蛋白磷酸酶抑制剂对人成神经细胞瘤细胞钙瞬态的影响
作者：夏若寒 刘声远 王建枝
单位：同济医科大学基础医学院病理生理学教研室，武汉 430030
关键词：蛋白磷酸酶；成神经细胞瘤细胞；钙瞬态
同济医科大学学报990304 摘要 应用荧光倒置显微镜系统，分别检测了蛋白磷酸酶PP-2A和PP-1 抑制剂岗田酸(Okadaic acid，OA)和PP-2B抑制剂三氟吡拉嗪(Trifluoperazine, Tri)处理的人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)胞浆钙瞬态变化。结果发现：1 nmol/L OA抑制PP-2A时，胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)瞬时波动明显增强，[Ca2+]i 在20 min内逐步轻微升高，后逐渐回复; 而用100 nmol/L OA同时抑制PP-2A和PP-1时，则引起[Ca2+]i 即刻持续升高，并同时伴有[Ca2+]i 瞬时波动明显增强；用100 μmol/L Tri抑制PP-2B时，则引起[Ca2+]i 即刻持续升高，[Ca2+]i 瞬时波动没有明显变化。提示：蛋白磷酸酶降低可能通过钙瞬态变化而参与Alzheimer病(AD)的发病过程。
, 百拇医药
Effects of Protein Phosphatase Inhibitor on Calcium Transient in Neuroblastoma Cells
Xia Ruohan, Liu Shengyuan，Wang Jianzhi
Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract The effects of protein phosphatase PP-2A and PP-1 inhibitor-okadaic acid (OA) and PP-2B(calcineurin) inhibitor-trifluoperazine (Tri) on calcium transient in neuroblastoma cells (SH-SY5Y) were investigated under the fluorescence inverted microscopy. The results indicated that the [Ca2+]i was slightly increased in 20 min and then gradually returned to baseline level by incubating with 1 nmol/L OA which inhibited only PP-2A. However, a rapid and steady increase of [Ca2+]i was observed both when PP-2A and PP-1 were inhibited by 100 nmol/L OA or when PP-2B by 100 μmol/L Tri. Moreover, OA both with 1 nmol/L and 100 nmol/L could enhance instantaneous calcium fluctuation. The data suggested that an impaired protein phosphatase system might paticipate in AD pathogenesis by an alternative calcium transient pathway.
, 百拇医药
Key words protein phosphatase; neuroblastoma; calcium transient
神经细胞内神经原纤维缠结(NFT)是Alzheimer病(AD)特征性脑病理改变之一。应用电子显微镜和免疫生化技术研究结果表明，NFT的主要成分是异常磷酸化和异常糖基化的微管相关蛋白tau 聚集而成的双螺旋丝(PHF)结构[1,2]，tau 蛋白的异常磷酸化可能与蛋白激酶和蛋白磷酸酶系统调节失衡有关[3]。大量研究证明蛋白磷酸酶的降低直接参与AD 的发病过程[4,5]。Ca2+是介导神经细胞信号传导的重要第二信使之一，钙瞬态(calcium transient)是指胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的瞬时升高与回降，它是调节神经递质的释放和神经元的兴奋性的中心环节，还与神经元内蛋白质磷酸化等神经原代谢活动有关。本研究用磷酸酶抑制剂复制AD样蛋白磷酸酶降低的细胞模型，并探讨磷酸酶降低与钙瞬态的变化的关系，以期为AD发病机制提供理论依据 。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 培养液、试剂和药品
培养基DMEM/F12 、胎牛血清(FBS)、Okadaic Acid(OA)均购自Gibco公司，Fura-2/AM 、三氟吡拉嗪(trifluoperazine,Tri)、HEPES购自Sigma公司。
1.2 细胞培养
人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)贴壁生长细胞株由June L.Biedler(Sloan Kettering Institute, NY, USA)提供。细胞用含50 ml/L FBS、青霉素10万U/L和链霉素0.1 g/L的DMEM/F12培养基在37 ℃、5% CO2条件下进行培养,定期换置。待细胞80%融合，用滴管轻轻吹打，悬起细胞，以1×105/ml密度接种于放置有L-多聚赖氨酸预处理的盖玻片小培养皿中培养24 h，更换无血清DMEM/F12培养基准备用于实验。
, 百拇医药
1. 3 Fura-2负载
在实验细胞的培养基中加入Fura-2/AM应用液，使终浓度为5 μmol/L,37 ℃孵育40 min。负载后用测Ca2+缓冲液将生长有细胞的小盖玻片漂洗3次。测Ca2+缓冲液组成成分(nmol/L)：NaCl 145, KCl 5.0, CaCl2 1.3, Na2HPO4 1.0, HEPES 10,glucose 10, pH 7.4。
1.4 单个细胞胞浆游离钙测定
参照文献[6]的方法，将负载好的小盖玻片放入37 ℃含0.5 ml测[Ca2+]i缓冲液的特制平皿中，在荧光倒置显微镜系统上检测荧光强度。该系统主要由一个Zeiss倒置显微镜Axiovert 100和MacQudra 650计算机(TILL Photonics制造)控制提供340 nm或380 nm激发光的monochromator组成，荧光信号通过photomultiplier收集并转化为电压信号值记录入光盘。以公式 [Ca2+]i=Keff(R-R0)/(R-Ri)为基础，用HEKA公司的X-CHART软件计算出[Ca2+]i值并绘制[Ca2+]i变化图。式中Keff、Ri、R0均为固定值，R为荧光比值F340/F380。细胞先记录正常水平约2 min后分别向平皿中加入不同的蛋白磷酸酶抑制剂(1 nmol/L OA,100 nmol/L OA,100 μmol/L Tri)，再连续观测约0.5 h。实验重复10次，统计处理采用加药前后数据配对t检验，本文图所显示结果为重复实验的代表性资料。
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2 实验结果
2.1 OA对[Ca2+]i的影响
不同的细胞正常[Ca2+]i值差别很大,我们测得正常[Ca2+]i的平均值一般都在80～200 nmol/L之内，[Ca2+]i在没有任何刺激因素作用下可以较长时间内稳定地在一个正常值附近波动(附图A)；用1 nmol/L OA处理细胞(单纯抑制PP-2A)可使 [Ca2+]i瞬时波动从(41.3±9.4) nmol/L增强至(64.8±13.2) nmol/L(P<0.05)，[Ca2+]i 值均在20 min内从(152.6±45.3) nmol/L轻度升高至一小峰值(209.2±60.7) nmol/L(P<0.05),后逐渐回复(附图B)；当用100 nmol/L OA同时抑制PP-2A和PP-1可引起[Ca2+]i从正常值(148.3±44.7) nmol/L很快持续升高，30 min时达(296.3±73.2) nmol/L(P<0.01)，并且[Ca2+]i瞬时波动从(39.5±8.3) nmol/L增强至(67.2±12.9) nmol/L(P<0.05)(附图C)。
, 百拇医药
2.2 Tri对[Ca2+]i的影响
100 μmol/L Tri抑制PP-2B，[Ca2+]i从正常值(155.6±50.4) nmol/L很快持续升高，30 min时达(280.3±84.5) nmol/L(P<0.01),但并不改变[Ca2+]i瞬时波动(P>0.05)(附图D)。
附图 岗田酸(OA)和氟吡拉嗪(Tri)对成神经细胞瘤细胞钙瞬态的影响
A：正常钙变化；B：1 nmol/L OA引起钙变化；C：100 nmol/L OA引起钙变化；D：100 μmol/L Tri引起钙变化
, 百拇医药
3 讨论
根据AD患者脑组织抽提液中tau蛋白磷酸酶活性比对照者低[4]，以及PP-2A、PP-1和PP-2B可在体外使tau蛋白特定位点去磷酸化的研究结果[7]，推测AD患者tau蛋白的异常磷酸化与上述蛋白磷酸酶的降低有关。因此，通过抑制PP-2A、PP-1和PP-2B来复制AD神经原纤维变性实验模型具有重要意义。根据厂家说明书提供的研究资料，抑制PP-2A和PP-1所需OA浓度分别为1 nmol/L和100 nmol/L，此外，Gong等用纯化的AD 易溶型异常磷酸化的tau 蛋白作底物，完全抑制PP-2B所需Tri的浓度为100 μmol/L[5]，因此，上述浓度分别作为我们选用OA和Tri实验剂量的依据。本研究结果表明：抑制蛋白磷酸酶PP-1和PP-2B 均可导致SH-SY5Y细胞[Ca2+]i 显著升高；单纯抑制PP-2A与同时抑制PP-2A和PP-1 均可引起[Ca2+]i 瞬时波动明显增强。结果提示：AD患者神经细胞多种蛋白磷酸酶降低可能通过钙稳态失衡而导致其神经原纤维变性。
, 百拇医药
神经元把细胞内Ca2+浓度的快速升高和降低(瞬态)作为调节信息来完成信号转导过程[8]，细胞膜内外的Ca2+ 浓度梯度的维持主要依赖细胞膜表面的两种蛋白，即Na+-Ca2+ 交换蛋白和ATP驱动的质膜钙泵。此外，内质网ATP-依赖钙泵把钙浓集入内质网内作为细胞内钙储库。胞内钙浓度增高可由外钙内流和储钙释放引起。我们实验中通过抑制PP-2A、PP-1和PP-2B而引起[Ca2+]i 很快升高的机制尚需更深入的研究加以阐明。
* 国家教委优秀年轻教师基金资助项目
作者简介:夏若寒，男，1968年生，讲师
参考文献
1 Wang J Z, Gong C X, Zaidi T et al. Dephosphorylation of Alzheimer paired helical filaments by PP-2A and PP-2B. J Biol Chem, 1995，270:485
, 百拇医药
2 Wang J Z, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Glycosylation of microtuble associated protein tau: an abnormal posttanslational modification in Alzheimer disease. Nature Med,1996，2:871
3 Iqbal K, Gong C X, Wang J Z et al. Tau phosphatases in brain microtubule associated proteins: Modifications and diseases. New York: Harwood Academic Publishers, 1997.95～111
4 Gong C X, Shaikh S, Wang J Z et al. Phosphatase activity towards abnormally phosphorylated tau: decrease in Alzheimer disease brain. J Neurochem, 1995,65:732
, http://www.100md.com
5 Gong C X, Shaikh S, Grundke-Iqbal I et al. Inhibition of PP-2B(calcineurin) activity towards Alzheimer abnormally phosphorylated tau by neuroleptics. Brain Res, 1996,741:95
6 Xu T, Liu N J. Simultaneous measurement of membrane ion channel currents and intracellular free calcium concentration. J Wuhan Univ(Natural Science Edition), 1995,2:24
7 Wang J Z, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Dephosphorylation of Alzheimer soluble abnormally phosphorylated tau by PP-2A, PP-2B and PP-1. Mol Brain Res, 1996,38:200
8 陈宜张. 分子神经生物学. 北京：人民军医出版社,1995.201～208
(1998-12-21 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院病理生理学教研室，武汉 430030
关键词：蛋白磷酸酶；成神经细胞瘤细胞；钙瞬态
同济医科大学学报990304 摘要 应用荧光倒置显微镜系统，分别检测了蛋白磷酸酶PP-2A和PP-1 抑制剂岗田酸(Okadaic acid，OA)和PP-2B抑制剂三氟吡拉嗪(Trifluoperazine, Tri)处理的人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)胞浆钙瞬态变化。结果发现：1 nmol/L OA抑制PP-2A时，胞浆游离Ca2+浓度([Ca2+]i)瞬时波动明显增强，[Ca2+]i 在20 min内逐步轻微升高，后逐渐回复; 而用100 nmol/L OA同时抑制PP-2A和PP-1时，则引起[Ca2+]i 即刻持续升高，并同时伴有[Ca2+]i 瞬时波动明显增强；用100 μmol/L Tri抑制PP-2B时，则引起[Ca2+]i 即刻持续升高，[Ca2+]i 瞬时波动没有明显变化。提示：蛋白磷酸酶降低可能通过钙瞬态变化而参与Alzheimer病(AD)的发病过程。
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Effects of Protein Phosphatase Inhibitor on Calcium Transient in Neuroblastoma Cells
Xia Ruohan, Liu Shengyuan，Wang Jianzhi
Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract The effects of protein phosphatase PP-2A and PP-1 inhibitor-okadaic acid (OA) and PP-2B(calcineurin) inhibitor-trifluoperazine (Tri) on calcium transient in neuroblastoma cells (SH-SY5Y) were investigated under the fluorescence inverted microscopy. The results indicated that the [Ca2+]i was slightly increased in 20 min and then gradually returned to baseline level by incubating with 1 nmol/L OA which inhibited only PP-2A. However, a rapid and steady increase of [Ca2+]i was observed both when PP-2A and PP-1 were inhibited by 100 nmol/L OA or when PP-2B by 100 μmol/L Tri. Moreover, OA both with 1 nmol/L and 100 nmol/L could enhance instantaneous calcium fluctuation. The data suggested that an impaired protein phosphatase system might paticipate in AD pathogenesis by an alternative calcium transient pathway.
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Key words protein phosphatase; neuroblastoma; calcium transient
神经细胞内神经原纤维缠结(NFT)是Alzheimer病(AD)特征性脑病理改变之一。应用电子显微镜和免疫生化技术研究结果表明，NFT的主要成分是异常磷酸化和异常糖基化的微管相关蛋白tau 聚集而成的双螺旋丝(PHF)结构[1,2]，tau 蛋白的异常磷酸化可能与蛋白激酶和蛋白磷酸酶系统调节失衡有关[3]。大量研究证明蛋白磷酸酶的降低直接参与AD 的发病过程[4,5]。Ca2+是介导神经细胞信号传导的重要第二信使之一，钙瞬态(calcium transient)是指胞浆游离钙离子浓度([Ca2+]i)的瞬时升高与回降，它是调节神经递质的释放和神经元的兴奋性的中心环节，还与神经元内蛋白质磷酸化等神经原代谢活动有关。本研究用磷酸酶抑制剂复制AD样蛋白磷酸酶降低的细胞模型，并探讨磷酸酶降低与钙瞬态的变化的关系，以期为AD发病机制提供理论依据 。
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1 材料与方法
1.1 培养液、试剂和药品
培养基DMEM/F12 、胎牛血清(FBS)、Okadaic Acid(OA)均购自Gibco公司，Fura-2/AM 、三氟吡拉嗪(trifluoperazine,Tri)、HEPES购自Sigma公司。
1.2 细胞培养
人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)贴壁生长细胞株由June L.Biedler(Sloan Kettering Institute, NY, USA)提供。细胞用含50 ml/L FBS、青霉素10万U/L和链霉素0.1 g/L的DMEM/F12培养基在37 ℃、5% CO2条件下进行培养,定期换置。待细胞80%融合，用滴管轻轻吹打，悬起细胞，以1×105/ml密度接种于放置有L-多聚赖氨酸预处理的盖玻片小培养皿中培养24 h，更换无血清DMEM/F12培养基准备用于实验。
, 百拇医药
1. 3 Fura-2负载
在实验细胞的培养基中加入Fura-2/AM应用液，使终浓度为5 μmol/L,37 ℃孵育40 min。负载后用测Ca2+缓冲液将生长有细胞的小盖玻片漂洗3次。测Ca2+缓冲液组成成分(nmol/L)：NaCl 145, KCl 5.0, CaCl2 1.3, Na2HPO4 1.0, HEPES 10,glucose 10, pH 7.4。
1.4 单个细胞胞浆游离钙测定
参照文献[6]的方法，将负载好的小盖玻片放入37 ℃含0.5 ml测[Ca2+]i缓冲液的特制平皿中，在荧光倒置显微镜系统上检测荧光强度。该系统主要由一个Zeiss倒置显微镜Axiovert 100和MacQudra 650计算机(TILL Photonics制造)控制提供340 nm或380 nm激发光的monochromator组成，荧光信号通过photomultiplier收集并转化为电压信号值记录入光盘。以公式 [Ca2+]i=Keff(R-R0)/(R-Ri)为基础，用HEKA公司的X-CHART软件计算出[Ca2+]i值并绘制[Ca2+]i变化图。式中Keff、Ri、R0均为固定值，R为荧光比值F340/F380。细胞先记录正常水平约2 min后分别向平皿中加入不同的蛋白磷酸酶抑制剂(1 nmol/L OA,100 nmol/L OA,100 μmol/L Tri)，再连续观测约0.5 h。实验重复10次，统计处理采用加药前后数据配对t检验，本文图所显示结果为重复实验的代表性资料。
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2 实验结果
2.1 OA对[Ca2+]i的影响
不同的细胞正常[Ca2+]i值差别很大,我们测得正常[Ca2+]i的平均值一般都在80～200 nmol/L之内，[Ca2+]i在没有任何刺激因素作用下可以较长时间内稳定地在一个正常值附近波动(附图A)；用1 nmol/L OA处理细胞(单纯抑制PP-2A)可使 [Ca2+]i瞬时波动从(41.3±9.4) nmol/L增强至(64.8±13.2) nmol/L(P<0.05)，[Ca2+]i 值均在20 min内从(152.6±45.3) nmol/L轻度升高至一小峰值(209.2±60.7) nmol/L(P<0.05),后逐渐回复(附图B)；当用100 nmol/L OA同时抑制PP-2A和PP-1可引起[Ca2+]i从正常值(148.3±44.7) nmol/L很快持续升高，30 min时达(296.3±73.2) nmol/L(P<0.01)，并且[Ca2+]i瞬时波动从(39.5±8.3) nmol/L增强至(67.2±12.9) nmol/L(P<0.05)(附图C)。
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2.2 Tri对[Ca2+]i的影响
100 μmol/L Tri抑制PP-2B，[Ca2+]i从正常值(155.6±50.4) nmol/L很快持续升高，30 min时达(280.3±84.5) nmol/L(P<0.01),但并不改变[Ca2+]i瞬时波动(P>0.05)(附图D)。
附图 岗田酸(OA)和氟吡拉嗪(Tri)对成神经细胞瘤细胞钙瞬态的影响
A：正常钙变化；B：1 nmol/L OA引起钙变化；C：100 nmol/L OA引起钙变化；D：100 μmol/L Tri引起钙变化
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3 讨论
根据AD患者脑组织抽提液中tau蛋白磷酸酶活性比对照者低[4]，以及PP-2A、PP-1和PP-2B可在体外使tau蛋白特定位点去磷酸化的研究结果[7]，推测AD患者tau蛋白的异常磷酸化与上述蛋白磷酸酶的降低有关。因此，通过抑制PP-2A、PP-1和PP-2B来复制AD神经原纤维变性实验模型具有重要意义。根据厂家说明书提供的研究资料，抑制PP-2A和PP-1所需OA浓度分别为1 nmol/L和100 nmol/L，此外，Gong等用纯化的AD 易溶型异常磷酸化的tau 蛋白作底物，完全抑制PP-2B所需Tri的浓度为100 μmol/L[5]，因此，上述浓度分别作为我们选用OA和Tri实验剂量的依据。本研究结果表明：抑制蛋白磷酸酶PP-1和PP-2B 均可导致SH-SY5Y细胞[Ca2+]i 显著升高；单纯抑制PP-2A与同时抑制PP-2A和PP-1 均可引起[Ca2+]i 瞬时波动明显增强。结果提示：AD患者神经细胞多种蛋白磷酸酶降低可能通过钙稳态失衡而导致其神经原纤维变性。
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神经元把细胞内Ca2+浓度的快速升高和降低(瞬态)作为调节信息来完成信号转导过程[8]，细胞膜内外的Ca2+ 浓度梯度的维持主要依赖细胞膜表面的两种蛋白，即Na+-Ca2+ 交换蛋白和ATP驱动的质膜钙泵。此外，内质网ATP-依赖钙泵把钙浓集入内质网内作为细胞内钙储库。胞内钙浓度增高可由外钙内流和储钙释放引起。我们实验中通过抑制PP-2A、PP-1和PP-2B而引起[Ca2+]i 很快升高的机制尚需更深入的研究加以阐明。
* 国家教委优秀年轻教师基金资助项目
作者简介:夏若寒，男，1968年生，讲师
参考文献
1 Wang J Z, Gong C X, Zaidi T et al. Dephosphorylation of Alzheimer paired helical filaments by PP-2A and PP-2B. J Biol Chem, 1995，270:485
, 百拇医药
2 Wang J Z, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Glycosylation of microtuble associated protein tau: an abnormal posttanslational modification in Alzheimer disease. Nature Med,1996，2:871
3 Iqbal K, Gong C X, Wang J Z et al. Tau phosphatases in brain microtubule associated proteins: Modifications and diseases. New York: Harwood Academic Publishers, 1997.95～111
4 Gong C X, Shaikh S, Wang J Z et al. Phosphatase activity towards abnormally phosphorylated tau: decrease in Alzheimer disease brain. J Neurochem, 1995,65:732
, http://www.100md.com
5 Gong C X, Shaikh S, Grundke-Iqbal I et al. Inhibition of PP-2B(calcineurin) activity towards Alzheimer abnormally phosphorylated tau by neuroleptics. Brain Res, 1996,741:95
6 Xu T, Liu N J. Simultaneous measurement of membrane ion channel currents and intracellular free calcium concentration. J Wuhan Univ(Natural Science Edition), 1995,2:24
7 Wang J Z, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Dephosphorylation of Alzheimer soluble abnormally phosphorylated tau by PP-2A, PP-2B and PP-1. Mol Brain Res, 1996,38:200
8 陈宜张. 分子神经生物学. 北京：人民军医出版社,1995.201～208
(1998-12-21 收稿), 百拇医药