镁对脑缺血早期脑组织中谷氨酸及一氧化氮含量的影响
作者：邓学军 孙圣刚 童萼塘
单位：同济医科大学附属协和医院神经科，武汉 430022
关键词：硫酸镁；脑缺血；谷氨酸；一氧化氮；大鼠
同济医科大学学报990320 摘要 为研究镁在脑缺血早期对神经元保护作用的机制，用电凝法建立大鼠大脑中动脉缺血模型，在造模前给大鼠注射20 g/L硫酸镁，观察镁对脑组织中谷氨酸(Glu)及一氧化氮(NO)含量的影响。结果显示，高浓度镁可明显降低脑缺血皮质中Glu、NO含量，在缺血组Glu、NO的峰值浓度分别为9.87、44.97 nmol/g，而在加镁组两者浓度分别为7.68、33.92 nmol/g。提示：镁对脑缺血早期神经元的保护作用与其降低脑组织中Glu及NO含量有关。
Effects of Magnesium Sulfate on Nitric Oxide and Glutamate
, http://www.100md.com
Contents in Occlusion Cortex after Focal Cerebral Ischemia in Rats
Deng Xuejun, Sun Shenggang, Tong Etang
Department of Neurology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract To study the mechanism of protective role of Mg2+ on neurons in the early stage of focal cerebral ischemia, the model of focal cerebral ischemia was established by occluding the middle cerebral artary. Before ischemia, 20 g/L magnesium sulfate was injected intravenously into the rat to investigate the effect of Mg2+ on nitric oxide (NO) and glutamate (Glu) contents in occlusion cortex. The results demonstrated that high concentration of Mg2+ could obviously decrease the contents of NO and Glu in occlusion cortex. In ischemia group, the peak contents of Glu and NO were 9.87 nmol/g, 44.97 nmol/g respectively. In the Mg2+ treated group, the peak contents of Glu and NO were 7.68 nmol/g, 33.92 nmol/g respectively. The results suggested that the decerease of Glu and NO contents may contribute to the protective roles of Mg2+ in neurons in the early stage of cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words magnesium sulfate; cerebral ischemia; glutamate; nitric oxide; rat
近年来，文献报道脑缺血后细胞外谷氨酸(Glu)及一氧化氮(NO)含量急剧升高是造成神经元损害的重要原因。新近人们还发现，Mg2+对脑缺血后的神经元具有保护作用，但它是否通过改变脑组织中Glu及NO的含量而起作用尚不清楚。为此，我们应用大鼠大脑中动脉(MCA)缺血模型，在缺血前给大鼠注入20 g/L硫酸镁，观察Mg2+对脑组织中Glu及NO含量的影响，借以阐明脑缺血早期Mg2+保护神经元的可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物与模型制备
1.1.1大鼠MCA缺血模型制备：采用Kader法电凝左侧MCA制造局灶性脑缺血模型。
, 百拇医药
1.1.2 梗塞范围确定：应用TTC染色法。电凝MCA后，缝合肌肉、皮肤，大鼠在常规条件下存活24 h，然后断头取脑，经TTC染色后，可见MCA闭塞后其支配皮质(额叶、颞叶、顶叶)为白色，其它部位为红色(正式实验取白色区域内皮质检测)。
1.1.3 动物及分组：选择健康Sprague Dawley大鼠126只，雌雄不限，体重为220～250 g，由同济医科大学实验动物学部提供。大鼠随机分为3组；对照组30只，开颅但不电凝MCA；缺血组48只，开颅电凝MCA；加镁组48只，电凝MCA前经静脉注入20 g/L硫酸镁(500 mg/kg)。缺血组及加镁组缺血时间分别为5、10、20、30、45、60 min。缺血组及加镁组各时间点均为8只大鼠，对照组各时间点为5只大鼠。
1.2 操作步骤
大鼠麻醉固定后，电凝MCA，分别于缺血后5、10、20、30、45、60 min处死大鼠，取上述梗塞区域皮质，称湿重后置于液氮中快速冷却，再转移至-70 ℃冰箱中保存待测。分别用化学法、高效液相色谱仪(美国产)、原子吸收分光光度计(日本产)测量脑组织中NO、Glu及Mg2+含量。
, 百拇医药
1.3 统计学分析
数据用
±s表示，采用组间t检验。
2 结果
2.1 NO含量变化
3组6个时间点脑组织中NO含量变化见表1。从表中可见，缺血组与加镁组比较，在缺血5～10 min，NO含量有显著性差异(P<0.05)；缺血组在缺血20 min，NO含量达到高峰，而加镁组达到高峰时间为缺血30 min，二峰值含量比较有极显著性差异(P<0.01)。缺血45 min后，二组无显著性差异(P>0.05)。对照组各时间点NO含量无明显改变。
2.2 Glu含量变化
3组不同时间脑组织中Glu含量改变见表2。从表中可见脑缺血组缺血5 min，Glu含量开始上升，但与对照组相比差异无显著意义(P>0.05)，缺血10 min，Glu含量明显升高(P<0.05)，缺血30 min，Glu含量达到高峰，60 min降至正常。加镁组在缺血10～45 min Glu含量与缺血组相比差异有显著意义(P<0.01)。
, http://www.100md.com
表1 3组不同时间脑组织NO含量 (nmol/g) 组别
n
时 间 (min)
5
10
20
30
45
60
对照组
缺血组
加镁组
5
, http://www.100md.com
8
8
13.82±1.13
19.73±2.81△
14.42±1.63*
13.77±2.02
28.36±4.24△△
18.77±3.69△
14.04±0.70
44.97±6.91△△
, 百拇医药
24.66±4.03△△
13.86±1.41
37.74±4.10△
33.92±5.91△△
13.62±2.13
18.91±3.73△
19.17±2.45△
13.94±0.87
13.90±2.35
, http://www.100md.com 14.01±1.78
与缺血组比较 *P<0.05 **P<0.01； 与对照组比较 △P<0.05 △△P<0.01表2 3组不同时间脑组织Glu含量(nmol/g) 组别
n
时 间(min)
5
10
20
30
45
60
对照组
, http://www.100md.com 缺血组
加镁组
5
8
8
3.44±0.33
3.67±0.71
3.59±0.42
3.37±0.45
4.78±0.91△△
4.37±0.29△△
3.34±0.17
, 百拇医药
6.11±0.50△△
4.98±0.48△△
3.47±0.20
9.87±1.14△△
7.68±0.41△△
3.36±0.36
6.33±0.82△△
4.58±0.54△△
3.40±0.19
, 百拇医药
3.78±0.38
3.83±0.39
与缺血组比较 *P<0.05 **P<0.01； 与对照组比较 △P<0.05 △△P<0.012.3 Mg2+含量变化
3组不同时间脑组织中Mg2+含量变化见表3。从表中可见，脑缺血60 min内，缺血组Mg2+含量与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，加镁组Mg2+含量增高，与其它二组比较均有极显著性差异(均为P<0.01)。
表3 3组不同时间脑组织Mg2+含量(pmol/g) 组别
n
时 间 (min)
, 百拇医药
5
10
20
30
45
60
对照组
缺血组
加镁组
5
8
8
138.61±17.58
, http://www.100md.com 140.37±8.19
378.66±33.42**
140.36±10.76
141.13±9.65
410.60±17.19
143.11±22.30
147.74±18.39
382.31±17.60
138.55±8.70
133.34±13.25
, 百拇医药
400.03±37.09
140.67±9.45
138.91±9.36
391.03±19.24**
142.96±19.82
140.15±8.36
411.79±17.34**
与对照组及缺血组比较 **P<0.013 讨论
近年来，人们发现Glu和NO在脑缺血后神经元损害方面起着十分重要的作用，其含量与梗塞体积呈正相关[1]。
, 百拇医药
本研究发现，缺血组缺血60 min内，各时间点Mg2+含量与对照组均无显著性差异(P>0.05)，加镁组各时间点Mg2+含量显著增高，与缺血组、对照组比较均有极显著性差异(P<0.01)。加镁组与缺血组比较，在缺血5、10 min，NO含量明显下降，有显著性差异(P<0.05)；缺血组NO含量达到高峰时间为缺血20 min，而加镁组达到高峰时间为缺血30 min，较缺血组推迟了10 min，且二者相比有极显著性差异(P<0.01)。而在缺血45、60 min，二组比较无显著性差异(P>0.05)，说明Mg2+对NO含量的影响主要发生在NO过度合成时，对正常或轻度升高的NO含量无明显影响。Mg2+对脑缺血后NO含量的影响尚未见报道，我们推测，它对NO含量的影响主要通过抑制Ca2+内流，减少钙与钙调蛋白的结合，从而降低NOS活性。目前认为[2]，高浓度的Mg2+可以通过以下几种机制阻断Ca2+内流：①稳定细胞膜，减少Ca2+-Na+交换；②与Ca2+竞争结合位点；③阻断NMDA受体上钙通道开放。NMDA受体在正常情况下可被Mg2+阻断，当发生去极化时，Mg2+的阻断作用减小并最终消失，但高浓度Mg2+可延长对NMDA受体的阻断作用[3]。本实验加镁组NO含量下降，达到顶峰时间延长与此超长阻断作用有关。
, 百拇医药
本试验发现，高浓度Mg2+可明显降低缺血后Glu的释放。在缺血10～45 min，加镁组与缺血组比较，Glu含量明显减低，差异有显著意义(P<0.05)。高浓度Mg2+减少Glu含量的机制可能为：①阻断N型及T型Ca2+通道开放；②降低ATP消耗，减少胶质细胞释放Glu。Kass报道[4]，在离体大鼠海马CA1区缺氧10 min后，ATP水平降至正常水平的23%，若加入10 mmol Mg2+，ATP水平降至正常水平的36%。③高浓度Mg2+可降低细胞膜静息电位，减慢去极化时程，降低去极化程度，从而减少Glu释放。
Glu与NO关系密切，目前认为脑缺血后存在NMDA受体-Ca2+-NOS-NO径路，它在神经元损害中具有重要作用。Glu含量的增加可提高NO的含量，增加NO的毒性作用；同时NO也能介导Glu的毒性作用[5]。本实验静脉注入硫酸镁，降低了脑缺血后脑组织中Glu及NO含量，阻断NMDA受体-Ca2+-NOS-NO径路，从而达到保护缺血神经元作用。
, 百拇医药
镁剂治疗急性脑缺血病的疗效在临床中已得到证实，Murikov及Marinov均报道过相似结论[6，7]，且提出镁浓度愈高，神经元保护作用愈强。本试验结果为镁剂治疗脑缺血疾病提供了理论依据。
作者简介:邓学军，男，1965年生，主治医师
参考文献
1 李振州.脑缺血时Glu及抗Glu毒性研究进展.国外医学脑血管病分册，1995，3(4)：171
2 Johnson J, Ascher P. Voltage-depent blook by intracellular Mg2+ of NMDA-activated channels. Biophys J Biophysical Science, 1990,57:1085
, 百拇医药
3 Horoshi V C, Markgraf G. Glutamate antigonist MK-801 attenuate in complete but not complet infarction in thrombitic distal MCAO in wistar rats. Brain Res, 1994,644:117
4 Kass, A. Janes E, Corteu G. Magnesium and cobalt not nimodipine protect neurons against anoxia damage in rat hippocampal slice. Anesthesology, 1988,69:710
5 Toshiaki A, Dider H, Clander G. NO mediated the sustained opening NMDA-gated ionic channel which follows transient excitotoxic exposure in hippocampal slice. Brain Res, 1994,652:190
, 百拇医药
6 Murikov L. A randomized double blind placebo-controlled pilot trial of intravenous magnesium sulfate in acute stroke. Stroke, 1995,26:1183
7 Marinov K, Marin B, Harbangh S. Neuron protective effects of preischemia intraartarial Magnesium Sulfate in reversible focal cerebral ischemia. J Neurosurg, 1996,85:117
(1997-12-07 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院神经科，武汉 430022
关键词：硫酸镁；脑缺血；谷氨酸；一氧化氮；大鼠
同济医科大学学报990320 摘要 为研究镁在脑缺血早期对神经元保护作用的机制，用电凝法建立大鼠大脑中动脉缺血模型，在造模前给大鼠注射20 g/L硫酸镁，观察镁对脑组织中谷氨酸(Glu)及一氧化氮(NO)含量的影响。结果显示，高浓度镁可明显降低脑缺血皮质中Glu、NO含量，在缺血组Glu、NO的峰值浓度分别为9.87、44.97 nmol/g，而在加镁组两者浓度分别为7.68、33.92 nmol/g。提示：镁对脑缺血早期神经元的保护作用与其降低脑组织中Glu及NO含量有关。
Effects of Magnesium Sulfate on Nitric Oxide and Glutamate
, http://www.100md.com
Contents in Occlusion Cortex after Focal Cerebral Ischemia in Rats
Deng Xuejun, Sun Shenggang, Tong Etang
Department of Neurology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract To study the mechanism of protective role of Mg2+ on neurons in the early stage of focal cerebral ischemia, the model of focal cerebral ischemia was established by occluding the middle cerebral artary. Before ischemia, 20 g/L magnesium sulfate was injected intravenously into the rat to investigate the effect of Mg2+ on nitric oxide (NO) and glutamate (Glu) contents in occlusion cortex. The results demonstrated that high concentration of Mg2+ could obviously decrease the contents of NO and Glu in occlusion cortex. In ischemia group, the peak contents of Glu and NO were 9.87 nmol/g, 44.97 nmol/g respectively. In the Mg2+ treated group, the peak contents of Glu and NO were 7.68 nmol/g, 33.92 nmol/g respectively. The results suggested that the decerease of Glu and NO contents may contribute to the protective roles of Mg2+ in neurons in the early stage of cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words magnesium sulfate; cerebral ischemia; glutamate; nitric oxide; rat
近年来，文献报道脑缺血后细胞外谷氨酸(Glu)及一氧化氮(NO)含量急剧升高是造成神经元损害的重要原因。新近人们还发现，Mg2+对脑缺血后的神经元具有保护作用，但它是否通过改变脑组织中Glu及NO的含量而起作用尚不清楚。为此，我们应用大鼠大脑中动脉(MCA)缺血模型，在缺血前给大鼠注入20 g/L硫酸镁，观察Mg2+对脑组织中Glu及NO含量的影响，借以阐明脑缺血早期Mg2+保护神经元的可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物与模型制备
1.1.1大鼠MCA缺血模型制备：采用Kader法电凝左侧MCA制造局灶性脑缺血模型。
, 百拇医药
1.1.2 梗塞范围确定：应用TTC染色法。电凝MCA后，缝合肌肉、皮肤，大鼠在常规条件下存活24 h，然后断头取脑，经TTC染色后，可见MCA闭塞后其支配皮质(额叶、颞叶、顶叶)为白色，其它部位为红色(正式实验取白色区域内皮质检测)。
1.1.3 动物及分组：选择健康Sprague Dawley大鼠126只，雌雄不限，体重为220～250 g，由同济医科大学实验动物学部提供。大鼠随机分为3组；对照组30只，开颅但不电凝MCA；缺血组48只，开颅电凝MCA；加镁组48只，电凝MCA前经静脉注入20 g/L硫酸镁(500 mg/kg)。缺血组及加镁组缺血时间分别为5、10、20、30、45、60 min。缺血组及加镁组各时间点均为8只大鼠，对照组各时间点为5只大鼠。
1.2 操作步骤
大鼠麻醉固定后，电凝MCA，分别于缺血后5、10、20、30、45、60 min处死大鼠，取上述梗塞区域皮质，称湿重后置于液氮中快速冷却，再转移至-70 ℃冰箱中保存待测。分别用化学法、高效液相色谱仪(美国产)、原子吸收分光光度计(日本产)测量脑组织中NO、Glu及Mg2+含量。
, 百拇医药
1.3 统计学分析
数据用
±s表示，采用组间t检验。2 结果
2.1 NO含量变化
3组6个时间点脑组织中NO含量变化见表1。从表中可见，缺血组与加镁组比较，在缺血5～10 min，NO含量有显著性差异(P<0.05)；缺血组在缺血20 min，NO含量达到高峰，而加镁组达到高峰时间为缺血30 min，二峰值含量比较有极显著性差异(P<0.01)。缺血45 min后，二组无显著性差异(P>0.05)。对照组各时间点NO含量无明显改变。
2.2 Glu含量变化
3组不同时间脑组织中Glu含量改变见表2。从表中可见脑缺血组缺血5 min，Glu含量开始上升，但与对照组相比差异无显著意义(P>0.05)，缺血10 min，Glu含量明显升高(P<0.05)，缺血30 min，Glu含量达到高峰，60 min降至正常。加镁组在缺血10～45 min Glu含量与缺血组相比差异有显著意义(P<0.01)。
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表1 3组不同时间脑组织NO含量 (nmol/g) 组别
n
时 间 (min)
5
10
20
30
45
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对照组
缺血组
加镁组
5
, http://www.100md.com
8
8
13.82±1.13
19.73±2.81△
14.42±1.63*
13.77±2.02
28.36±4.24△△
18.77±3.69△
14.04±0.70
44.97±6.91△△
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24.66±4.03△△
13.86±1.41
37.74±4.10△
33.92±5.91△△
13.62±2.13
18.91±3.73△
19.17±2.45△
13.94±0.87
13.90±2.35
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与缺血组比较 *P<0.05 **P<0.01； 与对照组比较 △P<0.05 △△P<0.01表2 3组不同时间脑组织Glu含量(nmol/g) 组别
n
时 间(min)
5
10
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对照组
, http://www.100md.com 缺血组
加镁组
5
8
8
3.44±0.33
3.67±0.71
3.59±0.42
3.37±0.45
4.78±0.91△△
4.37±0.29△△
3.34±0.17
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6.11±0.50△△
4.98±0.48△△
3.47±0.20
9.87±1.14△△
7.68±0.41△△
3.36±0.36
6.33±0.82△△
4.58±0.54△△
3.40±0.19
, 百拇医药
3.78±0.38
3.83±0.39
与缺血组比较 *P<0.05 **P<0.01； 与对照组比较 △P<0.05 △△P<0.012.3 Mg2+含量变化
3组不同时间脑组织中Mg2+含量变化见表3。从表中可见，脑缺血60 min内，缺血组Mg2+含量与对照组比较无显著性差异(P>0.05)，加镁组Mg2+含量增高，与其它二组比较均有极显著性差异(均为P<0.01)。
表3 3组不同时间脑组织Mg2+含量(pmol/g) 组别
n
时 间 (min)
, 百拇医药
5
10
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对照组
缺血组
加镁组
5
8
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138.61±17.58
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378.66±33.42**
140.36±10.76
141.13±9.65
410.60±17.19
143.11±22.30
147.74±18.39
382.31±17.60
138.55±8.70
133.34±13.25
, 百拇医药
400.03±37.09
140.67±9.45
138.91±9.36
391.03±19.24**
142.96±19.82
140.15±8.36
411.79±17.34**
与对照组及缺血组比较 **P<0.013 讨论
近年来，人们发现Glu和NO在脑缺血后神经元损害方面起着十分重要的作用，其含量与梗塞体积呈正相关[1]。
, 百拇医药
本研究发现，缺血组缺血60 min内，各时间点Mg2+含量与对照组均无显著性差异(P>0.05)，加镁组各时间点Mg2+含量显著增高，与缺血组、对照组比较均有极显著性差异(P<0.01)。加镁组与缺血组比较，在缺血5、10 min，NO含量明显下降，有显著性差异(P<0.05)；缺血组NO含量达到高峰时间为缺血20 min，而加镁组达到高峰时间为缺血30 min，较缺血组推迟了10 min，且二者相比有极显著性差异(P<0.01)。而在缺血45、60 min，二组比较无显著性差异(P>0.05)，说明Mg2+对NO含量的影响主要发生在NO过度合成时，对正常或轻度升高的NO含量无明显影响。Mg2+对脑缺血后NO含量的影响尚未见报道，我们推测，它对NO含量的影响主要通过抑制Ca2+内流，减少钙与钙调蛋白的结合，从而降低NOS活性。目前认为[2]，高浓度的Mg2+可以通过以下几种机制阻断Ca2+内流：①稳定细胞膜，减少Ca2+-Na+交换；②与Ca2+竞争结合位点；③阻断NMDA受体上钙通道开放。NMDA受体在正常情况下可被Mg2+阻断，当发生去极化时，Mg2+的阻断作用减小并最终消失，但高浓度Mg2+可延长对NMDA受体的阻断作用[3]。本实验加镁组NO含量下降，达到顶峰时间延长与此超长阻断作用有关。
, 百拇医药
本试验发现，高浓度Mg2+可明显降低缺血后Glu的释放。在缺血10～45 min，加镁组与缺血组比较，Glu含量明显减低，差异有显著意义(P<0.05)。高浓度Mg2+减少Glu含量的机制可能为：①阻断N型及T型Ca2+通道开放；②降低ATP消耗，减少胶质细胞释放Glu。Kass报道[4]，在离体大鼠海马CA1区缺氧10 min后，ATP水平降至正常水平的23%，若加入10 mmol Mg2+，ATP水平降至正常水平的36%。③高浓度Mg2+可降低细胞膜静息电位，减慢去极化时程，降低去极化程度，从而减少Glu释放。
Glu与NO关系密切，目前认为脑缺血后存在NMDA受体-Ca2+-NOS-NO径路，它在神经元损害中具有重要作用。Glu含量的增加可提高NO的含量，增加NO的毒性作用；同时NO也能介导Glu的毒性作用[5]。本实验静脉注入硫酸镁，降低了脑缺血后脑组织中Glu及NO含量，阻断NMDA受体-Ca2+-NOS-NO径路，从而达到保护缺血神经元作用。
, 百拇医药
镁剂治疗急性脑缺血病的疗效在临床中已得到证实，Murikov及Marinov均报道过相似结论[6，7]，且提出镁浓度愈高，神经元保护作用愈强。本试验结果为镁剂治疗脑缺血疾病提供了理论依据。
作者简介:邓学军，男，1965年生，主治医师
参考文献
1 李振州.脑缺血时Glu及抗Glu毒性研究进展.国外医学脑血管病分册，1995，3(4)：171
2 Johnson J, Ascher P. Voltage-depent blook by intracellular Mg2+ of NMDA-activated channels. Biophys J Biophysical Science, 1990,57:1085
, 百拇医药
3 Horoshi V C, Markgraf G. Glutamate antigonist MK-801 attenuate in complete but not complet infarction in thrombitic distal MCAO in wistar rats. Brain Res, 1994,644:117
4 Kass, A. Janes E, Corteu G. Magnesium and cobalt not nimodipine protect neurons against anoxia damage in rat hippocampal slice. Anesthesology, 1988,69:710
5 Toshiaki A, Dider H, Clander G. NO mediated the sustained opening NMDA-gated ionic channel which follows transient excitotoxic exposure in hippocampal slice. Brain Res, 1994,652:190
, 百拇医药
6 Murikov L. A randomized double blind placebo-controlled pilot trial of intravenous magnesium sulfate in acute stroke. Stroke, 1995,26:1183
7 Marinov K, Marin B, Harbangh S. Neuron protective effects of preischemia intraartarial Magnesium Sulfate in reversible focal cerebral ischemia. J Neurosurg, 1996,85:117
(1997-12-07 收稿), 百拇医药