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编号:10497273
腺病毒-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗载体的构建及鉴定*
http://www.100md.com 《同济大学学报(医学版)》 1999年第3期
     作者:卢运萍 王世安 周剑峰 王世宣 马丁

    单位:同济医科大学附属同济医院妇产科,武汉 430030 王世宣 马丁 卢运萍;长江航运总医院肿瘤科,武汉 430010 王世安;同济医科大学附属同济医院血液科,武汉 430030 周剑峰

    关键词:腺病毒;胸苷激酶基因;肿瘤

    同济医科大学学报990307 摘要 对腺病毒-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(ADV-HSV-TK)治疗载体进行构建与鉴定。利用脂质体介导的共转染,将质粒PJM17与FPA/TK-RSV共转染入293细胞系,利用挑取单噬斑,获取单克隆的重组腺病毒,并在293细胞系中进行扩增、纯化。经PCR、DNA测序,酶切鉴定,用空斑实验(plaque assay)测定,分析病毒的活性。结果:重组病毒经PCR测序证实已携带TK片段,酶切鉴定出现特异性的酶切图谱,重组病毒具高滴度的感染活性。结论:ADV-TK基因的构建为HSV-TK基因的临床应用提供了更为有效的手段。
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    Construction and Identification of Adenovirus-Herpes Simplex Virus

    Thymidine Kinase Genes Therapy Vectors

    Lu Yunping1 , Wang Shian2 , Zhou Jianfeng3 et al

    1 Department of Gynecology and Obstetrics,Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

    2 Department of Cancer, Yangtze River Shipping General Hospital , Wuhan 430010
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    3 Department of Hematology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

    Abstract Adenovirus vectors encoding herpes symplex virus thymiodine kinase (HSV-TK) genes were constructed and identified. PJM17 and PFA/TK-RSV plasmid were co-transfected into 293 cell line to produce recombinant adeno-virus vectors encoding HSV-TK (ADV-TK). After picking up a single plaque, clonal ADV-TK was amplified and purified. After PCR, DNA sequencing, DNA digest were applied to confirm the insertion of TK into ADV vectors. Plaque assay was used to cletermine the titration of ADV-TK. Results showed that recombinant virus was confirmed to contain TK fragment, and the digested fragments were in a specific electrophoresis pattern. ADV-TK had high titers of virus. It was concluded that the successful development of ADV-TK provided a safer, more effective strategy for clinical application of HSV-TK as an anti-tumor agent.
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    Key words adenovirus; thymidine kinase genes; tumor

    近年来,肿瘤的基因治疗作为一种新的治疗策略已愈来愈引起研究者的关注,并已由实验室研究逐渐进入临床实际应用。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)治疗是目前最有成效的一种新的治疗方法,部分临床Ⅰ 期和Ⅱ 期实验资料已经证实HSV-TK基因具有较好的临床疗效[ 1 , 2 ]

    HSV-TK基因通过转化抗病毒药更昔洛韦、阿昔洛韦形成有毒的二磷酯代谢产物,干扰转入TK的肿瘤细胞DNA的合成而使肿瘤细胞自发死亡[3]。1992年美国国立研究院重组DNA技术顾问委员会(RAC)通过HSV-TK逆转录病毒基因治疗脑肿瘤临床方案[ 4 ],表明HSV-TK可能在较短期内成为有效的肿瘤临床治疗方案。为了使HSV-TK基因治疗方法更为安全、有效,我们在本实验中构建了由腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (ADV-HSV-TK) 基因治疗载体,并加以鉴定。现将结果报告如下。
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    1 材料与方法

    1.1 材料

    PJM17辅助质粒购自Quantum (Canada)公司,293细胞系、单纯疱疹病毒Ⅰ型购自美国典型生物物种保藏中心(ATCC),PXCJ1.1 购自Strateqenl (USA),RSV-CTR Quickqenl (USA) ,DNA提取纯化试剂盒、琼脂糖DNA回收试剂盒、质粒纯化试剂盒均购自QUIGEN(德国),BamHⅠ Hind Ⅲ、Superscript逆转录酶购自Gibco (USA),所有引物均由Integrated DNA Technologies Inc (Canada)合成。

    1. 2 方法

    1.2.1 RT-PCR合成全长HSV-TK片段:用氯化铯(CsCl2)超速离心法提取HSV-TK基因 总RNA,Radom 引物合成cDNA第一链,在HSV-TK cDNA的5'-UTR和3'-UTR设计引物全长为2.86 kb的cDNA 片段,电泳分离酶切回收后,用PCR克隆试剂盒连接PCR片段,扩增后插入含RSV-LTR的PS-Veo质粒,进行质粒的酶切、鉴定,筛选后得到BamHⅠ酶切片段RSV-LTR-HSV-TK,全长3400 bp。
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    1.2.2 目的质粒和辅助质粒PJM17: 目的质粒由PXCJL1用XbaⅠ、 BamHⅠ 切开后,插入 RSV-LTR-HSV-TK产生,命名为PFA/TK-RVS,经质粒转化、鉴定、筛选、扩增后备用。以同法获取PJM17质粒。

    1.2.3 病毒噬斑(plaque)的产生及挑取:将PJM17与PFA/TK-RSV用脂质体共转染293细胞系,转染后换用DMEM,10 ml/L HCS 继续培养4~6周,当细胞出现病毒感染效应后,液氮酒精37 ℃水浴3次裂解细胞,离心收集上清,将储存的病毒上清按照10-3~10-9滴度倍比稀释,用于感染80% 融合的293细胞2 h后,吸去感染液,加入完全培养基(13 g /L琼脂糖,2×DMEM,20万U/ L 青霉素, 100 mg/L链霉素,30 mg/L酚红),每皿6 ml,在室温下凝固后,置37 ℃二氧化碳培养箱,7~10 d后,当细胞出现病毒感染效应后,用吸管在倒置显微镜下小心吸出单个噬斑,移入2 ml DMEM,经过3次速冻,水浴解冻循环,使病毒自琼脂糖中释出,将此液体再次感染293细胞,7~8 d以后,收集有病毒感染效应的培养皿,提取病毒DNA用于鉴定,其余培养皿储存于-80 ℃备用。
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    1.2.4 重组DNA鉴定:用QiAGEN基因组DNA提取试剂盒,提取293细胞中的重组病毒DNA,进行PCR扩增,上游引物5'-ATG GCT TCG TAC CCC T G-3',下游引物5'-ACA CGT TAT TTA CCC TGT-3',扩增片段为TK cDNA的872 bp片段,经琼脂糖电泳分离后,用QiAGEN Gel回收纯化试剂盒回收PCR产物,经自动测序仪行DNA测序,在Genbank于HSV-TK的cDNA序列对照比较。

    1.2.5 重组DNA载体的酶切鉴定:QiAGEN基因组DNA提取试剂盒,提取重组病毒DNA后,分别用BamH I和Hind Ⅱ酶切1μg病毒DNA,电泳检测特异性的插入目的片段和载体酶切片段。

    1.2.6 病毒的扩增、纯化、效价测定:用储存病毒感染上清反复感染100 mm培养皿90%融和的293细胞,共100 皿,收集裂解细胞。经氯化铯超速离心,获取纯化病毒。用空斑实验(plaque assays)测定病毒效价。将待测病毒以10-3~10-12的倍比稀释为12管,感染293细胞,2 h后加入13 g/L 琼脂糖,2×DMEM,20 万 U/L青霉素, 100 mg/L链霉素,50 g/L酵母提取物,1×HEPES缓冲液1 ml作为完全培养基,10 d后,用中性红染色计算噬斑形成单位(pfu)。噬斑形成单位(pfu/ml)=(两复孔的平均噬斑数×倍比稀释数)/ 0.5。
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    2 结果

    2.1 共转染质粒PJM17、PFA /TK-RSV的获取、克隆、扩增

    用HSV-TK 的总RNA经逆转录反应,PCR扩增产生2800 kb的全长TK cDNA片段,用PCR克隆试剂盒连接后转入大肠杆菌DH5α,经筛选鉴定后,大量扩增TK片段,插入含RSV-CTR的psevo质粒,再扩增,酶切后,得到3400 bp的RSV-CTR-HSV-TK片段,用BamHⅠ 、Xba I酶切回收PXCJL 1,回收进行连接反应,得到PFA/TK-RSV质粒,经DH5α转化,大量扩增。PJM17质粒片段为40.3 kb。扩增回收纯化时容易产生剪切,影响了DNA质量,用QiAGEN质粒提取、纯化试剂盒,而得到较理想的质粒。

    2.2 重组病毒的产生

    将PJM17、PFA/TK-RSV共转染293细胞后,至4~6周,293细胞变圆,折光变亮。3~5 d后,293细胞脱壁漂浮,这是病毒感染效应的特征性变化,表明同源重组后,已有重组的腺病毒产生。
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    2. 3 重组病毒的鉴定

    2.3.1 PCR鉴定:如图1所示,从293细胞提取病毒DNA后,PCR扩增出预期的872 bp的TK cDNA片段,表明重组腺病毒中携带HSV-TK的编码基因,收集此PCR产物。DNA测序结果与HSV-TK的cDNA序列完全吻合(DNA测序图谱略),进一步证实重组ADV中携带HSV-TK cDNA。

    图1 PCR鉴定:扩增出预期的972 bp的TK cDNA片段,表明重组腺病毒中携带HSV-TK的编码基因A:DNA分子量标准;B:提取DNA扩增后

    图2 酶切鉴定:重组腺病毒DNA经BamHⅠ酶切后,产生3个片断,符合ADV载体长度A:DNA分子量标准;B:重组腺病毒DNA经BamHⅠ酶切
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    图3 用Hind Ⅲ酶切后与PJM17的酶切特征吻合,证明载体的构建是成功的A:DNA分子量标准;D:用Hind Ⅲ酶切后

    2.3.2 酶切鉴定:如图2所示,重组腺病毒DNA经BamH I酶切以后,产生3 个片段,其中3900 bp 片段与RSV-CTR-HSV-TK片段长度吻合,因为Xba I和BamH I为匹配酶,所以产生的DNA片段略长于3400 bp,其余两片段总长度为20~25 kb,符合ADV载体长度。用Hind Ⅲ 酶切后则产生6个长度为12~8 kb的DNA片段(图3),与PJM17的酶切特征吻合[5],证明载体的构建是成功的。

    2.4 单克隆重组ADV-TK 纯化、扩增、效价的测定

    用单噬斑感染100 mm×100 mm 293 细胞,裂解细胞,超速离心,18 h后出现一层蓬松的云雾状漂浮层,此即为纯化后的ADV-TK,吸出后储存于-80 ℃。取部分进行病毒效价测定,其效价为1013 pfu/ml,表明构建的ADV-TK病毒具有高滴度的活性和病毒感染效应。
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    3 讨论

    目前单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因已经成为最具有发展潜力的肿瘤基因治疗基因。TK基因治疗肿瘤的基本原理:(1)“自杀效应”。TK可代谢无毒的抗病毒药物更昔洛韦(GCV)使之成为细胞毒性产物,干扰DNA合成,使肿瘤细胞自发死亡。(2)“旁观者效应”(by-stander effect)。即便仅有10%的肿瘤细胞转入TK基因,当加入GCV后,其余90%的肿瘤细胞由于细胞间的缝隙连接和信号传递也将被杀死。“旁观者效应”极大地提高了TK基因抗肿瘤活性,使TK基因制剂实际应用于临床治疗恶性肿瘤成为可能[3]

    HSV-TK 以其确切的抗肿瘤活性及生物学优点,成为基因治疗领域的主要研究制剂之一[ 6 ],迄今不但有大量的实验性肿瘤治疗报告其良好疗效,临床报告也陆续显示其良好的治疗价值。但HSV-TK应用于临床受到一些技术实施上的限制,既往应用逆转录病毒在体外操作后,将基因工程细胞回输体内治疗脑肿瘤,技术要求和实施手段繁复,逆转录病毒作为基因治疗载体有诸多缺点等,如只对分裂期细胞有作用,病毒获取扩增困难,需要体外操作,随机整合有致癌危险等等,使HSV-TK的临床应用受到很大的限制[7]
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    ADV作为新一代基因治疗载体具有独特的优点。ADV是人类伴随病毒,在细胞内存在于染色体外,无随机整合危险,安全性好,毒性低。 感染效率高,对分裂、非分裂期细胞均可感染。ADV 生产简单,较易得到符合临床需要的病毒。 通过局部应用(如注射),可达治疗目的。基于以上种种优点,ADV使 HSV-TK广泛应用于临床成为可能。

    本实验中PJM17载体是构建 ADV 的常规辅助质粒,含有全长的Ⅴ型ADV基因组,经过修饰,在除Ela片段使其复制缺陷,而且其片段长度超过野生型ADV5的包装容量,使之在其转录时不能产生野生型的ADV5病毒。PFA / TK-RSV质粒经人工修饰,在目的基因RSV-LT-HSV-TK的两侧均为ADV5的同源序列 ,当其转染293细胞系后,PFA/TK-RSV质粒同源重组,产生ADV5-RSV-TK的重组DNA,经293细胞提供Ela复制原件,该重组DNA得以包装成完整的重组腺病毒颗粒,在293细胞内得以扩增。经过单噬斑筛选、扩增,我们获得了可供临床应用剂量(1011~1012 pfu/ml)的纯化重组ADV-TK病毒制剂。空斑实验表明,重组的ADV病毒颗粒具有很高的病毒活性。通过PCR 及DNA测序、酶切分析证实重组的腺病毒 DNA从载体结构到插入的HSV-TK片段均符合预期结果。表明ADV-TK的构建是成功的。
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    经过上述的技术流程步骤,我们获取了符合临床需要的重组ADV-TK病毒制剂,为HSV-TK的临床应用提供了有效简便的手段。我们将于近期对该制剂的毒理药效学、药动力学作进一步研究,积累临床前资料,为其进入Ⅰ期临床作进一步研究。

    * 湖北省科委资助项目(No. 830194)

    作者简介:卢运萍,女,1952年生,主管技师

    参考文献

    1 Bonini C, Ferrari G, Verzeletti F et al. HSV-TK gene transfer into donor lymphocytes for control of allogeneic graft-versus-leukemia. Science, 1997,276: 1719

    2 Sterman D H, Treat J, Lftzky loA et al. ADV-TK /GCV gene therapy in patients with localized malignancy: results of a phase I clinical trial in malignant mesothelioma. Human Gene Ther,1998,9:1083
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    3 Davis B M, Kol O N, Lee K et al. Current progress in the gene therapy of cancer. Cur Opin Oncol, 1996,8:499

    4 Stone R. Molecular surgery for brain tumors. Science, 1992,256:151

    5 Ruben M, Bacchettiss S, Graham F. Covalently closed circles of adenovirus 5 DNA. Nature,1983,301:172

    6 Singhal S, Kaiser L R. Cancer chemotherapy using suicide genes. Surg Oncol Clin N Am,1998,7:505

    7 Esandi M C, Van Someren M D, Vincent A J. Gene therapy of experimental malignant mesothelioma using adenovirus vectors encoding the HSV-TK gene. Gene Therapy, 1997,4:280

    (1999-01-14 收稿), http://www.100md.com