日本血吸虫DNA疫苗的构建及其保护性免疫的研究*
作者：石佑恩 谢来平 李传明 韩家俊
单位：同济医科大学基础医学院寄生虫学教研室，武汉 430030 石佑恩 谢来平 李传明 韩家俊
关键词：日本血吸虫；DNA疫苗；保护免疫
同济医科大学学报990303 摘要 为探讨血吸虫DNA疫苗保护性免疫效果,首先构建、鉴定和表达日本血吸虫DNA疫苗(pCD-Sj32)。实验结果表明:pCD-Sj32免疫BALB/C小鼠能诱导产生抗日本血吸虫感染免疫力, 减虫率为 35.6%～44.4%, 减卵率为39.4%～69.0%;100 μg DNA一次肌肉注射,免疫后8周攻击感染组的效果好;CD8+T淋巴细胞、IL-2、TNF和INF- γ可能在血吸虫病免疫功能调控中起重要作用;pCD-Sj32能诱导宿主产生高滴度特异性抗体, 并在体外能介导巨噬细胞产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)免疫效应。结果提示,pCD-Sj32 有可能发展为新的预防血吸虫病的亚单位疫苗。
, http://www.100md.com
Studies on the DNA Vaccine(pCD-Sj32) and Its Efficacy of
Protective Immunity
Shi Youen, Xie Laiping, Li Chuanming et al
Department of Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract To study the protective immunity afforded by murine immunization with DNA vaccine of Schistosoma japonicum as measured by reduction in worm burden and host antibody, cytokines, DNA vaccine pCD-Sj32 was constructed,identified and expressed. Animal experiment results showed that pCD- Sj32 can induce substantial protective immunity against infection of S. japonicum in BALB/c mice.The worm reduction rate and egg reduction rate in the liver of mice were from 35.6% to 44.4% and from 39.4% to 69.0% respectively.The best efficacy can be produced with once injection of 100 μg DNA into the quadriceps muscle, combined with challenge 8 weeks after immunization. T lymphocyte subsets of CD+8, IL-2. TNF and INF-γ in the experimental animals could play important roles in regulating immune functions of schistosomiasis. High titre of specific antibody IgG could be induced by vaccinated with pCD- Sj32, and the antibody could mediate macrophage to produce ADCC effects in vitro. The results suggested that pCD-Sj32 may represent a new approach to develop subunit vaccine.
, 百拇医药
Key words Schistosoma japonicum; DNA vaccine; protective immunity
血吸虫病是一种严重危害人类及家畜的寄生虫病,据WHO资料(1990)估计患病人数达2亿,每年死亡人数约20万, 血吸虫病仍然是发展中国家包括中国的主要公共卫生问题。目前有效、安全治疗血吸虫病的药物是吡喹酮,但是,化疗能降低感染率和发病率,但不能阻断传播[1]。新近趋向于发展血吸虫病疫苗, 有可能作为控制血吸虫有效措施之一。在多种感染疾病的动物实验中DNA 疫苗显示了保护性[2],为了探索血吸虫DNA疫苗的免疫效果,Sj32cDNA被构建和克隆到真核表达载体,然后免疫实验动物,本文报道了pCD-Sj32疫苗的研究及其免疫效果。
1 材料与方法
1.1 DNA疫苗(pCD-Sj32)的构建、鉴定和表达的测定
, http://www.100md.com
从日本血吸虫成虫分离总RNA,采用逆转录酶合成cDNA第一链[3],设计合成一对引物, 根据Merckelbach等报道 [4] 的核苷酸序列, 设计并合成一对引物如下。
P1:5'-CTCGGATCCAAGAGAAATAATCTTTTATTC-3'
P2:5'-CGCTCTAGAGAATTATTTTAACTTAACCGCA- 3'
在这对引物的 5' 端分别设有BamHI和Xbal酶切位点。扩增Sj32cDNA,重组DNA pBluescript-Sj32(pSj32),通过酶切分析、PCR扩增和核苷酸序列测定进行鉴定,Sj32cDNA亚克隆到pCDDNA构建真核表达载体pCD-Sj32。
进一步鉴定后,将pCD-Sj32直接注射到BALB/C 小鼠的股四头肌和尾根部皮内,免疫2周后用抗Sj31/32单抗的IFA方法测定Sj32的表达。
, 百拇医药
1.2 动物免疫的保护效果观察
首次实验,pCD-Sj32 100 μg或200 μg直接肌肉注射,每隔2周1次,共3 次。对照组注射等体积PBS或空载体。末次免疫后4周,以日本血吸虫尾蚴(40±2)条攻击感染每只BALB/C小鼠,同时设未免疫小鼠作对照组,攻击感染后6 周剖杀免疫组和对照组小鼠,检测减虫率和减卵率。
第2次实验,为了探讨pCD-Sj32对小鼠保护性的影响因素,以不同免疫次数、不同免疫和末次免疫后不同攻击时间为主要参数,进行动物实验。
1.3 测定实验动物的T细胞亚群及细胞因子
以pCD-Sj32 100 μg或200 μg直接注射BALB/C小鼠肌肉。B组、C 组为试验组。A组为对照组,注射等体积PBS或空载体。6周后剖杀小鼠, 分离脾脏制备脾细胞,应用FACSort流式细胞仪(BD公司)测定CD4+/CD+8细胞。同时,用血吸虫抗原31/32 kD(30.8/31.7 ku)和非特异的丝裂原(ConA或PHA)刺激脾细胞,诱生IL-2、TNF和INF-γ细胞因子,然后采用依赖细胞株方法测定上述细胞因子的活性和含量。
, http://www.100md.com
1.4 血清抗体动态观察及免疫血清介导的细胞毒性试验
免疫组和对照组小鼠每4周采血1次,持续至28周,分离血清, 冻存备用。采用ELISA方法测定特异性抗体IgG。 按常规方法从免疫小鼠腹腔收集巨噬细胞,制备血吸虫童虫,体外进行抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验[5]。
2 结果
2.1 DNA疫苗pCD-Sj32的构建、鉴定和表达
重组体pCD-Sj32构建并经酶切鉴定(图1,2)说明pCD-Sj32构建成功。 采用抗血吸虫31/32单抗的IFA法检测Sj32的表达,结果表明,在肌细胞、表皮角质细胞和成纤维细胞均能表达Sj32, 在肌细胞中表达的蛋白不仅位于细胞浆中而且可结合到细胞膜或者分泌到肌细胞外。
, http://www.100md.com
图1 重组DNA疫苗pCD-Sj32
图2 重组体pCD-Sj32限制性酶切鉴定
1. HandⅢ和EcoRⅠ双酶切; 2,3. BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切; 4. BamHⅠ和XbaⅠ双酶切; M. DNA分子标准参照物(bp); P. BamHⅠ和 XbaⅠ 酶切的 PCR 扩增的目的基因(1305 bp); 5. BamHⅠ和XbaⅠ酶切的pCD质粒; 6. Hand Ⅲ单酶切的pCD质粒
2.2 DNA疫苗免疫保护
首次试验, 以DNA质粒100 μg或200 μg免疫小鼠, 减虫率分别为52.44% 和36.47%,肝脏减卵率分别为54.2%和57.7%。为了进一步探讨DNA疫苗pCD-Sj32对小鼠保护性免疫力的影响因素,进行动物实验,结果见表1。统计学结果证实,各实验组的减虫率和肝脏减卵率与对照组相比均有显著性差异(均为P<0.01), 肌肉注射与皮内注射,1次与3次注射相比各实验组之间无显著性差异(P>0.05),D组与其它各实验组相比较有显著性差异(P<0.05), D组免疫方式可诱导最佳的保护免疫效果。
, 百拇医药
2.3 小鼠脾脏T细胞亚群和细胞因子检测结果
从表2可见,B、C两免疫组CD+8百分率明显高于对照组(P<0.01),而CD+4无显著性差异(P>0.05)。细胞因子检测结果表明,免疫组脾细胞诱生的IL-2 生物学活性,TNF细胞毒效应和IFN-γ水平,在ConA和31/32 kD 蛋白刺激下较对照组明显增高,免疫组IL-2分别为321.7和150.6 U/ml;TNF分别为72.7%和 36.8%;INF-γ分别为1435.6和371.3 pg/ml。而对照组IL-2分别为117.3和87.4 U/ml;TNF分别为24.7%和13.6%;INF-γ分别为666.1和50.0 pg/ml。经统计学比较有显著性差异(P<0.01)。pCD-Sj32 100 μg组与200 μg 注射组无显著性差异。
表1 pCDSj32 DNA疫苗免疫小鼠攻击感染后检获成虫数和每g肝组织虫卵数 组别
, 百拇医药
n
免 疫
末次免疫
后攻击时间
(周)
检获成虫数
(
±s)
减虫率
%
每g肝组织
虫卵数
(±s)
, 百拇医药
减卵率
(%)
部位
次数
对照组
10
26.40±3.37
32 640
±2 305
A
8
股四头肌
3
, 百拇医药
4
16.62±6.19
37.03*
14 937
±2 216
54.24*
B
10
股四头肌
1
4
17.00±3.86
, 百拇医药
35.61*
19 700
±2 388
39.64*
C
8
股四头肌
3
8
16.62±2.00
37.03*
17 450
, 百拇医药
±2 611
46.54*
D
6
股四头肌
1
8
14.67±4.37
44.44*
10 100
±400
69.06*
, 百拇医药
E
8
皮内
1
4
16.29±5.06
38.30*
14 357
±2 113
56.01*
与对照组比较 * P<0.01
2.4 小鼠血清抗体动态观察及ADCC效应
, 百拇医药
100 μg pCD-Sj32一次免疫后4周血清IgG抗体滴度即可达1∶320, 8周以后持续稳定在1∶640以上并持续到免疫后24周, 其中最高滴度可达1∶1280。证实pCD-Sj32 质粒免疫小鼠后血清可介导小鼠腹腔巨噬细胞产生很强体外杀伤血吸虫童虫作用(图3),而正常小鼠血清组未见明显的童虫表皮损伤(图4)。
图3 100 μg pCD-Sj32免疫小鼠血清IgG
抗体介导巨噬细胞体外杀伤血吸虫童虫作用 ×200
图4 正常小鼠血清对照的ADCC效应 ×200
表2 各组小鼠脾脏T细胞亚群CD+4、CD+8测定结果 组别
, 百拇医药
小鼠数
T细胞亚群(%)(±s)
CD+4/CD+8
比值
CD+4
CD+8
A
7
32.12
, 百拇医药 ±9.85
22.57
±7.56
1.42
B
8
36.38
±11.52
41.77
±19.12*
0.87
C
8
, 百拇医药
35.64
±9.24
38.41
±12.23*
0.93
与A组(对照组)比较 * P<0.013 讨论
血吸虫裸露DNA疫苗的研究在国外已有初步报道,我们将编码日本血吸虫成虫32 kD(31.7 ku)蛋白的cDNA插入真核表达载体pCD。 经动物实验获得了较好的保护性免疫效果。DNA疫苗具有亚单位疫苗和活疫苗的优点,而且造价低廉, 易于制备和纯化,其化学和生物学性质稳定,不需冷藏,便于贮存和运输,来源不受限制。尽管DNA疫苗尚存在安全问题,即外源DNA整合入体细胞基因组,并可导致细胞恶性转化及诱导抗DNA免疫引发自身免疫疾病的可能,有实验证明质粒直接注射未发现整合,以及常规DNA疫苗诱生的自身抗体不足以导致活动性自身免疫病[6],说明其不愧为一种独特的疫苗。
, 百拇医药
从上述实验研究的结果可以初步得出以下结论：①成功构建了重组 DNApCD-Sj32;②pCD-Sj32免疫注射后可在小鼠骨骼肌细胞、 皮内角质形成细胞、朗汉斯巨细胞、成纤维细胞等细胞质内表达Sj32 kD蛋白分子,表达产物具有免疫原性;③不同免疫剂量、不同免疫次数、不同注射部位、 末次免疫后不同攻击时间等多种免疫方式保护性试验表明, 均能取得较好的抗血吸虫攻击感染的免疫力,并具有一定抗虫卵所致肝脏的病理损害作用,其中100 μg的pCD-Sj32股四头肌一次注射,免疫后8周攻击感染组的保护效果优于其它各组;④T细胞CD+4/CD+8亚群、细胞因子IL-2、TNF、IFN-γ在血吸虫感染中发挥重要的免疫调控作用;⑤pCD-Sj32免疫可诱导产生高滴度的特异IgG抗体,且持续时间长达26周, 并在体外介导小鼠腹腔巨噬细胞产生杀伤血吸虫童虫的 ADCC效应。实验结果表明:血吸虫DNA疫苗(pCD-Sj32)有可能发展新的亚单位疫苗预防血吸虫病,值得进一步研究。
, 百拇医药
*卫生部总理基金资助项目(No,94-Y-19)
作者简介:石佑恩,男,1935年生,教授
参考文献
1 Shi Y E, Jiang C E, Han J J et al. Schistosoma japonicum: An ultraviolet-attenuated cercariae vaccine appliable in the field for water buffaloes. Exp Parasitol, 1990,71:100
2 Simmods R S, Shearr M H, Kennedy R C. DNA vaccines-from principle to practice. Parasitology Today, 1997,13:328
, 百拇医药
3 Merckelbach A, Hasse S, Dell R et al. cDNA sequences of Schistosoma japonicum coding for two cathepsin B-like protenis and Sj32. Trop Med Parasitol, 1994,45:194
4 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-cholorfrom extraction. Anal Biochem, 1987,162:156
5 Vadas M A. A new method for the purification of human eosinophils and neutrophils, and a comparison of the ability of these cells to damage schistosomula of Schistosoma mansoni. J Immunol, 1979,122:1228
6 Mor G. Do DNA vaccines induce autoimmune disease?. Hum Gene Ther, 1997,8:293
(1998-12-14 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学基础医学院寄生虫学教研室，武汉 430030 石佑恩 谢来平 李传明 韩家俊
关键词：日本血吸虫；DNA疫苗；保护免疫
同济医科大学学报990303 摘要 为探讨血吸虫DNA疫苗保护性免疫效果,首先构建、鉴定和表达日本血吸虫DNA疫苗(pCD-Sj32)。实验结果表明:pCD-Sj32免疫BALB/C小鼠能诱导产生抗日本血吸虫感染免疫力, 减虫率为 35.6%～44.4%, 减卵率为39.4%～69.0%;100 μg DNA一次肌肉注射,免疫后8周攻击感染组的效果好;CD8+T淋巴细胞、IL-2、TNF和INF- γ可能在血吸虫病免疫功能调控中起重要作用;pCD-Sj32能诱导宿主产生高滴度特异性抗体, 并在体外能介导巨噬细胞产生抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)免疫效应。结果提示,pCD-Sj32 有可能发展为新的预防血吸虫病的亚单位疫苗。
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Studies on the DNA Vaccine(pCD-Sj32) and Its Efficacy of
Protective Immunity
Shi Youen, Xie Laiping, Li Chuanming et al
Department of Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract To study the protective immunity afforded by murine immunization with DNA vaccine of Schistosoma japonicum as measured by reduction in worm burden and host antibody, cytokines, DNA vaccine pCD-Sj32 was constructed,identified and expressed. Animal experiment results showed that pCD- Sj32 can induce substantial protective immunity against infection of S. japonicum in BALB/c mice.The worm reduction rate and egg reduction rate in the liver of mice were from 35.6% to 44.4% and from 39.4% to 69.0% respectively.The best efficacy can be produced with once injection of 100 μg DNA into the quadriceps muscle, combined with challenge 8 weeks after immunization. T lymphocyte subsets of CD+8, IL-2. TNF and INF-γ in the experimental animals could play important roles in regulating immune functions of schistosomiasis. High titre of specific antibody IgG could be induced by vaccinated with pCD- Sj32, and the antibody could mediate macrophage to produce ADCC effects in vitro. The results suggested that pCD-Sj32 may represent a new approach to develop subunit vaccine.
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Key words Schistosoma japonicum; DNA vaccine; protective immunity
血吸虫病是一种严重危害人类及家畜的寄生虫病,据WHO资料(1990)估计患病人数达2亿,每年死亡人数约20万, 血吸虫病仍然是发展中国家包括中国的主要公共卫生问题。目前有效、安全治疗血吸虫病的药物是吡喹酮,但是,化疗能降低感染率和发病率,但不能阻断传播[1]。新近趋向于发展血吸虫病疫苗, 有可能作为控制血吸虫有效措施之一。在多种感染疾病的动物实验中DNA 疫苗显示了保护性[2],为了探索血吸虫DNA疫苗的免疫效果,Sj32cDNA被构建和克隆到真核表达载体,然后免疫实验动物,本文报道了pCD-Sj32疫苗的研究及其免疫效果。
1 材料与方法
1.1 DNA疫苗(pCD-Sj32)的构建、鉴定和表达的测定
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从日本血吸虫成虫分离总RNA,采用逆转录酶合成cDNA第一链[3],设计合成一对引物, 根据Merckelbach等报道 [4] 的核苷酸序列, 设计并合成一对引物如下。
P1:5'-CTCGGATCCAAGAGAAATAATCTTTTATTC-3'
P2:5'-CGCTCTAGAGAATTATTTTAACTTAACCGCA- 3'
在这对引物的 5' 端分别设有BamHI和Xbal酶切位点。扩增Sj32cDNA,重组DNA pBluescript-Sj32(pSj32),通过酶切分析、PCR扩增和核苷酸序列测定进行鉴定,Sj32cDNA亚克隆到pCDDNA构建真核表达载体pCD-Sj32。
进一步鉴定后,将pCD-Sj32直接注射到BALB/C 小鼠的股四头肌和尾根部皮内,免疫2周后用抗Sj31/32单抗的IFA方法测定Sj32的表达。
, 百拇医药
1.2 动物免疫的保护效果观察
首次实验,pCD-Sj32 100 μg或200 μg直接肌肉注射,每隔2周1次,共3 次。对照组注射等体积PBS或空载体。末次免疫后4周,以日本血吸虫尾蚴(40±2)条攻击感染每只BALB/C小鼠,同时设未免疫小鼠作对照组,攻击感染后6 周剖杀免疫组和对照组小鼠,检测减虫率和减卵率。
第2次实验,为了探讨pCD-Sj32对小鼠保护性的影响因素,以不同免疫次数、不同免疫和末次免疫后不同攻击时间为主要参数,进行动物实验。
1.3 测定实验动物的T细胞亚群及细胞因子
以pCD-Sj32 100 μg或200 μg直接注射BALB/C小鼠肌肉。B组、C 组为试验组。A组为对照组,注射等体积PBS或空载体。6周后剖杀小鼠, 分离脾脏制备脾细胞,应用FACSort流式细胞仪(BD公司)测定CD4+/CD+8细胞。同时,用血吸虫抗原31/32 kD(30.8/31.7 ku)和非特异的丝裂原(ConA或PHA)刺激脾细胞,诱生IL-2、TNF和INF-γ细胞因子,然后采用依赖细胞株方法测定上述细胞因子的活性和含量。
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1.4 血清抗体动态观察及免疫血清介导的细胞毒性试验
免疫组和对照组小鼠每4周采血1次,持续至28周,分离血清, 冻存备用。采用ELISA方法测定特异性抗体IgG。 按常规方法从免疫小鼠腹腔收集巨噬细胞,制备血吸虫童虫,体外进行抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验[5]。
2 结果
2.1 DNA疫苗pCD-Sj32的构建、鉴定和表达
重组体pCD-Sj32构建并经酶切鉴定(图1,2)说明pCD-Sj32构建成功。 采用抗血吸虫31/32单抗的IFA法检测Sj32的表达,结果表明,在肌细胞、表皮角质细胞和成纤维细胞均能表达Sj32, 在肌细胞中表达的蛋白不仅位于细胞浆中而且可结合到细胞膜或者分泌到肌细胞外。
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图1 重组DNA疫苗pCD-Sj32
图2 重组体pCD-Sj32限制性酶切鉴定
1. HandⅢ和EcoRⅠ双酶切; 2,3. BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切; 4. BamHⅠ和XbaⅠ双酶切; M. DNA分子标准参照物(bp); P. BamHⅠ和 XbaⅠ 酶切的 PCR 扩增的目的基因(1305 bp); 5. BamHⅠ和XbaⅠ酶切的pCD质粒; 6. Hand Ⅲ单酶切的pCD质粒
2.2 DNA疫苗免疫保护
首次试验, 以DNA质粒100 μg或200 μg免疫小鼠, 减虫率分别为52.44% 和36.47%,肝脏减卵率分别为54.2%和57.7%。为了进一步探讨DNA疫苗pCD-Sj32对小鼠保护性免疫力的影响因素,进行动物实验,结果见表1。统计学结果证实,各实验组的减虫率和肝脏减卵率与对照组相比均有显著性差异(均为P<0.01), 肌肉注射与皮内注射,1次与3次注射相比各实验组之间无显著性差异(P>0.05),D组与其它各实验组相比较有显著性差异(P<0.05), D组免疫方式可诱导最佳的保护免疫效果。
, 百拇医药
2.3 小鼠脾脏T细胞亚群和细胞因子检测结果
从表2可见,B、C两免疫组CD+8百分率明显高于对照组(P<0.01),而CD+4无显著性差异(P>0.05)。细胞因子检测结果表明,免疫组脾细胞诱生的IL-2 生物学活性,TNF细胞毒效应和IFN-γ水平,在ConA和31/32 kD 蛋白刺激下较对照组明显增高,免疫组IL-2分别为321.7和150.6 U/ml;TNF分别为72.7%和 36.8%;INF-γ分别为1435.6和371.3 pg/ml。而对照组IL-2分别为117.3和87.4 U/ml;TNF分别为24.7%和13.6%;INF-γ分别为666.1和50.0 pg/ml。经统计学比较有显著性差异(P<0.01)。pCD-Sj32 100 μg组与200 μg 注射组无显著性差异。
表1 pCDSj32 DNA疫苗免疫小鼠攻击感染后检获成虫数和每g肝组织虫卵数 组别
, 百拇医药
n
免 疫
末次免疫
后攻击时间
(周)
检获成虫数
(
±s)减虫率
%
每g肝组织
虫卵数
(
±s), 百拇医药
减卵率
(%)
部位
次数
对照组
10
26.40±3.37
32 640
±2 305
A
8
股四头肌
3
, 百拇医药
4
16.62±6.19
37.03*
14 937
±2 216
54.24*
B
10
股四头肌
1
4
17.00±3.86
, 百拇医药
35.61*
19 700
±2 388
39.64*
C
8
股四头肌
3
8
16.62±2.00
37.03*
17 450
, 百拇医药
±2 611
46.54*
D
6
股四头肌
1
8
14.67±4.37
44.44*
10 100
±400
69.06*
, 百拇医药
E
8
皮内
1
4
16.29±5.06
38.30*
14 357
±2 113
56.01*
与对照组比较 * P<0.01
2.4 小鼠血清抗体动态观察及ADCC效应
, 百拇医药
100 μg pCD-Sj32一次免疫后4周血清IgG抗体滴度即可达1∶320, 8周以后持续稳定在1∶640以上并持续到免疫后24周, 其中最高滴度可达1∶1280。证实pCD-Sj32 质粒免疫小鼠后血清可介导小鼠腹腔巨噬细胞产生很强体外杀伤血吸虫童虫作用(图3),而正常小鼠血清组未见明显的童虫表皮损伤(图4)。
图3 100 μg pCD-Sj32免疫小鼠血清IgG
抗体介导巨噬细胞体外杀伤血吸虫童虫作用 ×200
图4 正常小鼠血清对照的ADCC效应 ×200
表2 各组小鼠脾脏T细胞亚群CD+4、CD+8测定结果 组别
, 百拇医药
小鼠数
T细胞亚群(%)(
±s)CD+4/CD+8
比值
CD+4
CD+8
A
7
32.12
, 百拇医药 ±9.85
22.57
±7.56
1.42
B
8
36.38
±11.52
41.77
±19.12*
0.87
C
8
, 百拇医药
35.64
±9.24
38.41
±12.23*
0.93
与A组(对照组)比较 * P<0.013 讨论
血吸虫裸露DNA疫苗的研究在国外已有初步报道,我们将编码日本血吸虫成虫32 kD(31.7 ku)蛋白的cDNA插入真核表达载体pCD。 经动物实验获得了较好的保护性免疫效果。DNA疫苗具有亚单位疫苗和活疫苗的优点,而且造价低廉, 易于制备和纯化,其化学和生物学性质稳定,不需冷藏,便于贮存和运输,来源不受限制。尽管DNA疫苗尚存在安全问题,即外源DNA整合入体细胞基因组,并可导致细胞恶性转化及诱导抗DNA免疫引发自身免疫疾病的可能,有实验证明质粒直接注射未发现整合,以及常规DNA疫苗诱生的自身抗体不足以导致活动性自身免疫病[6],说明其不愧为一种独特的疫苗。
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从上述实验研究的结果可以初步得出以下结论：①成功构建了重组 DNApCD-Sj32;②pCD-Sj32免疫注射后可在小鼠骨骼肌细胞、 皮内角质形成细胞、朗汉斯巨细胞、成纤维细胞等细胞质内表达Sj32 kD蛋白分子,表达产物具有免疫原性;③不同免疫剂量、不同免疫次数、不同注射部位、 末次免疫后不同攻击时间等多种免疫方式保护性试验表明, 均能取得较好的抗血吸虫攻击感染的免疫力,并具有一定抗虫卵所致肝脏的病理损害作用,其中100 μg的pCD-Sj32股四头肌一次注射,免疫后8周攻击感染组的保护效果优于其它各组;④T细胞CD+4/CD+8亚群、细胞因子IL-2、TNF、IFN-γ在血吸虫感染中发挥重要的免疫调控作用;⑤pCD-Sj32免疫可诱导产生高滴度的特异IgG抗体,且持续时间长达26周, 并在体外介导小鼠腹腔巨噬细胞产生杀伤血吸虫童虫的 ADCC效应。实验结果表明:血吸虫DNA疫苗(pCD-Sj32)有可能发展新的亚单位疫苗预防血吸虫病,值得进一步研究。
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*卫生部总理基金资助项目(No,94-Y-19)
作者简介:石佑恩,男,1935年生,教授
参考文献
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(1998-12-14 收稿), http://www.100md.com