N
8
79.702
±4.366
5.233
±1.073
S-4周
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8
39.454
±10.780*
31.225
±4.444*
S-8周
8
79.347
±4.916△
7.289
±1.502△
S-12周
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8
40.302
±3.001*#
6.796
±0.470△
N为正常未吸烟对照组, S为吸烟组;
与正常组比较 * P<0.01，与吸烟4周比较 △ P<0.01
与吸烟8周比较 # P<0.01
由附表可见，吸烟4周时，细支气管上皮中E-cd表达明显低于正常未吸烟对照组，PCNA表达明显高于正常未吸烟对照组(P<0.01)；吸烟8周时，E-cd表达上升，PCNA表达下降，两者与正常未吸烟对照组比较均无显著性差异(P>0.05)；吸烟时间延长至12周时，E-cd再次下调与正常未吸烟对照组和吸烟8周时比较，差异有极显著意义(P<0.01)，与吸烟4周时比较，差异无显著意义(P>0.05)；而PCNA阳性细胞率却明显下降，除与吸烟4周时比较有极显著性差异外(P<0.01)，与其他各组比较差异均无显著意义(均为P>0.05)。
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3 讨论
上皮钙粘附素(E-cadherin, E-cd)是维持气道上皮细胞极性和完整性的主要的细胞粘分子[1]。吸烟是许多疾病的致病因素，特别是慢性阻塞性肺疾病的主要病因之一，而在我们以往对实验动物的形态学研究中，观察到烟雾吸入造成小气道损伤较为突出[2]，其上皮细胞完整性遭受破坏，受损的气道上皮可通过增生、分化予以修复。并通过对其气道上皮细胞E-cd的检测，发现E-cd表达首先下调，随后逐渐上调，直到恢复正常的动态变化过程[3]。近来人们对E-cd表达变化与炎症及损伤修复的关系已有报道[4]。Hanby等通过对人体胃肠道粘膜上皮修复过程中E-cd表达下调，证实E-cd下调可减少细胞间粘附，增加其细胞增殖、迁移的能力，促进其上皮细胞再生修复。我们对吸烟引起气道上皮损伤与修复中E-cd表达变化的研究也有相似的规律[3]。本次实验进一步对不同阶段吸烟小鼠细支气管上皮细胞E-cd与PCNA表达的动态变化进行检测，并结合以往的形态学观察发现小鼠吸烟4周时，小气道粘膜上皮细胞间E-cd表达下调，强度减弱，上皮细胞变性、死亡，细胞连接松散，基底细胞增生、迁移，PCNA表达的阳性细胞率明显升高，表现为细胞再生予以修复的变化。吸烟8周时，上皮细胞损伤减轻，细胞间连接形成，E-cd在上皮细胞膜上表达上调，而细胞增殖分化迁移，随之减少，PCNA阳性表达也明显下降，恢复到正常水平，表现为气道粘膜上皮处在修复后阶段。随着吸烟时间延长至12周时，E-cd表达再次下调，此时上皮细胞损伤程度加重，上皮细胞凋亡明显增加，而细胞增殖再生修复的能力减弱[5]。由此可见，E-cd与PCNA表达的变化，反映了吸烟引起气道上皮细胞损伤与修复的病变特征。
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Hanby在研究胃肠道上皮修复过程中，其粘膜上皮E-cd mRNA表达与正常相当，提示E-cd表达的下调主要发生在翻译或翻译后水平[4]。本实验原位杂交结果显示各组细支气管上皮细胞E-cd mRNA表达含量及强度均无明显变化，说明E-cd的表达变化仅发生于蛋白水平而非mRNA水平。近来研究表明E-cd有两种存在形式，即胞膜型和可溶型。在损伤和炎症的修复过程中，可能由于多种细胞因子的参与，使上皮细胞间E-cd/cat复合体及其核心细胞骨架蛋白发生酪氨酸磷酸化，使该复合体结构的完整性遭受破坏，E-cd不能定位于膜上，继而被胞浆内蛋白酶降解成可溶性片段，移入胞浆，丧失其粘附的功能[6]，此时胞浆内可溶性E-cd及β-cat水平升高，胞膜上E-cd表达下降。游离的β-cat可与APC或EGF受体相结合，有利于增殖信号的传导[7,8]。从而控制相关蛋白的酪氨酸磷酸化，调节E-cd表达和分布，可减轻上皮细胞损伤，有利于其细胞再生修复。
吸烟引起呼吸道上皮细胞损伤与修复的病变是机体适应性自身调节过程，随着病变的反复发作，气道炎症加重，损伤与修复动态平衡破坏，导致不可逆气道损害。所以进一步研究吸烟引起呼吸道上皮细胞E-cd与其复合体表达与调控，对阐明COPD各阶段气道屏障功能丧失的发生机制，逆转病变的进展具有重要意义。
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* 国家自然科学基金资助项目(No.39570288)
作者简介:吴人亮，男，1943年生，教授
参考文献
1 王曦, 李军, 吴人亮. 上皮钙粘附素-连环素复合体功能调控的研究进展. 国外医学分子生物学分册, 1998, 20(1): 42
2 吴人亮, 李文英, 车东媛等. 吸烟对小鼠小气道损伤的形态学研究. 同济医科大学学报, 1995, 24(5): 395
3 王曦, 吴人亮, 郝春荣等. 吸烟小鼠呼吸道上皮细胞上皮钙粘附素表达的研究. 中国组织化学与细胞化学杂志, 1998, 7(3): 302
4 Hanby A M, Chinery R, Porlsom R et al. Down regulation of E-cadherin in the reparative epithelium of the human gastrointestinal tract. Am J Pathol, 1996, 148: 723
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5 吴人亮, 郝春荣, 许三林等. 吸烟小鼠呼吸道上皮凋亡与增殖的关系. 同济医科大学学报, 1999, 28(2):104
6 Daniel J M, Reynolds A B. Tyrosine phosphorylation and cadherin/catenin function. Bioessays, 1997, 19: 883
7 Hulsken J, Birchmeier W, Behrens J. E-cadherin and APC compete for the interraction with β-catenin and the cytoskeletion. J Cell Biol, 1996, 127: 2061
8 Hinck L, Nathke I S, Papkoff J et al. Dynanies of cadherin/catenin complex formation: Novel protein interactions and pathways of complex assembly. J Cell Biol, 1994, 125: 1327
(1998-12-25 收稿), 百拇医药